MiRNA-25下调ATXN3基因的表达及对细胞活性的影响

摘要

目的:脊髓小脑性共济失调3型/马查多-约瑟夫病(SCA3/MJD)是最常见的SCA亚型,其致病基因ATXN编码含多聚谷氨酰胺肽链(polyQ)的ataxin-3蛋白,可选择性在小脑等部位积聚形成神经元核内包涵体(NIIs)并引起细胞死亡.MiRNA是一类广泛存在于高等真核细胞中的非编码小分子RNA,它在SCA3/MJD发病机制中的作用尚不清楚.本研究旨在探讨在前期研究中应用miRNA芯片筛选出来的在患者血清差异表达的miRNA-25对ATXN3基因表达的调控作用及其对细胞活性的影响.方法:应用转基因技术转染HEK293T细胞系及SH-SY5Y细胞系;应用qRT-PCR技术检测miRNA-25对细胞内mRNA表达水平的影响;应用Western Blot技术检测miRNA-25对细胞内蛋白表达水平的影响;应用流式细胞技术及四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)观察miRNA-25对SCA/MJD转基因细胞模型的细胞活性的影响;应用免疫荧光技术观察miRNA-25对SCA/MJD转基因细胞模型的核内包涵体形成的影响;应用双荧光素酶检测技术明确miRNA-25的作用机制.结果:qRT-PCR及Western Blot结果发现,在HEK 293T细胞系及SH-SY5Y细胞系中,转染miRNA-25mimics后,miRNA-25组较对照组可以明显抑制内源性野生型ataxin-3蛋白的表达,而对内源性野生型ATXN3 mRNA的表达水平无明显影响,而siATXN3对内源性野生型ataxin-3蛋白及ATXN3 mRNA的表达都有明显抑制作用.在SCA3/MJD细胞模型中,转染miRNA-25 mimics后,miRNA-25较对照组可以明显抑制外源性polyQ扩展突变型ataxin-3蛋白的表达,而对polyQ扩展突变型ATXN3 mRNA的表达水平无明显影响,而siATXN3对外源性polyQ扩展突变型ataxin-3蛋白及polyQ扩展突变型ATXN3 mRNA的表达都有明显抑制作用.流式细胞术及MTT结果发现,在SCA3/MJD转基因细胞模型中,miRNA-25较对照组可以明显提高细胞活性,降低早期凋亡率,其效果与siATXN3类似.免疫荧光结果发现,在SCA3/MJD转基因细胞模型中,miRNA-25较对照组的核内包涵体阳性细胞出现率明显降低,其结果与siATXN3类似.双荧光素酶检测结果发现,在HEK293T细胞系中,miRNA-25通过与ATXN3 mRNA的3'UTR特异性结合而发挥作用.结论:miRNA-25可下调ATXN基因的表达并影响SCA3/MJD转基因细胞模型的细胞活性,从而参与调控SCA3/MJD的发病机制,该研究为阐明SCA3的分子发病机制及治疗研究提供了崭新的线索。