源于活性污泥宏基因组的2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶基因的克隆、表达及纯化

摘要

自然界中99%的微生物无法通过传统纯培养方法获得,因此,利用非培养技术获取自然界中新型功能基因已成为近年来的研究热点。本研究从活性污泥宏基因组出发,采用直接PCR法扩增得到2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶基因(bphC)的部分片段,并利用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)获得了897 bp的bphC全长基因。序列分析结果显示,氨基酸序列与Pseudomonas putida B6-2的BphC序列相似性为99%。将bphC基因插入载体pET-28a中并转至大肠杆菌E.coli BL21,经诱导成功表达2,3.二羟基联苯1,2-双加氧酶(BphC),初步验证其为Fe(Ⅱ)-依赖型外二醇双加氧酶,利用Ni亲和层析柱分离纯化BphC至电泳级,分子量为34±1 kDa。