重组人蛋白C及其突变体在HEK293细胞中的表达与鉴定

摘要

目的：表达具有生物活性的重组人蛋白C及其突变体。rn 方法：利用脂质体转染法，将所构建的真核表达载体pIRES/hPC和pIRES/mhPC分别转染人胚肾293细胞，通过C418抗性筛选，获得抗性细胞，利用有限稀释法挑选抗性细胞的单克隆，分别提取细胞的基因组DNA及总RNA，应用PCR及RT-PCR检测目的基因的整合及转录表达情况。分别收集不同细胞克隆的表达上清，样品浓缩后进行SDS-PAGE及western Blot检测，并以活化的部分凝血活酶时间测定法(actirated partial trombin time，APTT)测定表达产物的抗凝活性。rn 结果：对获得的5株HEK293-hPC细胞和5株HEK293-mhPC细胞进行鉴定，SDS-PAGE显示相对分子量与血浆人蛋白C相近，Western-Blot检测结果为阳性，经APTT法测定表达产物的抗凝活性，但是重组人蛋白C经活化后其抗凝活性低于血浆人蛋白C，而重组人蛋白C突变体表达后无需活化即具有抗凝活性，活性与重组人蛋白C相近。rn 结论：成功表达了具有生物活性的重组人蛋白C及其突变体，且重组蛋白C突变体表达后无需活化即具有抗凝活性。