人类结直肠癌cDNA片段的电子克隆和实验验证

摘要

目的:利用生物信息学方法对cDNA片段Es274070进行电子克隆和实验验证。rn 方法:从抑制性消减杂交结合基因芯片技术筛选的人结直肠癌差异表达片段中选取cDNA片段ES274070。利用生物信息学方法,将ES274070作为种子序列延伸得到全长cDNA,并找到全长cDNA的开放读码框(ORF),对其染色体定位,组织分布及蛋白质功能进行了初步预测。RT-PCR实验中使用HT-29结直肠癌细胞株的cDNA,在ES274070电子克隆全长序列的基础上设计引物扩增ES274070和与之相关的ORF片段。同时设计RACE-PCR引物扩增ES274070的5’和3’端,PCR产物测序后验证生物信息学分析的正确性。9例结直肠癌标本运用半定量RT-PCR技术检测ES274070在正常结直肠组织和结直肠癌组织中的表达差异,测定目的条带与内参照的条带灰度比值,比值结果运用SPSS软件进行单因素方差分析。rn 结果:cDNA片段ES274070利用BLASTn检索后得到的匹配序列通过DNAStar软件进行拼接,最后得到全长1721bp。生物信息学分析发现该基因定位于人类染色体的17q21.2,与人类其他染色体无同源性。基因的组织表达谱分析提示,该基因在脑少突神经胶质细胞瘤,脑星形细胞瘤,前列癌,卵巢癌,乳癌,睾丸癌,软骨肉瘤中有表达,其中在脑肿瘤组织中表达较高。此基因编码蛋白质产物含有111个氨基酸,相对分子量12.82KD,PI值为8.79。结直肠癌细胞株HT29中扩增得到ES274070片段与来源于结直肠癌组织中的cDNA片段ES274070的碱基序列完全相同。通过RACE-PCR技术结合测序方法得到两条EST序列,这两条EST序列在NCBI核酸序列数据库中没有找到与其相似的序列,但这两个序列定位于人类染色体上,提示他们是新发现的人类mRNA序列,将这两个序列登陆进入NCBI,获得的登录号为EF611099和EF606874。半定量RT-PCR结果显示,ES274070在结直肠癌组织中的表达明显高于正常结直肠组织(P=0.011)。rn 结论:以cDNA片段ES274070作为种子序列拼接得到一条全长1721bp的cDNA序列。通过RACE-PCR技术获得两条新的EST序列。半定量RT-PCR结果显示,ES274070在结直肠癌组织中的表达上调。