微囊藻毒素LR致大鼠肝细胞氧化应激对修复基因的影响

摘要

背景:随着社会经济的发展,水体富营养化,使藻类异常繁殖而出现水华现象。水华不仅对水生生态系统的平衡有很大程度的破坏,而且其中的蓝绿藻还能对健康产生潜在的威胁.最常见的水华藻类是微囊藻属,由它产生的微囊藻毒素(microcystin,MC)是一类具有活性单环七肽物质,结构为环(D-丙氨酸-L-X-赤-β-甲基-D-异天冬酸-L-Y-Adda-D-异谷氨酸-N-甲基脱氢丙氨酸),其中X、Y为2种可变L-氨基酸,由此产生80多种异构体[1],其中存在较多、毒性较大的是微囊藻毒素-LR、YR、RR,L、Y、R分别为亮氨酸、酪氨酸、精氨酸.MCs与健康关系已成为世界关注的热点课题。根据文献报道[2],MC-LR能引起肝细胞内活性氧的增加。活性氧(ROS)在MC-LR引起DNA的损伤中可能起到了重要作用,ROS可以攻击多不饱和脂肪酸,启动脂质过氧化反应,形成脂质自由基L,烷氧型自由基LO,过氧自由基LOO以及其它终产物.活性氧和脂质过氧化反应产生的自由基可导致DNA损伤,造成DNA单链断裂,引起细胞凋亡[3].当DNA受到损伤后,能活化P53基因的表达,而P53基因能使细胞周期停滞及诱导细胞凋亡;此外P53还可活化P21基因表达,发挥抑制周期蛋白-Cdk复合物的作用,使细胞停滞于G1期和G2期,直至DNA损伤惨复或复制完全[4].DNA损伤修复是由一系列DNA修复途径来实现,主要包括核苷酸切除修复(NER)和碱基切除修复(BER)。每个修复途径都由许多基因参与,涉及许多酶和蛋白质。已知参与细胞DNA损伤的修复基因有很多,比如XRCC1基因、PARP1基因和JWA基因.它们对某些类型的DNA损伤具有特异性的修复能力,对于避免基因突变、维护基因组的稳定性具有不可替代的作用。临床很多研究都表明修复基因XRCC1、PARP1和JWA表达与DNA的氧化损伤有密切关系[5,6,7].但对于微囊藻毒素LR引起氧化应激损伤肝细胞后是否也会引起这三个修复基因的变化,目前鲜有报道.为此,本研究以MC-LR致体外培养的大鼠肝细胞氧化应激过程中对修复基因的影响为线索,探讨MC-LR致大鼠肝细胞氧化损伤与修复基因变化关系。rn 目的:体外培养大鼠肝细胞BRL,测定微囊藻毒素LR对细胞增殖、凋亡、氧化损伤的影响以及修复基因JWA、XRCC1、PARP1的变化,探讨微囊藻毒素LR致大鼠肝细胞BRL,氧化损伤对修复基因JWA、XRCC1、PARP1的影响。rn 方法: 1.分别以0、1、5、10、30μg/mlMC-LR染毒大鼠肝细胞BRL24h、48h和72h,用MTT法检测细胞增殖与凋亡情况。2.分别以0、1、5、10、30μg/mlMC-LR染毒大鼠肝细胞BRL48h,测定细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氯化物岐化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)的含量及乳酸脱氢酶(LDH)的漏出率.3.分别以0、1、5、10、30μg/mlMC-LR染毒大鼠肝细胞BRL24h、48h和72h,应用实时荧光定量PCR技术测定JWA、XRCC1和PARP1基因mRNA的表达量变化。rn 结果:与不加毒素的对照组细胞相比,各染毒组(1、5、10、30μg/ml)MC-LR抑制BRL细胞生长,MC-LR染毒剂量越高,细胞吸光度值越低;并随着MC-LR染毒时间延长,细胞吸光度值逐渐降低,呈剂量效应关系和时间效应关系.与不加毒素的对照组细胞相比,1、5、10、30μg/mlMC-LR染毒BRL细胞48h,细胞内MDA含量有增加的趋势,但无统计学差异;30μg/ml染毒组T-SOD、GSH-PX含量下降,10、30μg/ml染毒组LDH漏出率增加,差异有统计学意义。与不加毒索的对照组细胞相比,30μg/ml MC-LR染毒48小时BRL细胞PARP1基因表达下降,染毒72小时BRL细胞JWA、XRCC1和PARP1基因均表达下降。rn 结论: 1-30μg/ml MC-LR可以抑制火鼠肝细胞BRL,的增殖,呈现剂量效应关系和时间效应关系;MC-LR可引起BRL细胞氧化应激损伤,10、30μg/ml MC-LR引起细胞LDH漏出率增加,30μg/mI MC-LR引起细胞T-SOD、GSH-PX含量下降;本实验条件下,MC-LR可引起修复相关基因JWA、XRCC1和PARP1表达改变。30μg/mlMC-LR染毒BRL细胞48小时使PARP1基因表达下降,染毒72小时使JWA、XRCC1和PARP1基因表达下降.