实时荧光定量RT-PCR检测内皮细胞t-PA mRNA方法的建立

摘要

目的:建立实时逆转录聚合酶链反应,检测人微血管内皮细胞组织型纤溶酶原激活物(t-PA) mRNA的表达.方法:提取人微血管内皮细胞总RNA,经RT-PCR获得靶基因(t-PA)及管家基因(β-actin)的PCR产物.纯化后,作为标准品梯度稀释,采用SYBR Green I定量PCR检测,建立标准曲线.方法学考核参数为特异性、线性范围、精密度和重复性.分析全反式维甲酸对内皮细胞表达t-PA mRNA的干预效果.结果:定量方法特异性好,检测的灵敏度达103拷贝,线性范围为103 ～ 1010 拷贝,循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(r2 ＞0.990),批内变异≤3.10％,批间变异≤4.93％.1.25 ～ 20.00 μmol oL -1的全反式维甲酸能明显上调内皮细胞t-PA mRNA的表达(P ＜ 0.01),且呈剂量依赖性.结论:实时荧光定量RT-PCR的方法可对t-PA mRNA的表达进行准确定量,有助于溶栓药物药理学研究和新药筛选.