广西巴马小型猪Glut4基因克隆和真核表达研究

摘要

葡萄糖转运蛋白4(Glut4)介导的葡萄糖转运是肌糖代谢的主要限速步骤.本研究旨在克隆广西巴马小型猪Glut4基因,构建真核表达载体,转染细胞研究Glut4功能.以广西巴马小型猪背最长肌组织作为实验材料,通过RT-PCR技术扩增出Glut4基因编码序列,连接入PMD18－T克隆载体,测序鉴定正确后提取克隆质粒.用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶双酶切克隆质粒,获得Glut4片段,连接至pEGFP-N1载体上,构建真核表达载体pEGFP-N1-Glut4,鉴定正确后,提取pEGFP－N1－Glut4重组质粒转染至C2C12细胞,观察细胞荧光表达情况,并检测转染24h和48h时培养液的葡萄糖浓度.实验结果表明:广西巴马小型猪Glut4基因编码区序列长1530bp,编码509个氨基酸,与参考序列(序列号为EU590115.1)的同源性为99.7％;重组质粒转染C2C12细胞能表现出绿色荧光,转染24h和48h时,细胞培养液中葡萄糖浓度均显著低于空载体转染组(16.08±0.49vs.17.13±0.13,4.93±0.19vs.6.28±0.12,P＜0.01).在C2C12成肌细胞中过表达广西巴马小型猪Glut4基因,能增加细胞的葡萄糖摄入量.