基于沙门菌鞭毛蛋白的H7N9亚型禽流感亚单位疫苗的构建及其免疫应答特性研究

摘要

本研究利用overlap-PCR技术将H7N9亚型禽流感病毒血凝素球状部(HAl-2，aa62-284)基因连接到鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因fliC）的N端，获得目的基因片段HAI-2iQfC(2187bp)，另外还单独扩增了HAl-2片段(669bp)。将它们分别与pCold载体连接、转化，通过大肠杆菌表达系统表达出HAl-2-fliC和HAl-2蛋白。SDS-PAGE结果显示大肠杆菌表达系统能够成功表达出HAl-2-fliC和HAl-2，蛋白大小与预期一致。分别用抗fliC和抗H7N9亚型禽流感病毒的多抗血清对蛋白进行Western blotting分析，结果显示HAl-2-fliC和HAl-2均具有良好的免疫反应性。另外，TLR5生物活性试验显示，HAl-2-fliC能刺激HEK293-mTLR5细胞分泌高水平IL-8，说明HAl-2-fliC具有体外活化TLR5的生物功能，而HAl-2蛋白则不能。以上研究结果表明融合蛋白能正确折叠出HAl-2和fliC两部分的天然构象。将HAl-2和HAl-2-fliC以腹腔注射方式免疫C3H/HeJ小鼠，间隔14和28天进行加强免疫，并设立PBS为阴性对照。在二免、三免12天分别采血，通过ELISA和HAI试验检测小鼠血清中的抗体水平。与HAl-2免疫组相比，HAl-2-fliC诱导出显著且强烈的血清JgG抗体应答，且在小鼠体内维持至少3个月。另外，检测了三免12天小鼠血清中的IgG亚型，结果表明融合蛋白能诱导产生相似水平的IgGl和IgG2a应答，均显著高于HAl-2免疫组，同时能诱导产生高水平的HAI抗体。综上所述，融合蛋白中的鞭毛蛋白能够显著提高HAl-2的免疫原性，促进HAl-2特异的免疫应答，融合蛋白可以成为一种有潜力的H7N9亚型禽流感亚单位疫苗候选株。