人全血体外热原实验方法研究

摘要

热原检查是非肠道给药药品生物安全性检查的重要项目之一,随着人体发热反应机理及中间信号传导途径的基础研究进展,一种基于人体发热机理和信号传导途径的热原检测方法被提出。样品于体外与人全血混合孵育,通过检测细胞释放的IL-1、IL-6、IL-8、TNF-a等EP(exogenous pyrogen,EP)含量可定量或定性反映样品中所含各种热原质的量。试验采用24孔组织培养板为载体,于每孔加氯化钠注射液1000 μL、样品或对照品100L、全血100μL,37℃、5％CO2条件下孵育后取上清检测EP。分别选择来自革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌的热原质LPS、LTA及Zymosan进行方法研究,鲎法仅能检测LPS,它们对家兔均有致热活性,最低检测浓度分别为0.5U·ml(-1)、0.5μg·ml(-1)、16μg·ml(-1),内毒素致热活性最强,LTA次之,Zymosan最弱。通过时间动态研究确定了全血法对于IL-6、TNFa而言最佳检测指标为IL-1B、孵育时间宜为20小时,人全血-IL-1B法对LPS、LTA、Zymosan最低检测限可以达到0.03EU·ml(-1)、0.25μg·ml(-1),4.0μg·ml(-1)。通过对合格和不合格样品检测,和鲎法及家兔法比较结论相符合,同时可以克服家兔法对边缘产品易造成误判或漏判,且和鲎法一样能设置阳性、阴性对照组,具有可以标准化、定量的优点,有很好的应用前景。新方法结合了BET高灵敏度和家兔法宽检测谱的优点,与兔法相比,新方法更加灵敏、费用低,能直接反映人对多种热原的反应,与细菌内毒素检查法相比,新方法不仅仅局限于格兰氏阴性菌产生的细菌内毒素的检测,对各种热原质均能检测。