利用生物反应器发酵生产漆酶的工艺研究

摘要

漆酶(Laccase,EC1.10.3.2)是一种的多酚氧化酶,属蓝多铜氧化酶家族成员,其作用底物较为广泛,能够催化酚类、生物色素、羧酸类和许多其他非酚类物质的氧化,因此被应用于环保、造纸工业、食品工业、生物监测、有机合成等众多领域,具有较高的经济应用价值.rn 本文以一色齿毛菌(Cerrena unicolor)Y-G07作为生产菌株,通过对其生产培养基成分的优化,5L发酵罐溶氧相关条件的控制及发酵罐生产工艺的优化等方面进行了研究,实验结果如下:rn 1、通过优化生产培养基成分,确定摇瓶发酵培养基最佳碳、氮源配方(w/v):碳源为6％工业级麦芽糊精,氮源为1.5％蛋白胨和0.2％酒石酸铵,25℃下摇瓶发酵的漆酶活力可达514.3U/mL,比采用课题组前期研究的培养基方案活力提高70％,同时降低生产成本.通过5L发酵罐放大培养后,最终确定其发酵培养基的初始碳、氮源分别为7％工业级麦芽糊精和1.5％蛋白胨+0.2％酒石酸铵.rn 2、对5L立式发酵罐溶氧相关控制条件进行研究得出，若不考虑转速产生的负面影响而将溶氧控制在10士5%和20士5%两水平，漆酶活力峰值分别仅为454.5U/mL和417.8U/mL;通过玻璃珠剪切力实验证实Y-G07菌株对搅拌产生的剪切力作用敏感;进一步实验确定最佳搅拌速度为300r/min,酶活力可达573.0U/mL，相比摇瓶发酵最高水平(514.3U/mL)提高11.4%;综合考虑耗氧丝状真菌对剪切力的敏感性及提高漆酶产量等因素，研究进一步在控制低转速、高通气量(300r/min,2vvm)的条件下，采取5组不同搅拌器组合进行发酵试验，最终得出六折叶DT602式搅拌器效果最好，酶活最高可达690.3U/mL.rn 3、对发酵罐生产工艺不同条件进行优化，考察其对Y-G07菌株生长和产酶的影响。确定8%为最佳接种量，漆酶活力维持在较高水平，665.3U/mL;确立分批发酵产漆酶的温度控制方案:0-48h控制为30℃,48h后控制为25℃。相对恒定30℃和25℃条件下，酶活分别提高27%和10%，峰值达730.4U/mL;控制不同pH进行发酵产酶，发现pH4.0条件下，酶活力峰值可达761.1U/mL;考察2种分批补料方案对漆酶产量的影响，以10% (w/v)麦芽糊精作为补料液，使还原糖维持在不同浓度(20士2g/L和10士2g/L )。当浓度为10士2g/L时，酶活力最高可达830.2U/mL;而维持浓度为20士2g/L时，延长了菌体快速生长期，漆酶活力最高可达862.3U/mL.