四种重要致病性分枝杆菌DHPLC检测鉴别方法的建立

摘要

运用多重核酸扩增(PCR)联合变性高效液相色谱(denaturinghigh—performance liquid chromatography，DHPLC)分析技术原理，针对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌以及副结核分枝杆菌建立多重PCR—DHPLC快速检测方法，实现同时检测鉴别四种重要致病性分枝杆菌。根据菌种特异基因序列分别设计扩增引物建立四重核酸扩增体系，对扩增产物采用DHPLC设备进行检测分析，对结核分枝杆菌等50株分枝杆菌标准株和分离株样品以及沙门氏菌等24株常见微生物样品进行特异性检测试验;对四种分枝杆菌特异的核酸扩增产物分别制备克隆质粒，通过对梯度稀释的阳性质粒的检测试验，进行多重PCR—DHPLC灵敏度测试;对疑似病人痰液样品和疑似发病牛的组织样品进行检测，并与细菌分离培养法进行比较以验证临床检测效果。试验结果显示，该方法能快速检测鉴别上述四种分枝杆菌，每一菌种的核酸扩增产物分别形成DHPLC特征峰图，与其他菌种无非特异性反应;检测灵敏度达到102～103基因拷贝，从131份疑似病人临床样品中检出91份结核分枝杆菌阳性，从40份来自疑似发病牛群的临床样品中检出31份牛分枝杆菌阳性，检出率均高于细菌分离培养法.研究表明所建立的多重PCR—DHPLC方法能快速检测鉴别四种重要致病性分枝杆菌，为人畜结核、副结核病诊断提供一种新型分子生物学技术手段。