中华绒螯蟹部分基因组文库构建和微卫星位点的筛选

摘要

本实验利用磁珠富集和生物素筛选相结合的办法构建了中华绒鳌蟹基因组微卫星富集文库。用同位素探针对文库进行第二次筛选鉴定，获得含微卫星的阳性克隆。以中华绒螫蟹为实验材料，提取肌肉的基因组DNA，经Sua3A I限制性内切酶酶切后，同收400-1000bp的片段进行PCR伞基因组扩增，并利用生物素标记的(GA)12探针进行微卫星片段的富集。将得到的片段与pGEM-T载体连接后转入DH5α大肠杆菌中，然后利用γ-32 P同位素标记的(GA)12探针进行第二次筛选。结果，共获得微卫星基因组文库1500个菌，杂交前菌落PCR检测阳性克隆率62．5％;杂交后得到的阿性克隆为447个，占29．8％。经测序，有248个克隆含有重复次数大于5次的微卫星序列。rn 在得到的微卫星序列中，重复单元除GA／CT外，还观察到三碱基、四碱基重复单元。根据侧翼序列应用引物设计软件Primer3．0设计引物164对，选择合成50对，通过优化PCR反应条件，结果有21对引物可扩增出清晰可重复的目的条带，15对具有多态性。rn 本研究对中华绒螫蟹基因组资源的开发利用起到一定的促进作用，并为中华绒整蟹种群的遗传结构、种质资源利用与保护、遗传连锁图谱的构建、QTL定位及对其进行更深入的研究提供了基础资料。