正交实验法优化HV12p-rPA在大肠杆菌中的表达条件及其药效学初探

摘要

目的：为优化抗凝溶栓双功能融合蛋白HV12p-rPA在大肠杆菌中的表达条件,并证明其复性后对体内血栓形成的抑制作用和对体内血栓的溶解作用,初步评价其药效学。rn 方法：采用正交实验,选择L8(27),对培养基、接种量、诱导时间、转速、诱导温度、补料和微量元素7个因素进行两水平正交实验来优化表达条件。借助SOS-PAGE和凝胶分析软件(Bandscan),可以得到融合蛋白的表达量,并以此考察条件优化的效果。采用小鼠尾出血时间法观察HVI2p-rPA对体内血栓形成的抑制作用,建立以胶原蛋白-肾上腺素诱发小鼠体内血栓形成模型,计算该蛋白对小鼠形成脑血栓的保护率。rn 结果：通过实验,得到如下的优化条件:培养基以蒸馏水配制的LB液体为最佳,接种量为5%,诱导时间为4小时,摇床转速为200r/min,诱导温度为39℃,诱导过程中无需补充新鲜培养基,而加入微量元素Mg2+和ca2+则有助于提高融合蛋白的表达量。该融合蛋白主要以包涵体形式存在,优化后其表达量约占菌体总蛋白的29%,而优化前仅为12%。HV12p-rPA同NS相比较,明显延长小鼠尾出血时间。随着HV12p-rPA剂量的增大,出血时间亦延长。HV12p-rPA可显著降低脑血栓小鼠的死亡率,提高偏瘫动物的恢复率,并显著缩短脑血栓偏瘫小鼠的恢复时间,经其抢救后存活的小鼠,大部分可正常存活。rn 结论：表达条件的优化使得目的蛋白表达水平的提高,为HV12p-rPA的后续研究奠定了基础。而药效学评价亦初步证明HV12p-rPA具有显著的抗血栓形成和体内溶栓作用,两种作用呈现明显的剂量-效应关系。其抑制体内血栓形成的作用在等剂量下与肝素钠接近;其体内溶栓作用在等剂量下优于尿激酶,抢救后动物的存活率在等剂量下亦优于尿激酶。