Id3-EGFP融合基因表达载体的构建及其在A549细胞中的表达

摘要

分化抑制因子,又称DNA结合抑制因子(inhibitors of differentiation/DNA binding,Id),属于螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)转录因子家族成员之一,分子量约13～20kD,它们主要通过与A类碱性HLH(bHLH)蛋白(如E蛋白)结合而发挥作用,因其本身缺乏DNA结合必需的碱性氨基酸序列,Id蛋白和E蛋白结合形成异二聚体后能够阻止E蛋白之间以及E蛋白和其他bHLH蛋白聚合,对bHLH转录因子活性起负调节作用,从而抑制细胞分化.现已在人和啮齿动物中发现四个Id基因,即Id1,Id2,Id3和Id4.近几年的研究表明,Id蛋白除了具有传统上认为的抑制分化这一功能外,还具有更广泛的细胞生物学功能.Id基因在不同来源及不同发育阶段的细胞中有不同表达模式,同种细胞内不同的Id蛋白作为E蛋白的负调控因子,在细胞发育的多个阶段,发挥着各自不同的功能.由此决定了Id蛋白对细胞周期的调控具有细胞种类和阶段特异性. Id3,作为血清诱导的立即早期基因第一次在小鼠成纤维细胞系中被发现.与Id家族的其他成员一样,Id3的表达在细胞生长和发育过程中呈动态调控状态,Id3的组织细胞表达模式与其他Id基因相似但不完全相同,例如Id1基因和蛋白在多种人体肿瘤(胰腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、宫颈癌、黑色素瘤、前列腺癌、肝细胞癌等)中均呈高表达趋势[8-12],但Id3在不同的肿瘤中的表达却呈现不一致性;Id3在甲状腺癌、卵巢癌中呈下降表达趋势[13];在分化良好的肝癌细胞中的表达要高于分化不良的肝癌细胞,提示Id3在不同组织种类的肿瘤中具有截然不同的表达谱. 为探讨Id3在肿瘤细胞增殖分化调控中的作用,本文在克隆人Id3基因的基础上,构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与Id3的融合基因真核表达载体Id3/EGFP-N1,使Id3-EGFP融合蛋白在人肺癌细胞A549中得到表达。