单管RT-PCR方法检测鱼类VHSV、IPNV和IHNV

摘要

病毒性出血性败血症(VHS)、传染性胰脏坏死症(IPN)、鱼传染性造血器官坏死症(IHN)是同被列为<中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录>的二类传染病,这三种病毒病均是由RNA病毒引起的急性高度传染性疾病,可侵害多种海水和淡水养殖鱼类,危害非常严重.本研究对三种病毒病的各种病毒建立了单管法RT-PCR,既一步法检测各种RNA病毒目的基因,在此基础上建立了三种病毒多重PCR检测方法.本研究设计合成3对引物,分别是:ipnf/ipnr扩增IPNV病毒VP2基因的206bp的RNA片段,最高检测灵敏度可达10-1.29(0.512)TCID50/50μl;ihnf/ihnr识别IHNV病毒N基因的371bp的RNA片段,最高检测灵敏度可达100.6(3.98)TCID50/50μl;vhsf/vhsr可以扩增VHSVG基因的625bp的RNA片段,最高检测灵敏度可达101.86(72.4)TCID50/50μl.用三对引物可同时特异性扩增IPNV、IHNV、VHSV三种病毒,彼此之间无干扰反应,最高灵敏度可达1TCID50/50μl、4TCID50/50μl、5TCID50/50μl.单管RT-PCR方法检测IPNV,IHNV和VHSV三种鱼病毒,检测过程约需4.5h,与常规的细胞培养抗体中和试验,或组织样品经细胞培养再分别单独进行逆转录后再扩增需时3-4周进行比较,要节省大量的时间、人力、试剂材料和费用.