中国人群运动性猝死相关基因快速检测方法研究

摘要

研究目的：rn 近年来,马拉松等高强度竞技体育运动项目引起的运动性猝死案例频发,并且其数量呈逐年上升的态势.心源性猝死与基因多态关联性研究成果表明,通过快速基因检测,可以实现针对运动性猝死早期基因筛查及风险评估.本研究选取KCNH2、KCNE1、SCN5A、KCNJ11、NUP155、CACNA1C、CACNB2b,7个与运动性猝死显著相关的热点突变基因的多态位点作为检测靶点,采用半巢式AS-PCR方法,建立准确、快速筛查中国人群运动性猝死相关基因多态性的检测方法.rn 研究方法:rn 1）全血DNA提取试剂盒提取外周静脉血基因组DNA。2）阳性DNA模板制备：根据7个靶基因SNP位点设计突变引物，并进行PCR扩增，将引入突变位点的目的片段克隆到pMD18-TVector载体中，测序验证后作为后续PCR的DNA模板。3）通过等位基因特异性PCR（allele-specific，AS-PCR）法扩增目的基因，其中包括：PCR退火温度（Tm值）条件的优化；内参引物与目的基因引物浓度比例条件的优化；PCR扩增循环数的优化等。4）基因分型的准确性和重复性验证，采用美国BECKMANSNPstream高通量基因多态性分析系统，以及美国ABI3130基因测序仪来完成。rn 研究结果:rn 以50例临床猝死个体的DNA样本为检测对象，测试本研究方法的准确性，其中9号、22号，27号，40号样本检出阳性结果。9号、22号样本，KCNE1基因型为A/G杂合；27号样本KCNH2基因型为GG纯合；40号样本NUP155基因型为A/G杂合。以上阳性突变表明，携带以上基因型的个体存在潜在的猝死风险。将阳性样本的PCR产物，经BECKMANSNPstream高通量基因多态性分析系统，以及ABI3130DNA测序仪进一步验证，检测结果均与本研究方法基因分型的结果一致。rn 研究结论:rn 本研究采用半巢式AS-PCR法，对中国人群运动性猝死相关基因多态性进行快速分型，PCR产物琼脂糖凝胶分型结果与BECKMANSNPstream高通量基因多态性分析系统及ABI3130测序仪出具的结果完全一致，表明该方法适用于在中国人群中大型群众体育活动（如马拉松等）猝死相关基因的快速检测。临床研究结果显示，中国汉族人群中广泛存在KCNE1、KCNH2、KCNJ11单核苷酸多态性改变，从而导致室性心动过速猝死。本研究检测的50例临床猝死样本中，KCNE1基因的两种突变型各1例，KCNH2基因突变1例。因此，钾离子通道相关基因导致的猝死属于高危基因突变型。本研究未发现钠离子通道相关基因SCN5A，钙离子通道相关基因CACNA1C、CACNB2B的突变，这两类基因突变导致的运动性猝死在人群中分别约占1-5‰和0.1-0.3‰，属于低度危险突变型。据文献报道，编码核孔复合物组分的基因NUP155基因是中国汉族人群中发现的与运动性猝死显著相关的特有基因，本研究检测发现1例NUP155基因的突变。引物设计、PCR反应条件是决定AS-PCR特异性和敏感性的重要环节。本研究在多态引物的倒数第二位引入错配碱基大大提高了检测特异性，但AS-PCR方法也存在一定的局限性，比如：在筛查较多SNP位点时，由于引物数量增多，实验条件的优化难度增大，检测通量随之受限。因此，AS-PCR方法在检测通量方面仍然有很大的提升空间，希望在后续的研究中能够结合多重PCR等技术来扩展其检测通量和应用范围。