首页> 中国专利> 新冠病毒S蛋白和铁蛋白亚基融合的纳米抗原颗粒、新冠疫苗及其制备方法和应用

新冠病毒S蛋白和铁蛋白亚基融合的纳米抗原颗粒、新冠疫苗及其制备方法和应用

页面导航

摘要
著录项
法律信息
说明书
相似文献

摘要

本发明公开了新冠病毒S蛋白和铁蛋白亚基融合的纳米抗原颗粒、新冠疫苗及其制备方法和应用。本发明将新型冠状病毒S蛋白的ECD、S1亚基和RBD分别与铁蛋白亚基N端融合表达展示在自组装铁蛋白笼形结构表面。本发明进一步将S蛋白进行突变优化以提高其可溶性表达量和表达效率，提高疫苗的免疫效力与宽度并有效提高免疫原性。本发明利用大肠杆菌原核表达系统、家蚕及AcMNPV‑昆虫细胞真核表达系统分别表达重组蛋白疫苗或通过重组杆状病毒在脊椎动物体内组织进行基因呈递产生抗原诱导抗体产生。本发明新冠疫苗能引发广泛中和性抗新冠抗体，不仅可提高免疫效力还能扩大免疫范围，具有成为一种具有交叉免疫效力的通用新冠疫苗的潜力。

著录项

公开/公告号CN112076315B

专利类型发明专利
公开/公告日2023.09.01

原文格式PDF
申请/专利权人中国农业科学院生物技术研究所;
展开▼

申请/专利号CN202010865106.3
发明设计人张志芳;李轶女;刘兴健;宋浩志;易咏竹;高新桃;胡小元;李家磊;李丹;
展开▼

申请日2020.08.25
分类号A61K39/215(2006.01);A61K39/385(2006.01);A61K47/64(2017.01);A61P31/14(2006.01);C07K19/00(2006.01);C12N15/62(2006.01);C12N15/70(2006.01);C12N15/866(2006.01);
代理机构北京思元知识产权代理事务所(普通合伙) 11598;北京思元知识产权代理事务所(普通合伙) 11598;
代理人余光军;霍雪梅
地址 100081 北京市海淀区中关村南大街12号
入库时间 2023-10-16 19:40:03

法律信息

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态
2023-09-01

授权

发明专利权授予

说明书

技术领域

本发明涉及基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒，尤其涉及包含由新冠病毒S蛋白和单体铁蛋白亚基融合在一起的纳米抗原颗粒以及由该纳米颗粒抗原制备的新冠疫苗，属于新冠疫苗领域。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种可引起人新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的新发呼吸道病原体，与中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和严重性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)同属β-冠状病毒。SARS-CoV-2主要通过呼吸系统和消化系统感染，具有较高的传染性和致死率，其临床表现从轻微的流感样症状到严重危及生命的重症肺炎。新冠病毒与其他冠状病毒类似，由四个结构蛋白组成，分别是刺突蛋白(spike，S)、包膜蛋白(envelope，E)、膜蛋白/基质蛋白(membrane/matrix，M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid，N)。S蛋白通过位于S1亚基上的受体结合区(receptor bingding domain，RBD)与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2受体结合，从而进入人体细胞，导致发烧、肺部感染等疾病。因为针对病毒S蛋白的中和抗体可阻断病毒侵入宿主细胞，所以目前在研究的大多数新冠疫苗都是以S蛋白为主要抗原进行设计开发的。新冠病毒引起的肺炎已在全球范围内大规模蔓延，接种疫苗是根除病毒性传染病最有效的方法，国内外各大科研机构已快速展开COVID-19疫苗的研制工作。

近几年，铁蛋白作为一个理想的抗原呈递和疫苗开发平台发展迅速，铁蛋白纳米粒子由24个亚基自组装而成，每三个亚基构成一个三聚体。因为N端暴露在笼形结构外面，常用来在N端融合表达并展示外源蛋白。同时，SARS-CoV-2的刺突(S)蛋白也是一个三聚体结构，S-Ferritin融合蛋白组装后可以在纳米颗粒表面产生一个八元S蛋白三聚体刺突，在结构上很好的模拟了SARS-CoV-2 S蛋白天然结构，从而使得S蛋白抗原性更好。

铁蛋白纳米颗粒广泛存在于所有生物体内，是生物体内的主要储铁形式，对生命活动非常重要。铁蛋白非常稳定，能够耐受高温(70％-80％)和多种变性剂而不影响其天然蛋白结构。利用铁蛋白这些独特的理化性质，仿生合成铁蛋白并使其成为理想的纳米载体。铁蛋白作为纳米载体具有较大表面积和较为简单的表面修饰方法，能够高效率、高精度地装载药物分子。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种包含新冠病毒S蛋白融合蛋白的自组装铁蛋白纳米抗原颗粒；

本发明的目的之二是将所述融合蛋白进行突变进而提高融合蛋白的表达量或表达效率；

本发明目的之三是提供高效表达所述融合蛋白的方法；

本发明目的之四是提供一种将自组装铁蛋白纳米颗粒与新冠病毒S蛋白所构建的融合基因呈递给动物体内并在动物体内呈递抗原诱导产生抗体的方法。

本发明的目的之五是提供基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒得到的纳米颗粒新冠疫苗；

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先提供了一种包含融合蛋白的纳米抗原颗粒，所述融合蛋白由新冠病毒S蛋白和单体铁蛋白亚基连接得到；优选的，将新冠病毒S蛋和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白；其中，将铁蛋白氨基酸序列前4个氨基酸去掉，然后将连接肽SGG连在铁蛋白N端第5个氨基酸上。

所述新冠病毒S蛋白选自ECD(胞外结构域)、S1亚基或RBD(受体结合区)中的任何一种；优选的，本发明将NCBI上GenBank序列号：YP_009724390作为相应毒株的抗原基因，以取得最佳的保护效果。

所述单体铁蛋白亚基包括细菌铁蛋白、植物铁蛋白、藻铁蛋白、昆虫铁蛋白、真菌铁蛋白或哺乳动物铁蛋白中的任何一种；优选的，所述单体铁蛋白亚基是幽门螺杆菌铁蛋白单体，其氨基酸序列为NCBI上GenBank序列号：WP_000949190所示；为了促进新冠病毒与铁蛋白融合纳米颗粒的表达效率并提高可溶表达，将幽门螺杆菌铁蛋白氨基酸序列中第19位天冬酰胺(N)突变为谷氨酰胺(Q)以消除糖基化位点。

作为本发明一种优选的具体实施方式，将新冠病毒S蛋白的ECD(胞外结构域)和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；将新冠病毒S蛋白的S1亚基和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示；将新冠病毒S蛋白的RBD(受体结合区，为了使RBD和铁蛋白更好融合，RBD区前后各延长三个氨基酸。)和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示；其中，SEQ ID NO.1所示融合蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.4所示融合蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，SEQ ID NO.7所示融合蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示。

本发明为了提高新冠病毒S蛋白ECD、S1、RBD与铁蛋白单体连接后得到的融合蛋白的表达量，本发明进一步将SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.7所示融合蛋白的编码基因的核苷酸序列进行糖基化位点分析，以消除糖基化位点来增加可溶性表达；具体的，本发明进一步利用OptimumGene

本发明在序列优化之后对融合蛋白进行氨基酸单位点突变，双位点突变，以提高其可溶性表达量和表达效率，即，本发明以S ECD-Ferritin、S S1-Ferritin、S RBD-Ferritin密码子优化后的基因序列为模板，设计多对引物对序列进行定点突变，具体的，本发明将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照F70N,G100L,Q126T,Q145R,T178D,L200S,L240T,T270E,T285D,T326P,T344A,Y362E,Y380E,D400S,R419M,I445F,R465K,A486C,,F501A或H530K的中的任何一种氨基酸单位点突变方式获得了多个单位点突变体；将SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列按照F70N,G100L,Q126T,Q145R,T178D,L200S,L240T,T270E,T285D,T326P,T344A,Y362E,Y380E,D400S,R419M,I445F,R465K,A486C,,F501A或H530K中的任何一种氨基酸单位点突变方式获得了多个单位点突变体；将SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列按照T344A,Y362E，Y380E,D400S,R419M,I445F,R465K,A486C,,F501A或H530K中的任何一种氨基酸单位点突变方式获得了多个单位点突变体。

本发明中所述的“F70N”单位点突变的含义是指将第70位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺，其余的单位点突变的含义以此类推。

本发明将上述这些单位点突变体在家蚕表达系统中分别进行了表达，根据表达结果可见：将SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列分别按照T344A，Y380E，D400S，R419M，R465K、F501A这6种氨基酸单位点突变方式所各自获得的6个突变体的表达产物的效价均呈显著提升。

基于所确定的部分单位点的突变是有效突变，可以达到提高SARS-CoV 2S-Ferritin-O-M突变体表达量的效果，考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构决定着蛋白质的高级结构且上述进行的氨基酸单位点突变有部分突变位点的位置可能是相互关联的，本发明将可以提高表达量的这6个单突变位点(T344A，Y380E，D400S，R419M，R465K，F501A)两两组合进行双位点突变，具体如下：

将SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列分别按照T334A-Y380E，T334A-D400S，T334A-R419M，T334A-R465K，T334A-R465K，T334A-F501A，Y380E-D400S，Y380E-R419M，Y380E-R465K，Y380E-F501A，D400S-R419M，D400S-R465K，D400S-F501A，R419M-R465K，R419M-F501A、R465K-F501A的氨基酸双位点突变方式获得45个双位点突变体；本发明将获得的45个双位点突变体分别在家蚕表达系统中进行表达，根据表达结果可见：将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列按照T334A-Y380E,Y380E-R419M或R419M-R465K的氨基酸双位点突变方式获得的6个双位点突变体的表达产物的效价呈显著提升，其中，将SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.7所示的氨基酸按照Y380E-R419M氨基酸双位点突变获得的突变体的效价提升最为显著。

本发明中所述的“T334A-Y380E”双位点突变的含义是指将第334位的苏氨酸突变丙氨酸为以及同时将第380位的酪氨酸突变为谷氨酸，其余的双位点突变的含义以此类推。

本发明将获得的优化的基因序列在家蚕表达系统中进行表达，根据在大肠杆菌宿主表达结果可见：所得多个优化突变序列表达量相比原始序列均有显著提升。本发明进一步将优化序列在家蚕表达系统中的表达产物经过初步纯化后采用电镜进行观察，观察结果可见产物大小与预期符合的纳米颗粒，笼状体的直径为20-30纳米左右，仔细观察可见有天线状突出。如图3所示。

本发明将获得的优化的相应基因序列克隆到杆状病毒哺乳动物的表达载体中构建得到呈递基因的重组杆状病毒；通过重组杆状病毒将基因呈递给小鼠，结果发现小鼠所产生的抗体效价明显高于健康蚕蛹对照和传统方法制备的疫苗。

因此，本发明所提供的包含融合蛋白的自组装铁蛋白纳米抗原颗粒能应用于制备新冠疫苗，其制备方法包括：

(Ⅰ)将所述的融合蛋白编码基因采用原核表达系统在原核细胞中进行表达得到纳米抗原颗粒，将所表达的纳米抗原颗粒产物纯化后与医学上可接受的免疫佐剂或载体混合在一起得到新冠疫苗；

作为参考，采用原核系统表达系统在原核细胞中表达纳米抗原颗粒的步骤包括：

(1)将融合蛋白原始基因序列或优化后的融合蛋白基因序列克隆到表达载体pET28a上，得到重组质粒；

(2)将重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中表达，随后经过镍柱纯化，即得。

(Ⅱ)将所述的融合蛋白编码基因采用真核表达系统在真核细胞或生物体或组织中进行表达，将所表达的抗原产物纯化后与医学上可接受的免疫佐剂或载体混合在一起得到新冠疫苗。

作为参考，所述的融合蛋白编码基因采用真核表达系统在真核细胞中进行表达的方法包括以下步骤：

将所述的融合蛋白编码基因在家蚕表达系统中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；优选的，将所述的融合蛋白编码基因构建到家蚕杆状表达载体中制备得到重组家蚕杆状病毒；将重组家蚕杆状病毒在家蚕细胞中扩增后在家蚕或蚕蛹中进行表达。

或者将所述的融合蛋白编码基因在AcMNPV-昆虫细胞真核表达系统中进行表达，收集并纯化所表达的抗原；优选的，将融合蛋白编码基因克隆到杆状病毒转移载体中构建得到重组杆状病毒转移载体；将重组杆状病毒转移载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞，培养被感染的昆虫细胞或昆虫宿主表达相应的抗原，纯化即得。

(Ⅲ)还可将所述的融合蛋白编码基因克隆到基因呈递载体上构建得到向脊椎动物细胞或个体中呈递外源基因的重组杆状病毒转移载体，将重组杆状病毒转移载体转染家蚕细胞得到重组病毒；将所得到的重组病毒通过注射或口服的方式在动物体内呈递抗原并诱导动物产生抗体。

由此，本发明进一步提供了一种防治新型冠状病毒的疫苗，包括：预防或治疗上有效量的包含新冠病毒S蛋白融合蛋白的自组装铁蛋白纳米抗原颗粒以及药学上可接受的免疫佐剂或载体。

本发明的防治新型冠状病毒疫苗可以以各种不同的药物赋形剂或载体配制；它们可以包括盐和缓冲剂以提供生理学的离子强度和pH，譬如，包括表面活性剂，诸如聚山梨醇酯20和80以防止抗原聚集；用于抗原稳定的稳定剂，诸如PEG、海藻糖和明胶及用于缓释的聚合物诸如CMC、HEC和葡聚糖。疫苗还可以受控释放或增强的展示系统配制，诸如水凝胶、病毒体、纳米颗粒和乳液。疫苗还可以配制合适的佐剂以进一步增加交叉反应免疫应答和交叉保护，所述合适的佐剂可以选自多糖诸如脂多糖和皂苷、核酸诸如CpG和聚I:C、脂质诸如MPL(单磷酰脂质A)、蛋白质诸如细菌鞭毛蛋白、无机盐(诸如铝盐和磷酸钙)、乳剂(诸如弗氏不完全佐剂、MF59和AS03)和各种Toll样受体配体。可以用处理的抗原测试不同的佐剂，以鉴定在合适的佐剂剂量产生较高水平的交叉反应免疫应答和交叉保护，包括完全的或100％的保护的合适的佐剂。

本发明的新型冠状疫苗可通过各种途径使用，如肌内、皮下、鼻内、局部、舌下、或口服。

基于铁蛋白的新型纳米颗粒疫苗比传统疫苗具有更强的免疫力和更广的免疫范围。本发明利用铁蛋白纳米颗粒展示新冠病毒S蛋白抗原，能够显著地增强抗原的免疫原性，引起更强的体液、细胞免疫反应，是理想的纳米疫苗平台。本发明所提供的疫苗能通过在幽门螺杆菌铁蛋白笼形结构表面展示新冠病毒S蛋白结构，从而能够引起广泛中和性新冠病毒抗体。此种疫苗诱导个体产生的中和性抗体不仅增加了免疫效力，还增加了免疫范围，能保护不同亚型新型冠状病毒攻击。

按上述步骤，此类似的方案也可适用于其他冠状病毒科的病毒，如SARS、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎(TGEV)等疫苗的研发。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、本发明利用原核表达系统大肠杆菌、家蚕杆状病毒和AcNPV-昆虫细胞真核表达系统表达重组蛋白疫苗，疫苗制备过程不涉及到活的有害病毒，相比传统疫苗制备方法操作更加安全、简便，适合进行快速大规模生产；

2、本发明提供的纳米新型冠状疫苗可以诱导具有广谱性质的新冠病毒抗体，为制备一种通用新冠疫苗打下基础。

3、本发明提供的新型冠状疫苗，用这种纳米新冠疫苗免疫接种动物而诱导产生的抗新型冠状病毒抗体水平明显比传统方法制备的疫苗的高。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

词语“抗原”和“免疫原”可互换使用，且是指能够诱导特异性体液(抗体)和细胞免疫应答的分子、物质、蛋白质、糖蛋白、或活病毒。

术语“抗原性”是指抗体与特异性抗原反应或结合的能力；术语“免疫原性”是指抗原或疫苗诱导特异性免疫应答的能力；术语“免疫应答”是指针对抗原、疫苗或感染因子的体液或抗体介导的和细胞介导的免疫应答；术语“疫苗”是指用于针对感染性或非感染性疾病的治疗性处理或预防性免疫的包括抗原的组合物；术语“免疫”是指通过接种疫苗或感染产生的免疫应答，其提供针对感染性或外来试剂的保护；术语“重组蛋白质或抗原”是指以重组DNA技术产生的蛋白质或抗原，其可用于在包括细菌、哺乳类细胞、昆虫细胞和植物的各种宿主中克隆和表达基因以产生蛋白质。术语“效力”是指如通过指定的效力测定测量的在抗原制剂或疫苗中抗原的量。

术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。

术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“转染”指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。

附图说明

图1 SARS-CoV 2 S-Ferritin在大肠杆菌原核表达系统的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。M：Marker；1，2：S ECD诱导；3：S ECD未诱导；4，5：S S1诱导；6：S S1未诱导；7，8:S RBD诱导；9：S RBD未诱导；10：空载，空载为pET-28a载体的原核表达样品。

图2为S ECD-Ferritin基因表达产物Western blotting检测图；A为相应基因表达产物；B为阴性对照。

图3为S S1-Ferritin基因表达产物Western blotting检测图；A为相应基因表达产物；B为阴性对照。

图4为S RBD-Ferritin基因表达产物Western blotting检测图；A为相应基因表达产物；B为阴性对照。

图5SARS-CoV 2 S-Ferritin纳米颗粒蚕血淋巴样品经初步纯化后用透射电镜检测，标尺尺寸：50nm；图中可观察到符合预期大小的大量球状物质，表明融合蛋白成功自组装成纳米颗粒抗原。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、试验材料与试剂

(1)菌株、病毒株与载体：原核表达载体pET-28a(+)、大肠杆菌TOP10菌株、转移载体pVL1393、原核表达菌株BL21(DE3)、家蚕细胞BmN、Sf-9细胞、Hi5昆虫细胞、家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid、苜蓿斜纹夜蛾多角体病毒亲本株AcBacmid、家蚕品种JY1均为中国农业科学院生物技术研究所分子微生物实验室保存；

(2)铁蛋白序列和新冠病毒S蛋白基因序列：通过分析得到的共有序列送至金斯瑞公司合成，并克隆到载体pUC57载体上。

(4)培养基：大肠杆菌培养基为LB培养基；家蚕昆虫细胞培养基为TC-100购自AppliChem公司；

(5)新冠病毒与铁蛋白融合构建的纳米疫苗的动物实验在隔离实验室进行。

实施例1 S ECD-Ferritin、S S1-Ferritin、S RBD-Ferritin融合序列纳米颗粒疫苗的制备与效力检测

1有关溶液和培养基的配置

有关溶液和培养基的配置方法参照相关工具书(Joseph et al.,分子克隆实验指南第三版，2002；奥斯伯，等人，精编分子生物学指南，1998)。

2 SARS-CoV 2 S蛋白基因序列和铁蛋白基因序列的合成。

为了使新冠病毒S蛋白与铁蛋白更好的融合表达，利用信号肽分析软件(SignalP)和跨膜结构域分析软件(TMHMM)分别对新冠病毒S蛋白(NCBI上GenBank序列号：YP_009724390)的氨基酸序列进行分析，得出新冠病毒(SARS-CoV)2 S蛋白信号肽为前13个氨基酸，其胞外结构域为前1213个氨基酸，本试验分别选用ECD、S1、RBD序列进行融合。

为了促进新冠病毒与铁蛋白融合纳米颗粒的表达效率并提高可溶表达，将幽门螺杆菌铁蛋白氨基酸序列(NCBI上GenBank序列号：WP_000949190)中第19位天冬酰胺(N)突变为谷氨酰胺(Q)，以消除糖基化位点。其中新冠病毒S蛋白序列与铁蛋白序列之间由一段连接肽连接(SGG)，将铁蛋白氨基酸序列前4个氨基酸去掉，然后将连接肽连在铁蛋白N端第5个氨基酸上。

为了提高目的基因在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因前面加了Kozak序列AAC，为了提高翻译终止效率，终止密码子改为TAA。此外，还去除了基因序列内部的BamHI、EcoRI等限制性酶切位点，在基因上游加上了BamHI，在基因下游加上了EcoRI限制性酶切位点，以便后续克隆到真核转移载体pVL1393中。

将目的基因序列去掉信号肽，利用pET-28a(+)载体上的ATG进行起始起始翻译。此外，还去除了基因序列内部的BamHI、EcoRI等限制性酶切位点，在基因上游加上了BamHI，在基因下游加上了EcoRI限制性酶切位点，以便后续克隆到原核载体pET-28a(+)上。

将新冠病毒S蛋白的ECD(胞外结构域)和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；将新冠病毒S蛋白的S1亚基和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示；将新冠病毒S蛋白的RBD(受体结合区)和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示；其中，SEQ ID NO.1所示融合蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.4所示融合蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.5所示，SEQ ID NO.7所示融合蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示。

本发明利用OptimumGene

将上述所设计的新冠病毒S蛋白基因序列和铁蛋白序列进行人工合成。

3新冠病毒S蛋白和铁蛋白原始融合蛋白的质粒构建

3.1新冠病毒和铁蛋白原始融合蛋白的PCR扩增

用融合PCR技术将新冠病毒和铁蛋白融合构建。

3.1.1大肠杆菌表达质粒的PCR扩增

PCR扩增S-ECD序列：以质粒pUC57-SARS-CoV 2 S为模板

PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板

以PCR产物S-ECD和Ferritin为模板，Overlap-PCR扩增出S ECD-Ferritin

PCR扩增S-S1序列：以质粒pUC57-SARS-CoV 2 S为模板

PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板，

以PCR产物S-S1亚基和Ferritin为模板，Overlap-PCR扩增出S S1-Ferritin

PCR扩增S RBD序列：以质粒pUC57-SARS-CoV 2 S为模板

PCR扩增Ferritin序列：以pUC57-Ferritin为模板，

以PCR产物S RBD和Ferritin为模板，Overlap-PCR扩增出S RBD-Ferritin

4新冠病毒和铁蛋白融合蛋白的编码基因优化后序列的PCR扩增

用融合PCR技术将新冠病毒和铁蛋白进行融合构建。

4.1大肠杆菌表达质粒的PCR扩增

S ECD-Ferritin-O(SEQ ID NO.3)融合PCR引物：

S ECD PCR引物：

F3：5’-CGGGATCCGCCAAC

R3：5’-TTGATGATGTCACCACCGCTCGGCCACTTAATGTATTGTT-3’

Ferritin PCR引物：

F4：5’-

R4：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTACGGCT-3’

Over-lapPCR引物：

F3：5’-GGATCCGCCAAC

R4：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTACGGCT-3’

S S1-Ferritin-O(SEQ ID NO.6)融合PCR引物：

S S1 PCR引物：

F3：5’-CGGGATCCGCCAAC

R3：5’-TTGATGATGTCACCACCGCTCGGCCACTTAATGTATTGTT-3’

Ferritin PCR引物：

F4：5’-

R4：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTACGGCT-3’

Over-lapPCR引物：

F3：5’-GGATCCGCCAAC

R4：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTACGGCT-3’

S RBD-Ferritin-O(SEQ ID NO.9)融合PCR引物：

S RBD PCR引物：

F3：5’-CGGGATCCGCCAAC

R3：5’-TTGATGATGTCACCACCGCTCGGCCACTTAATGTATTGTT-3’

Ferritin PCR引物：

F4：5’-

R4：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTACGGCT-3’

Over-lapPCR引物：

F3：5’-GGATCCGCCAAC

R4：5’-CGGAATTCTTAGCTCTTACGGCT-3’

5 S ECD-Ferritin-O，S S1-Ferritin-O，S RBD-Ferritin-O氨基酸序列单、双位点突变体基因的构建

本发明以S ECD-Ferritin-O(SEQ ID NO.3)，S S1-Ferritin-O(SEQ ID NO.6)，SRBD-Ferritin-O(SEQ ID NO.9)基因序列为模板，设计多对引物对优化序列进行定点突变，定点突变是利用融合PCR的方法进行，利用点突变试剂盒进行融合PCR实验。

突变位点分别为将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列分别按照F70N,G100L,Q126T,Q145R,T178D,L200S,L240T,T270E,T285D,T326P,T344A,Y362E,Y380E,D400S,R419M,I445F,R465K,A486C,,F501A或H530K所示的单位点突变方式进行突变，所得突变体命名为S ECD-Ferritin-O-M、S S1-Ferritin-O-M(F70N,G100L,Q126T,Q145R,T178D,L200S,L240T,T270E,T285D,T326P,T344A,Y362E,Y380E,D400S,R419M,I445F,R465K,A486C,,F501A或H530K)；将SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列按照T344A,Y362E，Y380E,D400S,R419M,I445F,R465K,A486C,,F501A或H530K所述的单位点突变方式进行突变，所得突变体命名为S RBD-Ferritin-O-M(T344A,Y362E，Y380E,D400S,R419M,I445F,R465K,A486C,F501A或H530K)。

在此基础上，本发明将6种单突变位点(T344A,Y380E,D400S,R419M,R465K，F501A)两两组合进行双位点突变，双位点突变是在单位点突变序列的基础之上，以其(S ECD-Ferritin-O-M，S S1-Ferritin-O-M，S RBD-Ferritin-O-M)作为模板，利用相应的引物，通过融合PCR的方法进行第二位的定点突变，从而获得双位点突变的目的片段，利用点突变试剂盒进行融合PCR实验。

双突变位点为共15种组合：T334A-Y380E，T334A-D400S，T334A-R419M，T334A-R465K，T334A-F501A，Y380E-D400S，Y380E-R419M，Y380E-R465K，Y380E-F501A，D400S-R419M，D400S-R465K，D400S-F501A，R419M-R465K，R419M-F501A，R465K-F501A；所获得的突变体命名为S ECD-Ferritin-O-D，S S1-Ferritin-O-D，S RBD-Ferritin-O-D(T334A-Y380E，T334A-D400S，T334A-R419M，T334A-R465K，T334A-R465K，T334A-F501A，Y380E-D400S，Y380E-R419M，Y380E-R465K，Y380E-F501A，D400S-R419M，D400S-R465K，D400S-F501A，R419M-R465K，R419M-F501A或R465K-F501A)突变体。

本发明将上述原始序列以及突变优化序列在大肠杆菌表达系统中进行表达。

S ECD-Ferritin-C-O、S S1-Ferritin-C-O、S RBD-Ferritin-C-O进行氨基酸单位点、双位点所需引物：

S ECD-Ferritin-C-O、S S1-Ferritin-C-O、S RBD-Ferritin-C-O：

(1)两侧上下游引物：

F3：GGATCCGCCAAC

R4：GAATTCTTAGCTCTTACGGCTTTTAG

(2)中间上下游引物：

F：GAACCAGGTAACGTTGCTGTTGAACGGCAGGAACAGGTCCT

R：

F：GGTGCTCGCGAAGTAAACACGATCGTTGAACGGCAGCAC

R：

F：GTTAACGATCAGCAGGCTGGTGGTCTTGCTGTCCAGGGT

R：

F：GAACGGATCGTTGCAGAAACGGAACTCGCACACTTTAAT

R：

F：CTGGCTCACGTACTCGAAGTCGCAGTTGTTCGCGCTGCT

R：

F：CTTGAACACGAACTCACGGCTGTTCTTGAAGTTGCCTTG

R：

F：GATGTTAATGCCGATCGGGGTGTCAACCAGCGGCTCCAG

R：

F：GTACGCAGCCGCGCCAGCCTCCCAACCGCTGCTGCTGTC

R：

F：GTTGTACTTCAGCAGGAAGTCACGCGGTTGCAGGTAACC

R：

10.

F：TTGCACACGGAAGTTGCTCGGCTGGTAAATACCTTTCTC

R：

11.

F：GCCGAACGGGCACAGGTTCGCGATGTTCGGGAAACGAAC

R：

12.

F：ACGCTTACGGTTCCAAGCCTCCACGCTCGCGAAACGGGT

R：

13.

F：GCTGAAGCTAGCGCTGTTCTCCAGCACGCTGTAGTCCGC

R：

14.

F：AACGTTGGTGAAGCACAGGCTGTTCAGCTTGGTCGGGCT

R：

15.

F：TTGACCCGGCGCGATCTGCATAACTTCGTCGCCACGAAT

R：

16.

F：GTTGTTGCTGTTCCACGCGAAAACGCAACCGGTGAAATC

R：

17.

F：GTTGCTTTTACGGAACAGCTTGTACAGGTAGTTGTAGTT

R：

18.

F：GTTGCACGGGGTGCTACCACACTGGTAGATTTCGGTGCT

R：

19.

F：GCCGTAGCTTTGCAGCGGCGCGTAGCAGTTGAAGCCCTC

R：

20.

F：GCACACGGTAGCCGGAGCCTTCAGCAGTTCGAAGCTCAG

R：

利用点突变试剂盒进行点突变实验。

6玻璃奶纯化回收DNA片段

配置1％(w/v)琼脂糖凝胶，对PCR扩增的产物进行电泳；将琼脂糖凝胶置于紫外灯下，快速切下含有单一的目的核酸条带的凝胶，放入1.5mL的离心管中，称重，加三倍体积的6M NaI，放于37℃恒温培养箱中融化；向已经完全融化的溶液中加8μL Glassmilk，混匀，冰浴5min，中间摇匀两次；8000rpm离心10s，弃掉上清；加800μL New Wash洗涤，轻轻弹起后离心，重复2次；弃去上清，将离心管放37℃恒温培养箱干燥2～3min；干燥后加20μL 0.1×TE溶解，混合充分溶解DNA，12000rpm离心5min，取上清立即用于连接，其余放-20℃保存。

7目的基因PCR产物酶切处理

将PCR产物跑胶，胶回收正确的产物用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行双酶切反应获得目的片段S ECD-Ferritin,S S1-Ferritin,S RBD-Ferritin。酶切体系如下所示：

载体5μL，10×Buffer E 5μL，BamH I 1μL，EcoR Ⅰ 1μL，ddH

8感受态细胞的小量制备

制备大肠杆菌Top10感受态细胞，－80℃保存。

9目的基因与pET-28a(+)载体和pVL1393载体的连接与转化

9.1酶切处理pET-28a(+)和pVL1393载体

用限制性内切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ对转移载体pVL1393和pET-28a(+)进行双酶切，65℃灭活20min，保存于－20℃备用。

9.2连接

酶切回收的目的片段与经BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切处理后的转移载体pVL1393和pET-28a(+)的连接。用T

回收目的片段7μL，载体1μL，10×Buffer 1μL，T

9.3转化

取-80℃保存的感受态细胞，快速融化一半，加入上述连接产物3μL，冰上放置半小时；42℃恒温水浴锅中放置90s，迅速置于冰上3～5min；向管中加入适量的1mL LB培养基，37℃恒温培养箱中静置培养60min；离心，弃去大部分上清，留200μL涂布于LB平板(100μg/mL Amp)上，37℃恒温培养箱正置培养30min，后倒置培养过夜。

10核酸快速抽提法粗筛阳性克隆

挑取LB平板上的单菌落，接种于LB液体培养基(100μg/mL Amp)中，置于37℃恒温震荡培养器中，设置转速为220rpm，过夜培养；取500μL菌液于离心管内，收集菌体；加入30μL Loading Buffer和20μL酚/氯仿(1:1)，用涡旋震荡器充分混匀，使菌体重悬；12000rpm离心3min，取8μL上清进行琼脂糖凝胶电泳，同时以同样方法处理的空载体作为对照。凝胶成像系统的紫外灯下观察条带，选取质粒带明显退后的菌液提取质粒。

11 SDS碱裂解法提取质粒DNA

收集3mL菌液于离心管中，SDS碱裂解法提取质粒DNA，-20℃保存备用。

12阳性克隆的酶切与测序鉴定

酶切体系如下所示：

重组质粒DNA 3μL，10×Buffer E 3μL，BamH I 0.5μL，EcoR Ⅰ 0.5μL，ddH2O 14μL，共20μL。

37℃反应2h后，取7μL用1％的琼脂糖进行电泳检测。酶切检测正确的质粒DNA测序，结果和目的基因一致，得到的重组质粒命名为pET28a-S ECD-Ferritin,pET28a-S S1-Ferritin,pET28a-S RBD-Ferritin。

13重组质粒的表达与纯化

13.1重组质粒在大肠杆菌中诱导表达

将鉴定正确的重组表达质粒pET28a-S ECD-Ferritin,pET28a-S S1-Ferritin,pET28a-S RBD-Ferritin转化BL21感受态细胞，在37℃，IPTG终浓度为0.5mM的条件下，分别诱导1h、2h、3h、4h、5h后收集菌液，用SDS-PAGE电泳分析表达情况，pET28a-S ECD-Ferritin在约158kD处出现了特异条带，pET28a-S S1-Ferritin在约100kD处出现了特异条带,pET28a-S RBD-Ferritin在约51kD处出现了特异条带,这与预期的带His的重组蛋白大小相符，而未诱导的重组表达载体没有产生该特异条带，表明融合蛋白在大肠杆菌内成功表达，在添加IPTG后1～4h，表达量逐渐增加，而诱导5h和诱导4h的多积累的重组蛋白几乎一样多。用超声波将菌体细胞破碎，发现上清有少量目的蛋白，沉淀中有明显目的条带，说明重组蛋白His-S ECD-Ferritin,His-S S1-Ferritin,His-S RBD-Ferritin主要以不可溶的包涵体形式存在，聚丙烯凝胶电泳图见图1。

13.2重组蛋白的大量表达与包涵体蛋白样品的处理

将保存于-80℃表达量高的菌种划线，37℃培养过夜，挑取单菌落接种于4mL LB液体培养基(50μg/mL Kan)中，37℃培养过夜；1％的菌液转接于200mL含的LB液体培养基(50μg/mL Kan)中，37℃震荡培养，使OD值达0.6左右，加入IPTG(终浓度为0.5mM)，37℃继续培养4h；4℃，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌ddH

13.3镍柱亲和层析纯化重组蛋白

取上述溶解过夜的包涵体溶液，4℃，12000rpm离心15min，取上清，用0.45μm膜过滤；用Ni-NTA树脂层析柱纯化该表达蛋白，在脲NTA-25、脲NTA-50、脲NTA-100、脲NTA-250、脲NTA-500，5个梯度收集洗脱液，收集穿透液、洗脱液，每管收集一个NTA体积，SDS-PAGE分析确定蛋白质的结合情况、目标蛋白在洗脱液中的分布情况。蛋白电泳显示His-S ECD-Ferritin、His-S S1-Ferritin在250mM咪唑浓度洗脱下来的蛋白最多，His-S RBD-Ferritin在50mM咪唑浓度洗脱下来的蛋白最多。纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，观察大小正确，条带单一的蛋白带。

13.4多克隆抗体的制备

将纯化后的His-Ferritin蛋白定量后收集1.5mg蛋白，经SDS-PAGE电泳后切下含有目的蛋白的凝胶，尽量切碎，37℃烘干后研磨成粉末，用生理盐水将抗原蛋白稀释到2倍最终浓度，充分混合佐剂，无菌条件下取出所需用量与抗原蛋白按体积比1：1迅速混匀，通过后腿小腿肌肉注射免疫小鼠，两免之后收集全部血清，测定血清的抗体效价。

14 Western blotting检测

将相应的重组表达产物，进行SDS-PAGE凝胶电泳，浓缩胶为5％，分离胶浓度为15％，再用半干转法，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用PBST配制3％BSA封闭，原核表达的His-Ferritin、His-Ferritin蛋白免疫小鼠后的血清为一抗(1:1000稀释)，HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗(1:5000稀释)，最后用DAB(二氨基联苯胺)显色，后用去离子水终止，检测结果。Western blotting结果表明，重组表达产物可检测到158kDa(S ECD-Ferritin)、100kDa(S S1-Ferritin)、51kDa(S RBD-Ferritin)大小的特异性条带。

15 ELISA检测：

将待检样品用包被液适度倍比稀释，另设阴性对照，只加包被液作为空白对照，每孔加100μL于酶标板中，4℃过夜。快速弃掉孔内液体，用PBST洗3次。每孔加300μL3％BSA封闭液，37℃作用3h，用PBST洗涤3次。将实验室自制His-Ferritin多克隆抗体稀释1：1000，每孔加100μL，37℃作用1.5h，用PBST洗4次。每孔加100μLHRP标记的羊抗鼠(1：5000)，37℃温育45～60min，用PBST洗涤4次。再加入新鲜配置的OPD(邻苯二胺)显色液100μL，室温，暗处显色10～30min。于各反应孔中加入2M硫酸50μL终止反应。在酶标仪上用492nm处波长测定OD值，以空白对照孔调零后测各孔OD值，以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性。

表1 S ECD-Ferritin，S S1-Ferritin，S RBD-Ferritin原始序列表达产物ELISA效价

ELISA结果判定：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性。

表1为S ECD-Ferritin，S S1-Ferritin，S RBD-Ferritin原始基因序列表达产物所测实验数据。实验结果表明S ECD-Ferritin，S S1-Ferritin，S RBD-Ferritin基因表达产物ELISA效价分别为1：128；1：64；1：32。

表2 S ECD-Ferritin-O，S S1-Ferritin-O，S RBD-Ferritin-O基因表达产物ELISA效价

ELISA结果判定：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性。

表2为S ECD-Ferritin，S S1-Ferritin，S RBD-Ferritin优化基因序列表达产物所测实验数据。实验结果表明S ECD-Ferritin-O，S S1-Ferritin-O，S RBD-Ferritin-O基因表达产物ELISA效价分别为1：256；1：128；1：64。

表3 S ECD-Ferritin-O-M突变体表达产物的ELISA效价

表4 S S1-Ferritin-O-M突变体表达产物的ELISA效价

表5 S RBD-Ferritin-O-M突变体表达产物的ELISA效价

ELISA结果判定标准：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性。虽然S ECD-Ferritin-O-M、S S1-Ferritin-O-M、S RBD-Ferritin-O-M最高的ELISA值在为640、480、320左右，因为本实验是用阈值和稀释倍数作为定量指标的，具体的样本的量因为P/N值的大小不同，还是有所差别的。

根据表3-表5数据和前面的表达量及可溶性表达量的数据可以看出，在优化序列的基础上进行氨基酸单位点突变，所得突变体有六个单突变体(T344A、Y380E、D400S、R419M、R465K、F501A)的表达产物的表达量有了明显提高，同时其免疫效价也都提高，两者呈一定正相关。

根据以上实验结果可以得出进行单突变位点是有效的，因此本实验进一步选取了6个有明显效价提高的单突变位点两两组合进行双位点突变。

表6 S ECD-Ferritin-OD双突变体表达产物的ELISA效价

表7 S S1-Ferritin-OD双突变体表达产物的ELISA效价

表8 S RBD-Ferritin-OD双突变体表达产物的ELISA效价

从表6-8中数据看出在优化序列的基础上进行氨基酸双位点突变所得突变体中有三个双突变体(即：T334A-Y380E，Y380E-R419M，R419M-R465K)的表达量有了明显提高，同时相应的免疫效价也有提高，将Ferritin-O-Y380E-R419M这个突变认为是最优的突变，在后续的实验中加以应用，并以后缀OD命名，即：S ECD-Ferritin-OD，S S1-Ferritin-OD，SRBD-Ferritin-OD。

实施例2 S ECD-Ferritin-OD，S S1-Ferritin-OD，S RBD-Ferritin-OD突变序列的纳米颗粒疫苗的制备与效力检测

1重组蛋白在家蚕和昆虫细胞真核表达系统中表达与纯化

1.1家蚕核型多角体病毒亲本株BmBacmid的繁殖及病毒DNA的制备

将S ECD-Ferritin-OD，S S1-Ferritin-OD，S RBD-Ferritin-OD突变序列在家蚕真核表达系统中表达与纯化。

按AppliChem公司产品说明配制1×TC-100培养基，用2M NaOH将pH调至6.22，过滤除菌后的培养基补加10％胎牛血清，27℃下培养家蚕细胞BmN。用家蚕核型多角体病毒亲本株感染对数生长期的细胞约50mL，3～4d后收集病毒感染液，10000rpm离心10min，除去沉淀，上清用25000rpm离心1小时，除上清，用1mL病毒DNA抽提液(1L中含Tris 12.1g，EDTA33.6g，KCl 14.1g，pH 7.5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1.5mL离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50μg/mL，50℃保温2小时，再加入35％的Sarkorsel至终浓度为1％，继续于50℃保温2小时，用等体积的饱和酚、苯酚:氯仿(1:1)、氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10体积的3M NaCl，再加入2倍体积的无水乙醇，－20℃放置2小时以上沉淀病毒DNA，5000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100μLTE Buffer中，放4℃保存备用。

1.2重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(P

接种大约1×10

1.3重组病毒rBmBacmid(P

将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(P

1.4重组病毒的鉴定

利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上清150μL，加入150μL(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μL(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μL的TE溶解DNA。

取上述病毒基因组DNA 1μL进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min、94℃1min、58℃1min、72℃3min，30个循环，最后72℃延伸10min。取15μL反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。

1.5 S ECD-Ferritin-OD、S S1-Ferritin-OD或S RBD-Ferritin-OD在家蚕体和蚕蛹中的表达

所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的家蚕及结茧七天后平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×10

昆虫细胞表达系统的ACMNPV的相应的重组病毒获得参照家蚕的杆状病毒表达系统进行，只不过是亲本病毒和昆虫细胞系进行更换即可(AcBacmid DNA和SF细胞系)。

1.6 S ECD-Ferritin-OD、S S1-Ferritin-OD或S RBD-Ferritin-OD类病毒颗粒的收集与纯化

将含表达有目的基因的蚕蛹用预冷的PBS(料液比为1：9)在匀浆器中研磨后，用0.45um滤器过滤。在30％蔗糖溶液中，1.5×10

2 Western blotting检测

将重组病毒感染的家蚕血淋巴用PBS(pH 7.4)稀释10倍超声波破碎后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，浓缩胶为5％，分离胶浓度为15％，再用半干转法，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用PBST配制3％BSA封闭，原核表达的His-Ferritin、His-Ferritin蛋白免疫小鼠后的血清为一抗(1:1000稀释)，HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗(1:5000稀释)，最后用DAB(二氨基联苯胺)显色，后用去离子水终止，检测结果。Western blotting结果表明，在重组病毒感染后蚕血淋巴样品的上清液中可检测到154kDa(S ECD-Ferritin-OD)、96kDa(SS1-Ferritin-OD)、47kDa(S RBD-Ferritin-OD)大小的特异性条带。

3 ELISA检测

将待检蚕血淋巴样品用包被液适度倍比稀释，另设亲本病毒感染的蚕血样品做阴性对照，只加包被液作为空白对照，每孔加100μL于酶标板中，4℃过夜。快速弃掉孔内液体，用PBST洗3次。每孔加300μL3％BSA封闭液，37℃作用3h，用PBST洗涤3次。将实验室自制His-Ferritin多克隆抗体稀释1：1000，每孔加100μL，37℃作用1.5h，用PBST洗4次。每孔加100μLHRP标记的羊抗鼠(1：5000)，37℃温育45～60min，用PBST洗涤4次。再加入新鲜配置的OPD(邻苯二胺)显色液100μL，室温，暗处显色10～30min。于各反应孔中加入2M硫酸50μL终止反应。在酶标仪上用492nm处波长测定OD值，以空白对照孔调零后测各孔OD值，以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性。

4新冠假病毒的制备

根据GenBank中S蛋白的序列信息，合成SARS-CoV-2 S基因序列。同时参考文献(马建，贺鹏飞，赵晨燕等人，病毒学报，2019，35(02)：189-195)的制备方法。实验步骤如下：将S基因通过酶切、连接插入到质粒载体中。将SARS-CoV-2 S基因表达质粒与基于慢病毒骨架的含有增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的假病毒包装质粒共转染293T细胞，转染一定时间后，收集细胞培养上清，用0.45μm微量滤器过滤除去上清中可能残留的细胞，用于靶细胞感染。然后，进行假病毒感染性检测，将Vero E6细胞提前接种于96孔板。随后加入适量假病毒，混匀，置于细胞培养箱内，6h后吸出培养液，每孔加入完全DMEM培养液100μL。置于细胞培养箱内，18h后于荧光显微镜下观察细胞内是否出现绿色荧光，并用细胞成像及分析系统对EGFP阳性细胞进行计数，计算感染滴度。

5中和实验

参考文献(马建，贺鹏飞，赵晨燕等人，病毒学报，2019，35(02)：189-195)的实验方法。实验步骤大致如下：取待测小鼠血清稀释至一定浓度，并进行适度倍比稀释。加入一定滴度的假病毒液，混合后于37℃培养箱孵育1h。随后接种于96孔细胞培养板中，于37℃，5％CO

6结果鉴定

表9 SARS-CoV 2 S-Ferritin-OD在家蚕和AcMNPV-昆虫细胞表达系统中表达产物ELISA检测

ELISA结果判定：以P/N值(阳性孔OD值减去空白对照孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性；结果表明S ECD-Ferritin-OD基因表达产物ELISA效价可达1：2560；S S1-Ferritin-OD基因表达产物ELISA效价可达1：1024；S RBD-Ferritin-OD基因表达产物ELISA效价可达1：960。

S ECD-Ferritin-OD、S S1-Ferritin-OD、S RBD-Ferritin-OD突变体序列在AcMNPV-昆虫细胞表达系统中的表达产物检测的ELISA值代表每毫升昆虫细胞的表达量。

7电镜观察

用1mL注射器吸一定量的1％醋酸铀待用，用另一注射器吸一定数量的蒸馏水。将SECD-Ferritin-OD、S S1-Ferritin-OD、S RBD-Ferritin-OD纳米颗粒蚕血淋巴经过初步纯化后，用悬浮液稀释，将悬浮样品滴在封口膜上，使之形成一个小液珠，用镊子尖端夹住载网，并使带膜的一面朝下，沾取样品，而后用滤纸吸干，再洗去多余的悬浮物，清洗5次。吸干后，将载网摆在1％醋酸铀染液的液滴上，染色3分钟，用滤纸从铜网边缘吸干多余的染液，重复2-3次，待干燥后镜检。结果如图3所示，可见大小与预期符合的纳米颗粒，笼状体的直径为20-30纳米左右，仔细观察可见有天线状突出。

8动物实验

8.1将S ECD-Ferritin-OD，S S1-Ferritin-OD，S RBD-Ferritin-OD优化序列表达产物接种动物

将分析得出的最优序列S ECD-Ferritin-OD，S S1-Ferritin-OD，S RBD-Ferritin-OD的双突变序列在家蚕真核表达系统中表达所得蚕蛹，按照30μg/只的量给小鼠注射或口服。

制备方法为：称取相应量的表达S ECD-Ferritin-OD，S1-Ferritin-OD，S RBD-Ferritin-OD纳米颗粒抗原的蚕蛹，加入适量体积PBS缓冲液，搅拌器搅拌5～10min使其充分混匀，制备成母液放入灭菌瓶中。206佐剂事先灭菌后放到30℃保温箱中保温。适量的母液先放在冰上并进行调整，与佐剂混合时，先在15mL离心管中加佐剂3mL，慢慢滴加母液3mL，用匀浆器匀浆3min。加入盐酸环丙沙星，使用量为30～50mg/1kg小鼠体重。疫苗呈乳白色，检测疫苗质量时可取出少量，3000rpm离心15min，疫苗不分层即为合格。用同样的方法处理健康蚕蛹，制成疫苗做对照。

将分析得出的最优序列S ECD-Ferritin-OD，S S1-Ferritin-OD，S RBD-Ferritin-OD在AcBacmid-昆虫细胞真核表达系统中表达所得细胞沉淀，按照30μg单位/羽的量来注射小鼠。

制备方法：昆虫细胞表达的抗原按测定的制备疫苗所需的蛋白含量的细胞沉淀量经超声破碎后，混合相应的佐剂而成。

取SPF小鼠90只适应性饲养一周后，随机分为6组，每组10只，每10只小鼠分别通过尾部注射或口服S ECD-Ferritin-OD，S1-Ferritin-OD，S RBD-Ferritin-OD在家蚕真核表达系统中表达产物制备的疫苗1份(或5倍量左右的抗原进行口服)。10只接种健康蚕蛹制备的疫苗作为阴性蚕蛹免疫组，10只不做免疫处理作为正常对照组，10只接种传统疫苗株作为阴性对照。接种15天后，采用眼眶取血，采1mL左右，放试管中倾斜放置，37℃放置2h后，转至室温过夜。将血清转移至离心管中，2000rpmin，10min，收集血清，用新冠假病毒检测中和抗体效价。具体实验方法见上。

9中和抗体效价检测

具体实验步骤见上，21天时的中和抗体效价为最高，具体实验结果见表10。

表10 S ECD-Ferritin-OD，S S1-Ferritin-OD，S RBD-Ferritin-OD小鼠血清中和抗体效价(21天)

从表10中的数据可以看出，融合蛋白基因S ECD-Ferritin-OD，S S1-Ferritin-OD，S RBD-Ferritin-OD接种小鼠中所产生的中和抗体效价比健康蚕蛹对照和传统疫苗高。

实施例3 pVLCAG-S ECD-Ferritin-OD，pVLCAG-S S1-Ferritin-OD、pVLCAG-SRBD-Ferritin-OD杆状病毒哺乳动物表达用重组病毒的构建和动物实验

1构建pVLCAG载体

具体实验方法参照(张志芳，姚斌，李轶女等。在动物细胞或动物组织中表达外源基因的方法[P].中国：ZL 201210408558.4.)进行，构建向脊椎动物细胞或个体中呈递外源基因的重组杆状病毒转移载体。

2构建呈递报告基因的重组病毒

2.1将S ECD-Ferritin-OD、S S1-Ferritin-OD、S RBD-Ferritin-OD优化序列基因克隆到基因呈递转移载体上

将实施例2中带有酶切位点的S ECD-Ferritin-OD、S S1-Ferritin-OD、S RBD-Ferritin-OD优化突变序列基因片段酶切回收连接到同样酶切处理的pVLCAG载体，鉴定正确后获得pVLCAG-S ECD-Ferritin-OD、pVLCAG-S S1-Ferritin-OD、pVLCAG-S RBD-Ferritin-OD。

2.2构建基因呈递用的重组病毒并大量制备

用pVLCAG-S ECD-Ferritin-OD、pVLCAG-S S1-Ferritin-OD、pVLCAG-S RBD-Ferritin-OD转移载体用reBmBac共转染BmN细胞获得重组病毒Bm-CAG-S ECD-Ferritin-OD，Bm-CAG-S S1-Ferritin-OD，Bm-CAG-S RBD-Ferritin-OD在共转染过程中依然需要pVL1393-Luc作为对照来确定共转染的成功与否，病毒纯化过程同上。

用重组病毒感染5龄起家蚕幼虫，4-5d后收获蚕血淋巴其中含有大量扩增的重组病毒。

将蚕血淋巴用PBS稀释后超声破碎(10s×10次)，然后用12000rpm离心10分钟去除细胞碎片，再用15×10

3重组病毒在哺乳动物细胞中表达

采用VERO细胞作为基因呈递的目标，将重组病毒Bm-CAG-S ECD-Ferritin-OD，Bm-CAG-S S1-Ferritin-OD，Bm-CAG-S RBD-Ferritin-OD各取100MOI的病毒来进行研究。方法步骤如下：

1)在六孔板中接种上VERO细胞(1×10

2)取1×10

3)孵育后去掉含有病毒的培养基，换上正常的DMEM含血清培养基，42小时左右处理细胞，收集表达产物，ELISA检测效价1：640。

4利用重组病毒向小鼠体内呈递外源基因

向小鼠体内呈递S ECD-Ferritin-OD，S S1-Ferritin-OD，S RBD-Ferritin-OD基因

纯化的重组病毒Bm-CAG-S ECD-Ferritin-OD，Bm-CAG-S S1-Ferritin-OD，Bm-CAG-S RBD-Ferritin-OD通过尾静脉注射(1×10

5中和抗体效价检测

具体实验步骤见上，21天时的中和抗体效价为最高，具体效价检测结果见表11。

表11 S ECD-Ferritin-OD，S S1-Ferritin-OD，S RBD-Ferritin-OD小鼠血清中和抗体效价(21天)

从表11中的数据可以看出，融合蛋白基因S ECD-Ferritin-OD，S S1-Ferritin-OD，S RBD-Ferritin-OD呈递给小鼠中所产生的中和抗体效价比健康蚕蛹对照和传统疫苗高。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 新冠病毒S蛋白和铁蛋白亚基融合的纳米抗原颗粒、新冠疫苗及其制备方法

和应用

<130> BJ-2002-200805A

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1379

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 1

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala

675 680 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705 710 715 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

770 775 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785 790 795 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

980 985 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

995 1000 1005

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn

1010 1015 1020

Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys

1025 1030 1035

Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro

1040 1045 1050

Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val

1055 1060 1065

Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His

1070 1075 1080

Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn

1085 1090 1095

Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln

1100 1105 1110

Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val

1115 1120 1125

Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro

1130 1135 1140

Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn

1145 1150 1155

His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn

1160 1165 1170

Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

1175 1180 1185

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu

1190 1195 1200

Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Ser Gly Gly Asp Ile

1205 1210 1215

Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser

1220 1225 1230

Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu

1235 1240 1245

Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr

1250 1255 1260

Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val

1265 1270 1275

Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe Glu

1280 1285 1290

Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His

1295 1300 1305

Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile Lys Ser

1310 1315 1320

Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu

1325 1330 1335

Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile

1340 1345 1350

Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln

1355 1360 1365

Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser

1370 1375

<210> 2

<211> 4140

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 2

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240

aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300

ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420

ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660

tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720

ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840

gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800

ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860

cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920

aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980

gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040

cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100

gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160

agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220

tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280

acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340

gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400

aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460

ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520

cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580

ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640

acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700

caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760

aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820

acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880

acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940

ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000

cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060

tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120

gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180

gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240

atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300

cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360

tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420

ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480

tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540

aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600

caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ccggtggcga catcatcaag 3660

ctgctgaacg aacaggtgaa caaggagatg cagtccagca acctgtacat gtctatgtct 3720

tcatggtgct acacccactc actggacgga gctggtctgt tcctgttcga ccacgctgcc 3780

gaggaatacg aacacgccaa gaagctgatc atcttcctga acgagaacaa cgtgcctgtc 3840

cagctgacct ccatcagcgc tcccgaacac aagttcgagg gtctgactca aatcttccag 3900

aaggcctacg aacacgagca gcacatctct gaatcaatca acaacatcgt ggaccacgct 3960

atcaagagca aggaccacgc cactttcaac ttcctgcaat ggtacgtggc tgagcagcac 4020

gaggaagagg tcctgttcaa ggacatcctg gacaagatcg aactgatcgg caacgagaac 4080

cacggactgt acctggctga ccagtacgtc aagggcatcg ccaagtcccg caagagctaa 4140

<210> 3

<211> 4173

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 3

atgccgatgg gtagcctgca accgctggcg accttgtatc tgctgggtat gctggttgcg 60

tcctgtttgg gtcaatgtgt gaacttgacc acccgtaccc agctgccgcc ggcttacacc 120

aacagcttca cccgtggtgt gtactacccg gacaaggttt tccgtagcag cgtgctgcac 180

agcacccagg acctgttcct gccgttcttc agcaacgtta cctggttcca cgctatccac 240

gtgagcggta ccaacggcac caaacgtttc gacaacccgg tgctgccgtt caacgatggt 300

gtttacttcg cgagcaccga gaaaagcaac atcattcgtg gttggatttt cggcaccacc 360

ctggacagca agacccagag cctgctgatc gttaacaacg ctaccaacgt ggttattaaa 420

gtgtgcgagt tccaattctg caacgatccg ttcctgggcg tttactacca caaaaacaac 480

aagagctgga tggagagcga gttccgtgtt tacagcagcg cgaacaactg caccttcgag 540

tacgtgagcc agccgttcct gatggacctg gaaggtaaac aaggcaactt caagaacctg 600

cgtgagttcg tgttcaagaa cattgatggt tacttcaaaa tctacagcaa gcacaccccg 660

atcaacctgg ttcgtgacct gccgcagggt tttagcgctc tggagccgct ggttgacctg 720

ccgatcggca ttaacatcac ccgtttccaa accctgctgg ctctgcaccg tagctacctg 780

acgccgggtg acagcagcag cggttggacc gctggcgcgg ctgcgtacta cgttggttac 840

ctgcaaccgc gtaccttcct gctgaagtac aacgaaaacg gcaccatcac cgacgctgtt 900

gattgcgcgc tggacccgct gagcgaaacc aaatgcaccc tgaagagctt caccgtggag 960

aaaggtattt accagaccag caacttccgt gtgcaaccga ccgaaagcat tgttcgtttc 1020

ccgaacatca ccaacctgtg cccgttcggc gaggttttca acgctacccg tttcgcgagc 1080

gtgtacgctt ggaaccgtaa gcgtatcagc aactgcgttg cggactacag cgtgctgtac 1140

aacagcgcta gcttcagcac cttcaaatgc tacggtgtga gcccgaccaa gctgaacgat 1200

ctgtgcttca ccaacgttta cgctgatagc ttcgtgattc gtggcgacga agttcgtcag 1260

atcgcgccgg gtcaaaccgg caaaattgct gactacaact acaagctgcc ggacgatttc 1320

accggttgcg ttattgcgtg gaacagcaac aacctggata gcaaagtggg tggcaactac 1380

aactacctgt accgtctgtt ccgtaaaagc aacctgaagc cgttcgagcg tgacattagc 1440

accgaaatct accaggctgg tagcaccccg tgcaacggtg ttgagggctt caactgctac 1500

ttcccgctgc aaagctacgg cttccaaccg accaacggtg tgggctacca accgtaccgt 1560

gtggttgtgc tgagcttcga actgctgcat gctccggcta ccgtgtgcgg tccgaaaaag 1620

agcaccaacc tggttaaaaa caagtgcgtg aacttcaact tcaacggcct gaccggtacc 1680

ggcgttctga ccgagagcaa caaaaagttc ctgccgttcc agcaattcgg tcgtgacatc 1740

gcggatacca ccgatgctgt gcgtgacccg cagaccctgg aaattctgga catcaccccg 1800

tgcagcttcg gtggcgttag cgtgatcacg ccgggtacca acaccagcaa ccaggttgcg 1860

gtgctgtacc aagacgttaa ctgcaccgaa gttccggtgg ctattcacgc ggatcagctg 1920

accccgacct ggcgtgtgta cagcaccggt agcaacgttt tccaaacccg tgcgggttgc 1980

ctgattggtg ctgagcacgt gaacaacagc tacgaatgcg acattccgat cggtgcgggc 2040

atttgcgcta gctaccagac ccaaaccaac agcccgcgtc gtgcgaacag cgttgctagc 2100

caaagcatca ttgcgtacac catgagcctg ggtgcggaaa acagcgtggc ttacagcaac 2160

aacagcattg ctatcccgac caacttcacc attagcgtga ccaccgagat cctgccggtt 2220

agcatgacca agaccagcgt ggactgcacc atgtacatct gcggcgatag caccgaatgc 2280

agcaacctgc tgctgcaata cggtagcttc tgcacccaac tgaaccgtgc gctgaccggc 2340

attgctgttg agcaggacaa gaacacccaa gaagttttcg cgcaggtgaa acaaatttac 2400

aagaccccgc cgatcaaaga cttcggtggc ttcaacttca gccagatcct gccggacccg 2460

agcaaaccga gcaagaacag cttcattgag gacctgctgt tcaacaaagt taccctggct 2520

gatgcgggtt tcatcaagca gtacggtgac tgcctgggcg acattgctgc gcgtgacctg 2580

atctgcgcgc aaaaattcaa tggcctgacc gtgctgccgc cgctgctgac cgatgaaatg 2640

atcgctcagt acaccagcgc tctgctggcg ggtaccatta ccagcggttg gacctttggt 2700

gctggtgctg ctctgcaaat cccgtttgct atgcaaatgg cttaccgttt caacggtatt 2760

ggcgttaccc aaaacgtgct gtacgagaac cagaaactga tcgcgaacca attcaacagc 2820

gctattggta aaatccagga tagcctgagc agcaccgcta gcgctctggg caagctgcaa 2880

gatgttgtga accagaacgc tcaagcgctg aacaccctgg ttaaacagct gagcagcaac 2940

ttcggtgcga ttagcagcgt gctgaacgac atcctgagcc gtctggacaa ggttgaggct 3000

gaagtgcaaa ttgaccgtct gatcaccggt cgtctgcaaa gcctgcaaac ctacgtgacc 3060

cagcaactga ttcgtgctgc ggaaatccgt gctagcgcga acctggctgc gaccaaaatg 3120

agcgagtgcg ttctgggtca gagcaaacgt gtggacttct gcggtaaagg ctaccacctg 3180

atgagcttcc cgcagagcgc gccgcacggt gttgtgttcc tgcacgttac ctacgtgccg 3240

gctcaagaaa agaacttcac caccgctccg gcgatctgcc acgatggtaa agcgcacttc 3300

ccgcgtgaag gtgttttcgt gagcaacggc acccactggt tcgttaccca gcgtaacttc 3360

tacgagccgc aaatcattac caccgacaac accttcgtga gcggtaactg cgatgttgtg 3420

attggcatcg ttaacaacac cgtgtacgac ccgctgcaac cggagctgga cagcttcaaa 3480

gaagagctgg ataaatactt caagaaccac accagcccgg acgttgatct gggtgacatt 3540

agcggcatca acgcgagcgt tgtgaacatt caaaaagaga tcgaccgtct gaacgaagtg 3600

gctaagaacc tgaacgaaag cctgatcgac ctgcaagagc tgggtaaata cgaacaatac 3660

attaagtggc cgagcggtgg tgacatcatc aaactgctga acgagcaggt taacaaggaa 3720

atgcaaagca gcaacctgta catgagcatg agcagctggt gctataccca tagcctggat 3780

ggtgctggcc tgttcctgtt cgatcacgct gcggaagagt acgaacacgc taaaaagctg 3840

atcattttcc tgaacgagaa caacgttccg gtgcagctga ccagcatcag cgctccggag 3900

cacaaattcg aaggtctgac ccaaatcttc caaaaggctt acgagcacga acaacacatt 3960

agcgagagca ttaacaacat cgtggaccac gcgatcaaaa gcaaggatca cgctaccttc 4020

aacttcctgc aatggtacgt ggcggaacaa cacgaagagg aagtgctgtt caaagatatt 4080

ctggacaaga ttgagctgat cggtaacgaa aatcatggtc tgtatctggc ggatcagtat 4140

gtgaaaggca tcgctaaaag ccgtaagagc taa 4173

<210> 4

<211> 851

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 4

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Gly Gly

675 680 685

Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser

690 695 700

Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu

705 710 715 720

Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu

725 730 735

His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val

740 745 750

Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr

755 760 765

Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser

770 775 780

Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr

785 790 795 800

Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val

805 810 815

Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn

820 825 830

His Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser

835 840 845

Arg Lys Ser

850

<210> 5

<211> 2556

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 5