ALD5基因对白念珠菌药物敏感性的影响

摘要

目的：考察ALD5基因对于白念珠菌线粒体呼吸、对唑类药物敏感性的影响，并间接证明线粒体呼吸功能在白念珠菌耐药性形成中的作用。方法：通过Ura-blaster策略，构建ALD5基因两个等位基因缺失菌株。通过基因克隆，构建ALD5基因高表达菌株。检测可见光密度，监测白念珠菌ALD5基因缺失菌和高表达菌的生长动力和倍增时间；利用JC-1检测白念珠菌线粒体膜电位；采用微量液基稀释法、Spotassay法检测白念珠菌对唑类药物、氧化剂、渗透刺激的敏感性；利用DCFH-DA检测白念珠菌内源性活性氧；利用罗丹明6G考察白念珠菌膜转运蛋白的外转运功能。结果：成功构建ALD5基因缺失菌和高表达菌。ALD5基因缺失菌在YPGE、YPE、YPAc等含有非发酵碳源的培养基内孵育12 h后，生长受到明显抑制。药物长时间作用后，ALD5缺欠菌对药物敏感性降低。ALD5缺失菌内源性活性氧增加程度明显低于亲本菌。ALD5基因不改变白念珠菌对外源性氧化刺激、盐刺激、渗透刺激的敏感性，不改变白念珠菌细胞线粒体膜电位水平。葡萄糖加入后，ALD5缺失菌的罗丹明6G外排量与无葡萄糖存在时无明显增加，ALD5高表达菌增加对罗丹明6G的外排量。结论：白念珠菌Ald5p将线粒体内乙醛脱氢转变为乙酸的同时，产生还原型NADPH，从而增加泛醌库的还原性，并由此造成细胞内活性氧物质增多。因而，ALD5缺失菌在咪康唑作用后内源性活性氧增加程度明显低于亲本菌活性氧的增加，表现为对药物的敏感性有一定程度降低。