文蛤寡肽对非酒精性脂肪肝病模型的修复作用研究

摘要

目的：探讨非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)细胞模型的构建及文蛤寡肽对NAFLD的修复作用. 方法：以软脂酸诱导正常Chang liver细胞,获得NAFLD体外细胞模型;以文蛤内脏为原料,通过酶解、超滤、葡聚糖凝胶层析、HPLC等分离纯化方法得到对NAFLD模型具有修复作用的文蛤寡肽(Meretrix meretrix oligopeptides,MMO);将MMO作用于NAFLD细胞模型,检测其对NAFLD细胞模型的肝功能指标、能量代谢的影响;流式细胞仪检测细胞早期凋亡及线粒体膜电位的变化;Western Blotting检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、JNK、TNF-α等蛋白的表达. 结果：正常Chang liver细胞经15μg/mL的软脂酸诱导48 h后，细胞内的TG含量达到最高，油红O染色显示细胞中可见大量的红色脂滴，且细胞内ALT、AST和lr-GT等含量显著升高。经酶种筛选及正交实验结果，碱性蛋白酶在40℃、pH为9.5、料液比为1:2、酶解时间为8h且加酶量为1000μ/g可使NAFLD细胞模型的TG含量下降率最大。酶解产物经过分离纯化，获得由5个氨基酸组成的MMO，其序列为：Gln-Leu-Asn-Trp-Asp。该MMO可使模型组细胞内的脂滴数量减少，ALT、AST和y-GT等指标的含量显著下降，SOD、GSH-ST等含量有所升高。经MMO作用后，使NAFLD模型组的Na、-K、-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和COX-1的活性明显升高。降低模型组细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率，使细胞的线粒体膜电位下降率增加。上调Bcl-2蛋白的表达，下调促凋亡基因Bax蛋白的表达，抑制Caspase-3、Caspase-9、JNK、TNF-a等蛋白的活化。 结论：应用15μg/mL的软脂酸对Chang liver细胞诱导48 h后可获得理想的NAFLD细胞模型。经碱性蛋白酶酶解得到的MMO可修复NAFLD细胞模型，有望开发出对NAFLD有修复作用的保健食品。