人源化含硒单链抗体酶的设计、表达及纯化

摘要

活性氧(Reactie Oxidatie Species，ROS)是由需氧细胞在代谢过程中产生的，并会导致很多疾病。在正常条件下，机体ROS的产生和清除处于平衡状态。但在某些病理状态下，ROS的产生和清除不平衡时，过多ROS会损伤细胞的组分，如DNA、RNA、蛋白质和脂类，甚至导致疾病，如再灌注损伤、炎症、衰老、细胞凋亡和癌症。rn 本文首次将经化学诱变后具有高GPX活力的鼠源单链抗体进行改型。在蛋白质数据库(PDB)中，通过同源序列分析分别确定与重链和轻链同源性较高的人源抗体，对于鼠源单链抗体的改造，除了完全保留CDR区外，还通过计算机模拟的抗原结合位点的空间结构，确定与CDR结构在空间上有关的氨基酸残基，并与人同源抗体该部位的氨基酸同时成对保留，构建了人-鼠嵌合的人源化单链抗体库。通过噬菌体抗体库的筛选获得了ELISA信号较高的噬菌体阳性克隆B14，PCR方法扩增目的基因并将其克隆至表达载体pPeIB中，在E.coli.Rnsetta中进行蛋白的表达，对表达的蛋白进行分离、纯化及鉴定，然后用化学突变法引入催化基团硒代半胱氨酸(Sec)，酶活测定结果表明其GPx活力为880 U/μmol，活力没有预期的高。提取质粒经DNA测序结果表明，有3个核苷酸与设计的位点不同，分别是位于VL区G1n27、Va190和VH区Lys13，分析其较低的GPx活力是由于DNA序列发生了改变，使ScFv的空间构象发生了改变，才导致GPx酶活力不高。