细胞信号分子Rac1 mRNA实时荧光定量PCR标准曲线的构建

摘要

目的：构建TaqMan荧光定量PCR检测Rac1mRNA重组质粒标准品和标准曲线,用以检测各种组织中Rac1mRNA的量值水平.rn 方法：根据引物设计原则,参照GenBank中人Rac1的mRNA序列设计实时荧光定量PCR引物和TaqMan荧光探针.采用RT-PCR的方法从胃癌组织中提取总RNA制备Rac1基因的目的片段,产物回收酶切后与pET-20b(+)载体连接,转化到大肠杆菌DH-5α制备重组质粒,应用酶切、PCR、基因测序分析法鉴定重组质粒.根据重组质粒的OD值换算出重组质粒的浓度,梯度稀释后作为Rac1mRNA实时荧光定量的标准品,构建标准曲线.rn 结果：重组质粒进行荧光定量PCR扩增出现了荧光值的增长,表明Rac1mRNA已成功克隆并获得了稳定的重组质粒.以103copies/μ1-109copies/μ1不同梯度浓度的标准品进行荧光定量PCR扩增,显示Ct值与标准品浓度的对数存在良好线性关系.rn 结论：成功构建了Rac1mRNA实时荧光定量PCR标准曲线,可用以检测肿瘤组织中Rac1mRNA量值水平.