可回复性肝细胞永生化载体pCTGTKlox的构建、鉴定、转染与表达

摘要

本文构建了包括雌激素受体与重组酶的融合基因Cre-ER、永生化基因SV40T、加强型绿色荧光蛋白与胸苷激酶的融合基因EGFP-TK以及重组位点loxP序列的可回复性永生化逆转录病毒载体,为肝细胞可回复性永生化奠定基础.方法：扩增EGFP及TK并采用重叠延伸拼接(SOE)法连接EGFP和TK,将EGFP-TK融合基因亚克隆至pBABE-puro-lox的SalⅠ和CiaⅠ位点之间,构建成新载体pBGTKlox.连接SV40T与FMDV-2A,回收后用EcoRⅠ和SalⅠ酶切连接至pBGTKlox载体的相应位点,构成的新载体称为pBTGTKlox.连接Cre-ER与FMDV-2,回收后用EcoRⅠ酶切连接至pBTGTKlox的相应位点,构成的新载体称为pCTGTKlox.将纯化的pCTGTKlox和pPDFl5质粒共转染包装细胞PT67,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.扩大培养稳定转染的细胞,免疫组化染色检测SV40T基因的表达.结果：成功拼接EGFP-TK融合基因并克隆入pBABE-puro-lox,构建成新载体pBGTKlox.酶切鉴定证明为重组阳性体,测序验证无密码突变,转染PT67细胞证明EGFP-TK基因得到表达.成功扩增出含FMDV-2A序列的SV40T并克隆入pBOTKlox载体,构成pBTGTKlox.酶切鉴定证明为重组阳性体,经测序验证无编码突变,转染PT67细胞24h后可见细胞发出绿色荧光.成功在Cre-ER基因的3'端加上FMDV-2A序列,并将扩出的Cre-ER2A片段正向克隆入pBTOTKlox,构成新载体pCTGTKlox.EcoRI酶切鉴定证实为重组阳性体,经测序验证无核苷酸突变.pCTGTKlox转染PT67细胞24h后,荧光显微镜下可见散在多处绿色荧光.免疫组化染色显示细胞胞核呈阳性染色.结论：成功将SV40T、Cre及调控基因置于两个LoxP位点之间,构建并表达可回复性永生化逆转录病毒载体pCTGTKlox,为细胞的可回复永生化提供了一种良好的新型载体.