人细胞角蛋白8(CK8)基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

摘要

目的：克隆人细胞角蛋白8(CK8)基因cDNA并在大肠杆菌中表达CK8蛋白产物。rn 方法：运用DNA重组技术，设计CK8基因特异引物，采用反转录聚合酶链反应(RT—PCR)技术从人肝细胞癌7721细胞中扩增CK8编码区cDNA，将其插入克隆载体pMD18-T simple vector中，获得重组质粒pMD18-CK8，转化感受态大肠杆菌DH5α。继而采用PCR技术从重组质粒pMD18-CK8中扩增出约1500bp目的片段，再次级克隆到原核表达质粒pET-28a(+)载体中，获得pET-28a—CK8重组原核表达质粒；经酶切、PCR及测序鉴定后转化人BLZI菌株，在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达。采用SDS—PAGE电泳及Western-blot检测CK8蛋白表达水平。rn 结果：①成功建立了人CK8基因cDNA重组体的无性繁殖系。②在原核细胞中成功地表达出人CK8蛋白，该蛋白具有很好的免疫原性。rn 结论：运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了人细胞角蛋白8(CK8)基因，为进一步研究CK8的基因型及探讨该基因编码的CK8蛋白的性质和生物学活性创造条件。