EGFP-CIDE-3及DsRed 1-CIDE-3融合基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达和定位

摘要

目的:分别构建EGFP、DsRed1与CIDE-3的融合基因真核表达载体,观察其在人胚肾上皮细胞293T中的表达,确定CIDE-3的亚细胞定位. 方法:分别以质粒pEGFP-C3、pDsRed 1-N1及本实验室克隆得到的质粒pET28a(+)-CIDE-3为模板,PCR扩增EGFP、DsRed 1 DNA片段及人CIDE-3基因的CDS序列,再分别将EGFP、CIDE-3及DsRed 1、CIDE-3 克隆人真核表达载体pShuttle-CMV中.酶切、测序鉴定后,经磷酸钙转染人293T细胞,通过荧光显微镜观察其在293T细胞中的表达,并利用荧光染料Bodipy 493/503定位脂滴,探讨CIDE-3与脂滴之间的关系.结果:酶切及DNA测序证实,重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShuttle-CMV-DsRed 1-CIDE-3构建成功.荧光显微镜观察显示,pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3融合蛋白定位于细胞质,pShuttle-CMV-DsRed 1-CIDE-3融合蛋白也定位于细胞质,并与脂滴存在共定位关系. 结论:成功构建了重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShutde-CMV-DsRed 1-CIDE-3;两者均可在239T细胞中表达,融合蛋白分布于细胞质,并与脂滴存在共定位关系.