一种血清中降钙素原的定值方法

摘要

本发明公开了一种血清中降钙素原的定值方法，包括以下步骤：(1)血清降钙素原(PCT)的纯化富集；(2)降钙素原纯度检测；(3)酶切；(4)降钙素原定量分析。本发明方法使用LC‑MS/MS方法对血清PCT进行定值，原理是通过特征肽段的浓度推算出蛋白质的浓度，而肽段的浓度可以根据液质分析MRM模式谱图的峰面积表示，选用3条肽段计算PCT浓度，以3者平均值定值。在通常实验中，蛋白质的提取率、酶切效率、仪器的稳定性、实验误差等都会影响蛋白质的定量，而本发明方法在样品中添加等量的内标——标记肽段，可以消除以上误差，得到血清样品中PCT的浓度。

说明书

技术领域

本发明涉及检验检测技术领域，特别是涉及蛋白含量的分析、测试、诊断监测、检验、检测、计量等领域，具体涉及一种血清中降钙素原的定值方法。

背景技术

降钙素原(PCT)是一种甲状腺C细胞产生的内源性激素，由116个氨基酸组成的，结构上包括降钙蛋白、降钙素和N端残基片段三部分，是一种重要的炎症诊断标志物。PCT现多用于全身严重细菌感染、肺炎和脓毒症的监测，以及指导临床抗生素的合理应用。常用的检测方法有免疫层析方法、电化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附法和乳胶免疫比浊法等。但是由于各厂家针对不同的目标物开发方法和试剂，造成测量的偏差很大。因此，亟需研制出PCT的参考物质和参考测量方法。

至今国际上仍没有公认的PCT参考物质，制备厂商只能自行建立“自用”的一级校准品，为公司的产品校准品定值。国际临床化学和检验医学联合会(The InternationalFederation of Clinical Chemistry，IFCC)的科学部于2018年成立了PCT标准化工作组，来推动PCT实验室检测的全球标准化。德国B·R·A·H·M·S(2009年被Thermo FisherScientific收购)是最早进行PCT临床检测试剂盒研发的公司。为了使公司的PCT试剂盒确保对患者样品检测结果的持续可靠，B·R·A·H·M·S自行研制了PCT的一级校准品PTN47。PTN47是一个合成多肽，仅47个氨基酸组成，这个多肽是完整降钙素原蛋白的一部分。B·R·A·H·M·S声明该标准可代表完整PCT分子。标准被称为“Urstandard PTN47”，意即“金标准”。需要注意的是，使用PTN47作为一级校准品以及以后的产品校准品，均只用于B·R·A·H·M·S的第一代LUMI test PCT产品。之后，B·R·A·H·M·S以基因重组技术制备，通过N-端氨基酸序列(Edman降解方法)和质谱分析确定纯度和含量，研制出了第二代一级校准品PCT115，它是含有115个氨基酸的多肽，即为新的“金标准”物质。以上“金标准”物质虽然是目前广泛使用的校准品，但其本质属于制造商校准物，不具有可溯源性，无法溯源至SI单位，不可用作PCT参考物质。

同位素稀释质谱法(ID-LC-MS/MS)具有灵敏度高、定量测量准确性高、重复性好的特点，是一种权威的定量方法，被广泛应用于蛋白和肽段的含量测定。ID-LC-MS/MS采用高阶同位素稀释标记，将分析结果的可追溯性与天然同位素组成的标准联系起来，天然同位素组成的纯度标准物质可以通过商业途径获得，要求具有适合国际认证实验室的纯度，将分析数据的可追溯性建立在内标物纯度的基础上。此方法不仅可以利用串联质谱对组分的分子量进行准确定值，对于目标分析物的选择性和特异性也明显提高，还可以将检测结果进行溯源，是对蛋白质检测参考方法建立的重要手段之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种血清中降钙素原的定值方法，可以高效、简便、可靠的对血清中降钙素原进行定值，为PCT的参考测量程序提供参考。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

一种血清中降钙素原的定值方法，包括以下步骤：

(1)血清降钙素原的纯化富集：将磁珠活化，按比例加入抗体，制备磁珠抗体复合物。在血清样品中加入一定量的磁珠抗体复合物，孵育洗涤；用乙酸水溶液将磁珠上结合的PCT洗脱下来，-20℃保存使用。

(2)降钙素原纯度检测：用SDS-Page电泳法和液相色谱法检测纯度。

(3)酶切肽段FK、DR、AR：磁珠上洗脱的PCT溶液在真空干燥箱4℃蒸干，加入少量的去离子水复溶；95℃水浴下高温变性15min；加入50nM碳酸氢铵溶液调节pH值；按比例加入一定量的胰蛋白酶溶液，并加入等量的标记肽段溶液，于37℃进行酶切反应；加入0.1％甲酸终止反应；得到酶切肽段FK、DR、AR。

(4)降钙素原定量分析：选用3条肽段FK、DR、AR计算降钙素原浓度，所述肽段FK序列为FHTFPQTAIGVGAPGK、DR序列为DMSSDLER、AR序列为ASELEQEQER，如SEQ ID NO：1-3所示；配制选定肽段的高低标溶液，将其和酶切好的样品一同进质谱，肽段的浓度根据液质分析MRM模式谱图中待测肽段和添加的同位素标记待测肽段的峰面积比计算，通过肽段的浓度推算出降钙素原的浓度，以3者平均值定值；

根据肽段FK浓度计算PCT浓度，计算公式如下：

根据肽段DR浓度计算PCT浓度，计算公式如下：

根据肽段AR浓度计算PCT浓度，计算公式如下：

式中：c

其中，步骤(1)具体为，将磁珠活化，按照每毫克微珠至多偶联10μg抗体的比例，加入过量的抗体溶液，制备磁珠抗体复合物；所述磁珠为含有羧酸键的环氧树脂磁珠。

取血清样品于1.5mL的离心管中；加入一定量的磁珠抗体复合物，室温旋转孵育1h，使血清中的降钙素原结合到磁珠抗体复合物上，弃上清；用800μL的PBS缓冲液洗涤磁珠3次；室温下加入体积分数5％的乙酸水溶液(pH＝1.88)将磁珠上结合的降钙素原洗脱下来，洗脱时间为1h；用磁珠分离器吸附磁珠，收集洗脱下来的溶液，-20℃保存使用。

其中，SDS-Page电泳法具体为，在PCT溶液中加入适量溴酚蓝混匀，95℃加热10min；泳道中加入Marker和样品，电压调到80V；之后将胶块用考马斯亮蓝染色，20min后用洗脱液反复洗脱，直至能看到条带。

液相色谱法具体为，将PCT样品进高效液相色谱，查看色谱图中是否有杂峰；色谱柱为：bioZen 

同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

(1)本发明方法将PCT的单克隆抗体结合到磁珠(含有羧酸键的环氧树脂磁珠)上，通过免疫吸附的方式提取纯化血清中的PCT，经胰蛋白酶酶切后，用液相色谱串联质谱的方法(LC-MS/MS)对其进行定量分析。

(2)在通常实验中，蛋白质的提取率、酶切效率、仪器的稳定性、实验误差等都会影响蛋白质的定量。而本发明方法在样品中添加等量的内标——标记肽段，可以消除以上误差，得到血清样品中PCT的浓度。

(3)本发明方法是一种高效、简便、可靠的测量方法，可为其他血清样品中蛋白质的定值提供参考。

(4)本发明方法适用于复杂血清基质中降钙素原的准确定量，利用免疫磁珠富集复杂血清基质中的降钙素原，并通过同位素稀释质谱法对富集后的降钙素原定量。此方法可实现对血清PCT的准确定量，并溯源至氨基酸标准物质，可作为PCT的候选参考测量程序。

下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的血清中降钙素原的定值方法作进一步说明。

附图说明

图1为SDS-page电泳图；

图2为PCT的液相色谱图；

图3为不同酶切时间和胰蛋白酶用量时的未标记肽段和标记肽段峰面积比变化曲线；

图4为PCT特征肽段液相检测结果，分别为(a)FK，(b)L-FK，(c)DR，(d)L-DR，(e)AR和(f)L-AR。

具体实施方式

试剂：

乙腈购自德国Merck公司产品；

超纯水由Millipore纯水系统纯化；

乙酸购自美国Sigma-Aldirich公司；

甲酸购自美国Fisher Scientific公司；

胰蛋白酶购自美国Promega公司；

磁珠购自Invitrogen公司，为含有羧酸键的环氧树脂磁珠；

FK、DR、AR、L-FK、L-DR、L-AR由南京金斯瑞生物科技有限公司合成(使用MALDI-TOF-MS对酶切后的PCT进行分析，选择质谱响应高、能够分开的三条肽段FK、DR、AR；L-FK、L-DR、L-AR为这三条肽段的同位素标记肽段)。

人血清样品由北京航天总医院制备。

仪器：

液相色谱质谱联用仪：Agilent 6410三重四级杆质谱，美国安捷伦公司；

移液器：德国Eppendorf Research公司；

天平：ME235S型，最小分度值0.01mg，德国Satorius公司；

天平：XP26型，最小分度值0.001mg，瑞典Mettler Toledo公司；

生化分析仪：日立7180。

一种血清中降钙素原的定值方法，包括以下步骤：

(1)血清样品制备

PCT在正常人体中的含量一般小于50pg/mL，高浓度的血清样本收集困难，且现有免疫检测方法误差较大，很难确定其中PCT的准确含量。因此，本方法由收集到的空白血清样本添加确定浓度的PCT纯品得到高纯度的PCT血清样本。添加之后的血清样本中PCT浓度为4μg/g。

(2)血清降钙素原(PCT)的纯化富集

通过磁珠亲和纯化作用对血清中的降钙素原进行提取，其原理是磁珠上的羧酸键可与含有氨基的蛋白反应，也就是磁珠与PCT的单克隆抗体结合，再利用抗原-抗体结合的原理，将血清中的PCT提取出来。

具体为：将磁珠活化，按照每毫克微珠最多偶联10μg抗体的比例，加入过量的抗体溶液，制备磁珠抗体复合物；取血清样品于1.5mL的离心管中；加入一定量的磁珠抗体复合物，室温旋转孵育1h，使血清中的降钙素原结合到磁珠抗体上，弃上清(用于后续生化分析仪检测磁珠提取后血清PCT的含量)；用800μL的PBS缓冲液洗涤磁珠3次；室温下加入体积分数5％的乙酸水溶液(pH＝1.88)将磁珠上结合的降钙素原洗脱下来，洗脱时间为1h；用磁珠分离器吸附磁珠，收集洗脱下来的溶液，-20℃保存使用。

(3)磁珠富集效率考察

在步骤(2)中，用磁珠抗体复合物提取血清中的PCT，收集弃去的血清，用生化分析仪检测其PCT浓度，得到磁珠提取效率。

磁珠富集效率：磁珠的富集效率是测量偏差的潜在来源，必须进行适当的评估。如果单克隆抗体特异性结合不同形式的PCT，或如果有基质效应，阻碍磁珠抗体复合物捕获PCT，所获取的PCT经磁珠富集纯化得到的量将不能反应实际血清中的含量。因此在磁珠富集纯化前后都对血清PCT进行检测。结果如表1所示：

表1血清上清液检测结果

富集后的血清上清液中PCT含量较低，因此证明复合物过量的条件下富集效果良好，四种浓度样品富集效率分别为99.97％、99.87％、99.94％、99.62％，证明制备的抗体-磁珠复合物富集效果比较好，可以对蛋白实现完全富集。

(4)降钙素原纯度检测

用SDS-Page电泳法和液相色谱法检测纯度。

SDS-Page电泳法具体为，在PCT溶液中加入适量溴酚蓝混匀，95℃加热10min；泳道中加入Marker和样品，电压调到80V；之后将胶块用考马斯亮蓝染色，20min后用洗脱液反复洗脱，直至能看到条带。结果如图1所示，在Marker约为13kD处出现明显条带，且整个电泳图只有这单一条带，说明该样品纯度很高，且分子量的大小等于理论值，初步说明PCT纯度和浓度都能够满足后续的实验。

再将样品进行液相分析，液相色谱法具体为，将PCT样品进高效液相色谱，查看色谱图中是否有杂峰；色谱柱为：bioZen 

(5)酶切肽段FK、DR、AR：

在纯品PCT中添加空白血清，使其对应相应的浓度；磁珠提取后离心浓缩加入少量去离子水复溶；95℃水浴下高温变性15min；加入50nM碳酸氢铵溶液调节pH值；按比例加入一定量的胰蛋白酶溶液，并加入等量的标记肽段溶液，于37℃进行酶切反应；加入0.1％甲酸终止反应；得到酶切肽段FK、DR、AR。

对胰蛋白酶的酶切时间、酶与蛋白质的质量比进行优化。对比在4h，8h，12h，16h，20h，24h这6个时间点的酶切效率，以及PCT和胰蛋白酶的质量比在1:75、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:5、1:2、1:1这十种情况下的响应面积，从而优化酶切条件。虽然酶切效率没有直接参与到血清PCT的定值当中，但是优化酶切条件有利于提高液质的响应，提高数值的可比性。

不同的酶切条件下，质谱响应强度如图3所示。图3显示不同酶切时间和胰蛋白酶用量时的未标记肽段和标记肽段峰面积比变化曲线，可以看出，随着酶解时间的增加，三条肽段的峰面积比不断升高，但是12h后肽段的峰面积比下降，由此可知酶解时间过长会导致酶解过度，因此PCT的最佳酶解时间为12h。酶的用量太低会导致酶解效果不完全，酶的用量过高会导致酶解过度，反而降低酶解效果。因此，优化结果表明酶的最佳使用质量比为PCT:胰蛋白酶＝1:5。

使用Agilent 6410型三重四级杆质谱仪查找目标物母离子与子离子，由于本实验使用3条肽段进行分析，因此必须找到适当的液相条件将肽段分离。选择3条特征肽段定量蛋白更具有代表性，因此，3条肽段需要找到合适的液质条件将其分开。

表2为特征肽段及其标记肽段的质谱条件，表3为能把3条肽段分开的液相条件。色谱柱为：ACQUITY UPLC Pepdide BEH C18柱，(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相为：A水相：水(0.1％甲酸)，B有机相：乙腈(0.1％甲酸)；流速0.2mL/min，进样量10μL。在此条件下，纯化后的PCT经胰蛋白酶酶切后进质谱。

表2主要质谱参数

表3液相洗脱梯度

通过氨基酸水解法检测三条特征肽段FK、DR、AR的净含量，具体步骤如下：同质量比向待检测肽段溶液中加入同位素标记氨基酸溶液，60℃真空干燥后加入6M盐酸，在110℃对肽段进行水解；水解产物真空干燥后，用800μL的0.1％甲酸水溶液复溶，进6410液质联用仪检测；选用脯氨酸和缬氨酸对FK定量，谷氨酸和亮氨酸对DR定量，亮氨酸对AR定量；定量结果如表4所示。

表4未标记重组肽段的浓度检测结果

通过高效液相色谱测定肽段FK、DR、AR、L-FK、L-DR、L-AR纯度，具体为，将FK、DR、AR、L-FK、L-DR、L-AR样品进高效液相色谱，查看色谱图中是否有杂峰；色谱柱为：bioZen 

(6)降钙素原定量分析

配制选定肽段的高低标溶液，将其和酶切好的样品一同进质谱，肽段的浓度根据液质分析MRM模式谱图中待测肽段和添加的同位素标记待测肽段的峰面积比计算，通过肽段的浓度推算出降钙素原的浓度，以3者平均值定值；

根据肽段FK浓度计算PCT浓度，计算公式如下：

根据肽段DR浓度计算PCT浓度，计算公式如下：

根据肽段AR浓度计算PCT浓度，计算公式如下：

式中：c

PCT定量测试结果：

根据公式进行计算，分离出的血清中PCT的浓度计算结果如表5所示。表中样本1、2、3为三个平行待测样本。

表5血清中PCT检测结果

已知血清样本蛋白的理论含量为4μg/mL，对分离提纯后的PCT进行酶解检测，肽段FK检测结果的均值为3.744μg/mL，肽段DR的检测结果均值为3.882μg/mL，肽段AR的检测结果均值为3.905μg/mL。将三条肽段计算浓度结果的均值作为PCT蛋白的浓度结果，最终测量结果为3.844μg/mL。肽段FK、DR和AR的相对标准偏差分别为0.9％，0.1％和0.6％。由此可见，本发明方法是一种高效、简便、可靠的检测方法。

综上所述：

(1)本发明选用磁珠亲和纯化的方法对血清PCT进行前处理。通过磁珠富集纯化，可去除PCT血清样品中的杂蛋白，对低浓度的血清样品有很好的富集作用，降低检测限，同时纯化后的蛋白，提高信噪比，提高质谱检测的准确性。血清处理前后都用生化分析仪测试其浓度，测试结果显示磁珠提取效率接近100％，证明磁珠富集血清中的蛋白质是一种可靠、方便的富集纯化技术。

(2)本发明还对酶切效率进行了考察。现有技术中有实验采用超滤管去除尿素及杂质肽段等小分子，但是回收率很低，对于低丰度蛋白来说质谱响应太低，数据可比性不强。本发明将磁珠富集后的样品离心浓缩后只加入20μL去离子水溶解，使用95℃加热15min对蛋白质进行变性，避免去除尿素这一步骤对实验结果的影响。

无论是磁珠富集效率还是胰蛋白酶的酶切效率的优化，在本发明中只是为了加强质谱的响应面积，不参与浓度计算。

(3)本发明使用LC-MS/MS方法对血清PCT进行定值。实验原理是通过特征肽段的浓度推算出蛋白质的浓度，而肽段的浓度可以根据液质分析MRM模式谱图的峰面积表示。选用3条肽段计算PCT浓度，以3者平均值定值。在一般实验中，蛋白质的提取率、酶切效率、仪器的稳定性、实验误差等都会影响蛋白质的定量，而本发明方法在样品中添加等量的内标——标记肽段，可以消除以上误差，得到血清样品中PCT的浓度。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。