HCV聚合酶作用模板及酶浓度对HCV细胞外聚合酶模型的影响

摘要

目的:构建HCV聚合酶基因的重组原核表达质粒后,研究了获得高效表达聚合酶蛋白的最适条件,同时摸索表达产物的纯化方法以及最佳变性和复性条件,研究建立细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型使用的HCV聚合酶作用模板及酶浓度的最佳浓度,为筛选药物创造条件. 方法:使用高保真PfuDNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增,从我国HCVRNA阳性病人血清中扩增出HCVNS5bRNA聚合酶全长基因序列,构建了原核表达载体pET30aNS5b等.选择各种诱导表达条件.进一步利用Ni2+金属离子螯和亲和层析将其纯化,对该酶蛋白的变性和复性条件进行研究.利用DNA-BAND96孔培养板,建立生物素标记检测HCVNS5b聚合酶活性的细胞外分子模型.同时,摸索了聚合酶作用模板以及酶浓度对聚合酶模型的影响的相关条件. 结果:测序及读码框架分析表明得到相关HCVNS5bRNA聚合酶全基因序列,在最佳表达条件下,诱导表达融合蛋白(65kDa),得到了纯度大干92.83﹪的酶蛋白,研究确定了HCV聚合酶作用模板及酶浓度的最佳条件. 结论:HCV聚合酶的高效表达和有效纯化,以及HCV聚合酶作用模板及酶浓度的最佳条件研究,为建立细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型及筛选药物奠定基础.