一种含有中药活性成分的中链甘油三酯生酮饮食组合物及其制备方法和应用

摘要

本发明属于食品技术领域，涉及一种用含有中药活性成分中链甘油三酯生酮饮食组合物及其制备方法和应用。生酮饮食组合物，包括如下重量份数的组分：脂肪30‑70份、蛋白质13‑35份、可溶性膳食纤维源碳水化合物1‑30份、纤维素4‑35份、岩藻黄质0.5‑2份、中药活性成分0.5‑4份、维生素02‑0.4份、矿物质与微量元素0.2‑1.2份所述的脂肪中含有中链甘油三酯(MCT)粉、橄榄油微囊粉、亚麻仔油微囊粉、共轭亚油酸微囊粉、二十二碳六烯酸(DHA)藻油粉和花生四烯酸油脂粉，六者占脂肪总质量的配比为(50‑60)：(15‑35)：(2‑12)：(10‑20)：(0.5‑1.5)：(0.5‑1.5)。本发明所述的含有中药活性成分中链甘油三酯生酮饮食组合物用于预防和/或治疗多发性硬化症的食品组合物及保健食品。

说明书

技术领域

本发明属于食品技术领域，尤其是涉及一种用于预防和/或治疗神经退行性疾病海马中枢神经系统损伤的含有中药活性成分中链甘油三酯生酮饮食组合物及其制备方法和应用。

背景技术

生酮饮食(ketogenic-diet，简称KD)是一种由高脂肪、低碳水化合物，适量蛋白质和其他营养素组成的配方饮食。其成分中所含的高脂肪还可以形成生理性酮血症，代谢产物则可以调节神经退行性疾病，如多发性硬化症(Multiple sclerosis,MS)、阿尔茨海默症(Alzheimer's disease,AD)、帕金森(Parkinson's disease，PD)、亨廷顿病(Huntington'sdisease,HD)等疾病发生发展中的关键通路，起到神经保护的作用。最早，KD应用于癫痫的治疗。KD目前有四种类型：传统类型即长链脂肪酸生酮饮食、中链甘油三酯生酮饮食、改良阿特金斯生酮饮食和低血糖指数饮食。尤其是，中链甘油三酯生酮饮食可快速生酮并为大脑迅速提供能量，从而受到广泛的应用。越来越多报道表明，尤其是中链脂肪能够减缓神经退行性患者的临床症状、延长患者生存期、提高患者生活质量，同时增强放化疗敏感性，目前已用于多种动物神经退行性模型及临床病例的干预及辅助治疗。

随着年龄的增长，神经退行性疾病会显示逐年升高的趋势，尤其是多发性硬化症。这些神经退行性疾病都有与神经元的病理性改变有关。目前，认为这涉及到一些细胞分子水平上的变化，包括氧化应激的增加、神经炎性反应、线粒体功能受损、神经元细胞的凋亡及神经细胞代谢障碍等。到目前为止，治疗神经退行性疾病的药物均无法阻止相关神经元的变性。

大脑的结构中，海马区神经元与人类学习记忆功能密切相关。我们已知神经元是通过神经纤维网络传递信息来实现功能的，脑白质中神经纤维的改变同样会影响大脑的认知记忆等能力，特别是有髓神经纤维对海马的整合功能起着重要的作用。对于中枢神经有髓神经纤维来说，包裹轴突的髓鞘结构起着绝缘和加速神经冲动传导的作用。

MS是中枢神经系统的慢性炎症疾病。在病理学上，以脱髓鞘，轴索损伤，炎性细胞浸润，胶质瘢痕增生为特征，临床症状表现为意识障碍，行动迟缓，震颤，尿失禁等。目前其病因及发病机制尚未明确,一般认为与病毒感染、遗传因素、环境因素等有关。MS中枢神经系统微环境的改变如脱髓髓鞘、神经炎性、氧化应激等都会进步加强对中枢神经系统海马区神经元的损害，从而进一步引发MS的意识障碍，给患者带来极大痛苦，降低MS患者的生活质量。目前本病多采用免疫抑制剂、免疫调节剂等治疗，但副作用大、复发率高、医疗费用昂贵。因此，研制新的生酮疗法组合物用于预防和或治疗多发生硬化症是本领域技术人员正在努力解决的技术问题。

在动物中产生一组病症并尝试获得结果的实验系统是公知的，所述动物模拟了造成人类疾病或与人类疾病相关的至少某些机制/结果。这些系统之一被称为CPZ动物模型。这种“毒性髓鞘脱失模型”引起少突胶质细胞线粒体形态变化，使少突胶质细胞能量代谢障碍，继而引发少突胶质细胞凋亡发生脱髓鞘。CPZ诱导的髓鞘脱失是由支持性少突胶质细胞的毒性变性而不是对髓磷脂鞘的直接攻击造成的。此外，在MS病变中造成少突神经胶质细胞死亡的机制尚不清楚。CPZ诱导的髓鞘脱失模拟了人类MS患者中的髓磷脂丧失。研究MS患者海马区病变，海马髓鞘是否存在破坏，对有助于停止或延迟髓鞘脱失或髓鞘形成障碍和/或促进髓鞘再生和/或保留或恢复髓鞘和/或轴突功能的治疗的研究。

Sirtuin 1(SIRT1)SIRT1与多种信号传导通路中的头蛋白盒转录因子NF-κB、p300、p53等蛋白相互作用，参与神经保护、细胞衰老凋亡、糖脂类代谢、炎症氧化应激反应等过程，发挥其对基因的调控功能。SIRT1可通过改变细胞的凋亡过程，起到对神经细胞的保护作用。在神经退行性疾病中SIRT1的神经保护作用很大程度上依赖于其延长细胞寿命和促进神经细胞存活的功能。SIRT1可以通过去乙酰化作用于NF-κB的亚单位RelA/p65，从而减少NF-κB与核内炎症基因结合，减少了TNF-α、IL-1β及iNOS等炎症因子的产生。此外，SIRT1可作用于抗氧化物酶，实现抗氧化应激作用。Sugino等通过细胞体外培养证实，SIRT1在轴突再生中发挥重要作用。可见，上调SIRT1的表达，起到抗炎及抗氧化的能力，对神经系统起到保护的作用。此外，p-Akt、mTOR、和PPAR-γ也都参与调节多种细胞过程，包括细胞增殖、分化和凋亡。DHA可能通过上调PPAR-γ的表达，从而促进OPCs的分化成熟。已有报道显示，激活p-Akt/mTOR信号通路可以增加成熟少突胶质细胞的数量并促进再髓鞘化。p-Akt/mTOR通路中，mTOR在下游信号通路中充当p-Akt的底物，在中枢神经系统发育过程中，mTOR在少突胶质前体细胞分化为成熟的少突胶质细胞中起着关键性的作用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种含有中药活性成分的中链甘油三酯生酮饮食组合物及其制备方法，及其保护海马神经元SIRT1的作用机制，在抑制多发性硬化症中枢神经系统形成障碍中的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种用于预防和/或治疗多发性硬化症疾病的中药活性成分中链甘油三酯生酮饮食组合物，包括如下重量份数的组分：脂肪30-70份、蛋白质13-35份、可溶性膳食纤维源碳水化合物1-30份、纤维素4-35份、岩藻黄质0.5-2份、中药活性成分0.5-4份、维生素02-0.4份、矿物质与微量元素0.2-1.2份。

所述的脂肪中含有中链甘油三酯(MCT)粉、橄榄油微囊粉、亚麻仔油微囊粉、共轭亚油酸微囊粉、二十二碳六烯酸(DHA)藻油粉和花生四烯酸油脂粉，所述中链甘油三酯粉的质量占脂肪总质量的50-60％；六者占脂肪总质量的配比为(50-60)：(15-35)：(2-12)：(10-20)：(0.5-1.5)：(0.5-1.5)。

所述的中药活性成分化合物为川芎嗪、黄腐酚、金丝桃苷中二种及二种以上的混合物。

优选地，所述可溶性膳食纤维源碳水化合物和蛋白质的总质量与脂肪的质量比为1：1-1：4。

优选的，所速可溶性膳食纤维源碳水化合物占生酮饮食组合物总质量的1/100-3/10。

优选的，所述岩藻黄质占生酮饮食组合物总质量的1/200-1/50。

优选的，所述中药活性成分化合物占生酮饮食组合物总质量的1/200-1/25。

优选的，所述蛋白质为大豆分离蛋白、分离乳清蛋白、BCAA支链氨基酸中的两种或两种以上的混合物。

优选的，所述纤维素为果蔬纤维粉，采购于兴化市嘉博食品有限公司，以胡萝卜、菠菜粉、番茄粉天然蔬果纤维作为原料，占生酮饮食组合物总质量的1/25-7/20。

优选的，所述可溶性膳食纤维源碳水化合物为抗性糊精或低聚果糖的一种或是两种的混合物。

所述的维生素包括：维生素A、维生素D3、维生素E、维生素K1、维生素B1、维生素B2、维生素B6、抗坏血酸维生素C、泛酸钙、生物素、叶酸、烟酰胺、维生素B12、L-肉碱。

所述的矿物质与微量元素包括：磷、钙、钾、钠、铬、铜、铁、镁、锰、硒、锌。

所述生酮饮食组合物的制备方法，包括如下步骤：(1)将中药活性成分化合物、岩藻黄质、维生素、矿物质与微量元素的组合物按照质量比，在先在混合设备1里混匀，得到物料A；(2)将脂肪、蛋白、可溶性膳食纤维源的碳水化合物及纤维素组合物按照质量比，在混合设备2里混匀，得到物料B；(3)将物料A和物料B加入混合机中继续混合，搅拌均匀，混合时间控制在30-60min，再80目-200目过筛混合，混合工艺操作温度为18-25℃，相对湿度控制在40-60％；(4)消毒，将混合料采用巴氏杀菌法消毒灭菌，温度控制在121℃～134℃，时间控制在20～30min；(5)封装：将消毒后的混合料冷却至室温，用常规方法真空包装，即为生酮饮食组合物。

步骤(3)中的混合模式对与本生酮组合物工艺而言，分步混合和过筛混合十分重要，冲调后表面没有悬浮，底部无沉淀物，产品形态均一。

步骤(5)中的封装模式，可以按照①生酮组合物混合后，以转速900～5000r/min，时间30～60min的条件混合后；然后按250～1000g/罐分装成单罐固体粉状产品；或②生酮组合物混合后，以转速20～400r/min，时间10～60min，然后按热量100～500kcal/包分装成单包粉末状产品。

本发明所述的含有中药活性成分中链甘油三酯生酮饮食组合物用于预防和/或治疗多发性硬化症的食品组合物及保健食品；另外，本发明所述的生酮饮食组合物还可以考虑用于预防和/或治疗神经退行性疾病如阿尔茨海默病，帕金森等或用于抗炎、抗氧化应激等。

本发明所述的生酮饮食组合物优选的剂型是粉剂，也可采用其他常用剂型，本发明化合物通常可以通过口服施用，如片剂及颗粒剂等。

本发明组合物的使用方法：成人开始每日摄入量低于10g，1个月后每日摄入量10～20g。在KD治疗期间需要医生或是营养师进行指导辅助，对血糖、血酮和尿酮进行分析检测；首次使用时，1周或是2周后评估，之后每个月至少2次以上查血酮、血糖，血脂尿酮至少每周2次以上，每个月进行一次营养评估。停止生酮饮的时时机因人而异，主要是基于成人对生酮饮食的反应。建议坚持生酮饮食至少2至3个月再考虑停止。

本发明所述的生酮饮食组合物在双环己酮草酰二腙(Cuprizon，CPZ)诱导小鼠脱髓鞘模型中，对神经系统起到保护作用主要涉及行为，海马体胶质细胞过度活，抗炎及抑制神经炎性的作用机制。其特征主要为改善实验动物的认知能力，增强的实验动物的探索能力，抑制中枢神经系统海马区髓鞘的丢失，促进成熟少如胶质的分化成熟，抑制小胶质细胞及星型胶质细胞过度活化，抑制海马过氧化应激反应，抑制海马神经元核固缩，激活SIRT1/PPAR-γ和SIRT1/p-Akt/mTOR信号通路。所述的激活中枢神经系统SIRT1/PPAR-γ和SIRT1/p-Akt/mTOR信号通路，具体为增强SIRT1、PPAR-γ、p-Akt和mTOR的蛋白表达。

所述的双环己酮草酰二腙是一种具有生物毒性的铜离子螯合剂，0.2％CPZ饲料喂养C57BL/6小鼠，会导致脑内如少胶质前体细胞死亡和髓鞘脱失，同时伴随认识障碍和行为学改变。目前，CPZ介导C57BL/6小鼠急性脱髓鞘模型广泛用于多发性硬化症的研究。

本发明的有益效果。

本发明的生酮饮食组合物中添加的中链甘油三酯被机体完全吸收以后，直接达到肝脏直接作为能量被使用。其代谢产物酮体，如β-羟基丁酸，本身不仅可以参与能量代谢，而且还可以作为信号传导的媒介参与抗炎等信号通路；酮体可通过血脑屏障进入脑内，加强神经保护作用，发挥抗炎和抗氧化的作用。有利于改善脱髓鞘疾病患者病程的发展。本发明的生酮饮食组合物中添加的DHA藻油粉具有健脑增智，保护视力，降低胆固醇，抗炎和抗氧化等作用，增强机体的免疫力。本发明的生酮饮食组合物中添加的花生四烯酸，是人体必需脂肪酸之一，是人类早期发育的必须的营养物质，有助于改善记忆力和视力。本发明的生酮饮食组合物中添加的分离乳清蛋白是机体所需要的优质蛋白质，具有营养价值高，易消化吸收，是公认的人体优质蛋白质补充剂之一，可促进机体免疫，增强免疫能力。本发明的生酮饮食组合物中添加的BCAA支链氨基酸，主要含有亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸，口服后，机体可以迅速吸收，促进细胞生长，从而迅速发挥其生理及生物学功能，尤其是可以促进胰岛素释放及促进生长激素释放。本发明的生酮饮食组合物中添加的抗性糊精可降低血糖，调节血脂，还可以促进人体肠道双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌增殖，同时产生大量短链脂肪酸，如乙酸、叶酸和乳酸等，改善人体肠道环境，从而加快肠道蠕动，减少便秘发生。本发明的生酮饮食组合物中添加的低聚果糖可促进双歧杆菌等少数有益菌繁殖生长的作用，同时可以显著抑制有害菌的繁殖，调节肠道平衡，促进钙铁吸收，减少肝毒素等；同时，降低血脂和胆固醇，提高免疫力等。本发明的生酮饮食组合物中添加的纤维素为果蔬纤维素粉，可增加饱腹感，可有的降低生酮饮食带来的不良反应。本发明的一个关键的发明点是生酮饮食组合物中添加的中药活性成分化合，具较好的神经保护作用，如川芎嗪可改善脑循环和抗血栓，黄腐酚具有抗炎和抗氧化的作用，金丝桃苷具有抗抑郁，抗炎症，抗氧化应激和抗细胞凋亡等作用。实验研究表明，本发明的中链甘油三酯生酮组合所添加的中药活性成分组合物可以更有效的增强动物的空间记忆能力，该生酮组合物在首次在在多发性硬化中及动物模型中应用，并产生积极的效果。本发明的生酮饮食组合物中添加的岩藻黄质，具有抗抑制神经炎性及抗氧化的作用，以可以抑制胶质细胞的过度激活且可以增强机体内对DHA和花生四烯酸的吸收，而发挥神经保护作用。因此，将岩藻黄质加入到本研究的生酮的组合物中可以提高DHA和花生四烯酸的生物利用率，促进脑功能损伤的修复。

本发明发明人通过研究发现，该含有中药活性成分的中链甘油三酯生酮饮食组合物，具有神经保护的作用，尤其是可增强脑功能学习记忆能力，增强少突胶质细胞分化成熟的能力，降低过度活化的小胶质细胞和星型胶质细胞，抑制海马氧化应激反应，并激活SIRT1/PPAR-γ和SIRT1/p-Akt/mTOR信号通路。因此，本研究的含有中药活性成分的中链甘油三酯型的生酮饮食组合物作为治疗MS疾病的策略具有很重要的临床意义和应用前景，可能够为人们健康服务。本发明提供的生酮饮食组合物的制法，使其能够批量生产，供应市场。本发明发明人通动物试验，验证了本发明的含有中药活性成分中链甘油三酯生酮饮食组合物具有中枢神经系统神经保护作用，及抑制海马体神经病变的作用机制，证实了本发明可以改善动物的认知能力，且具有抗炎和抗氧化的能力，起到神经保护的作用。具体为通过水迷宫及旷场实验动物行为检测，与普通饮食相比，本研究含有中药活性成分中链甘油三酯生酮饮食组合物能明显改善实验动物的学习记忆能力及减少其焦虑行为。在中枢神经系统海马区增强髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)表达，降低硫酸软骨素蛋白多糖(NG2)少突胶质前体细胞表达，及增加2’,3’-环核苷酸3’-磷酸二酯酶(CNPase)成熟少突胶质细胞的表达。抑制过度活化的CD68小胶质细胞及CD16/32标志的促炎M1型小胶质细胞，减少胶质纤维酸性蛋白(GFAP)标志的星型胶质细胞的增生。增强海马区谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性及谷胱甘肽(GSH)水平，降低海马丙二醛(MDA)水平。苏木素伊红(HE)染色和尼(氏)体染色表现海马神经元细胞圆润饱满且排列紧密。此外，本研究还验证了含有中药活性成分的中链甘油三酯生酮饮食组合物比不含中药活性成分的中链甘油三酯生酮饮食组合物更有效的改善动物的空间记忆能力，及脂肪与(蛋白质+碳水化合物)质量比为4:1的含中药活性成分的中链甘油三酯生酮饮食组合物比脂肪与(蛋白质+碳水化合物)质量比为1:1的含中药活性成分的中链甘油三酯生酮饮食组合物能较快的产生酮体，并通过动物水迷宫实验说明了本研究的4：1生酮饮食组合物比1:1生酮饮食组合物更能保护动物的学习及记忆能力，发挥更好的神经保护作用。

附图说明

图1表示实例2和对比例2生酮饮食组合物Morris水迷宫实验小鼠的运动轨迹。

图2表示在CPZ诱导脱髓鞘模型中，实例1和对比例1对iNOS及CNPase蛋白表达的影响。

图3表示生酮饮食组合物(实施例1)对小鼠探体重的影响。

图4为生酮饮食组合物(实施例1)对小鼠探索和认识能力的影响，其中图4.1表示实施例1对小鼠探索能力的影响；图4.2表示实施例1对小鼠认识能力的影响。

图5表示生酮饮食组合物(实施例1)对小鼠血酮，海马β羟基丁酸水平及血生化指标的影响。

图6表示生酮饮食组合物(实施例1)对小鼠海马区髓鞘变化的影响。

图7表示生酮饮食组合物(实施例1)海马区组织病理学分析。

图8表示生酮饮食组合物(实施例1)在海马区对活化小胶质细胞的影响。

图9表示生酮饮食组合物(实施例1)对活化星型胶质细胞的影响。

图10表示生酮饮食组合物(实施例1)抗氧化的能力。

图11表示在CPZ诱导脱髓鞘模型中，生酮饮食组合物(实施例1)对SIRT1、p-Akt、mTOR和PPAR-γ的蛋白表达的影响。

图12：实例1和对比例3Morris水迷宫实验小鼠的运动轨迹。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细的说明，除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

有中药活性成分中链甘油三酯生酮饮食组合物，生酮率(脂肪：蛋白质:+碳水的质量比)是4：1，各组分原料为：中链甘油三酯(MCT)粉42份、橄榄油微囊粉14份、亚麻仔油微囊粉3份、共轭亚油酸微囊粉10份、DHA藻油粉0.5份、花生四烯酸油脂粉0.5份、大豆分离蛋白粉5份、分离乳清蛋白5份、BCAA支链氨基酸5份、抗性糊精1份、低聚果糖的1.5份、纤维素8.1份、岩藻黄质1份、川芎嗪1份、黄腐酚1份、金丝桃苷1份，维生素组合物0.2份、矿物质与微量元素的组合物0.2份。

制备方法如下：

(1)按照重量配比称取各原料；

(2)将岩藻黄质、川芎嗪、黄腐酚、金丝桃，维生素组合物、矿物质与微量元素的组合物按照质量比，充分混合后，得到物料A；

(3)将中链甘油三酯(MCT)粉、橄榄油微囊粉、亚麻仔油微囊粉、共轭亚油酸微囊粉、DHA藻油粉、花生四烯酸油脂粉、大豆分离蛋白粉、分离乳清蛋白、BCAA支链氨基酸、抗性糊精、低聚果糖、纤维素按照质量比，充分混合后，得到物料B；

(4)将物料A和物料B加入混合机中继续混合，搅拌均匀，混合时间控制在45min，再150目过筛混合，混合工艺操作温度为24℃，相对湿度控制在50％；

(5)消毒，将混合料采用巴氏杀菌法消毒灭菌，温度控制在130℃，时间控制在25min；

(6)封装：将消毒后的混合料冷却至室温，用常规方法真空包装，即为生酮饮食组合物。

实施例2

有中药活性成分中链甘油三酯生酮饮食组合物，生酮率(脂肪：蛋白质+碳水的质量比)是3：1，各组分原料为：中链甘油三酯(MCT)粉36份、橄榄油微囊粉13份、亚麻仔油微囊粉3份、共轭亚油酸微囊粉8份、DHA藻油粉0.5份、花生四烯酸油脂粉0.5份、大豆分离蛋白粉6.3份、分离乳清蛋白6份、BCAA支链氨基酸6份、抗性糊精2份、纤维素13.3份、岩藻黄质1.5份、川芎嗪2份、黄腐酚1.5份、维生素组合物0.2份、矿物质与微量元素的组合物0.2份。

制备方法如下：

(1)按照重量配比称取各原料；

(2)将岩藻黄质、川芎嗪、黄腐酚、维生素组合物、矿物质与微量元素的组合物按照质量比，充分混合后，得到物料A；

(3)将中链甘油三酯(MCT)粉、橄榄油微囊粉、亚麻仔油微囊粉、共轭亚油酸微囊粉、DHA藻油粉、花生四烯酸油脂粉、大豆分离蛋白粉、分离乳清蛋白、BCAA支链氨基酸、抗性糊精、纤维素按照质量比，充分混合后，得到物料B；

(4)将物料A和物料B加入混合机中继续混合，搅拌均匀，混合时间控制在55min，再过100筛混合，混合工艺操作温度为20℃，相对湿度控制在50％；

(5)消毒，将混合料采用巴氏杀菌法消毒灭菌，温度控制在128℃，时间控制在25min；

(6)封装：将消毒后的混合料冷却至室温，用常规方法真空包装，即为生酮饮食组合物。

对比例1

有中药活性成分中链甘油三酯生酮饮食组合物，生酮率(脂肪：蛋白质+碳水的质量比)是4：1，各组分原料为：中链甘油三酯(MCT)粉42份、橄榄油微囊粉14份、亚麻仔油微囊粉3份、共轭亚油酸微囊粉10份、DHA藻油粉0.5份、花生四烯酸油脂粉0.5份、大豆分离蛋白粉5份、分离乳清蛋白5份、BCAA支链氨基酸5份、抗性糊精1份、低聚果糖的1.5份纤维素8.1份、岩藻黄质1份、川芎嗪1份、黄腐酚1份、金丝桃苷1份，维生素组合物0.2份、矿物质与微量元素的组合物0.2份。

制备方法如下：

(1)按照重量配比称取各原料；

(2)中链甘油三酯(MCT)粉、橄榄油微囊粉、亚麻仔油微囊粉、共轭亚油酸微囊粉、DHA藻油粉、花生四烯酸油脂粉、大豆分离蛋白粉、分离乳清蛋白粉、BCAA支链氨基酸、抗性糊精、低聚果糖、纤维素将岩藻黄质、川芎嗪、黄腐酚、金丝桃苷、维生素组合物、矿物质与微量元素按照质量比，搅拌均匀充分混合

(3)混合时间控制在65min，再50目过筛混合，混合工艺操作温度为30℃，相对湿度控制在61％或是以上；

(5)消毒，将混合料采用巴氏杀菌法消毒灭菌，温度控制在125℃，时间控制在25min；

(6)封装：将消毒后的混合料冷却至室温，用常规方法真空包装，即为生酮饮食组合物。

对比例2

中链甘油三酯生酮饮食组合物，生酮率(脂肪：蛋白质+碳水的质量比)是3：1，各组分原料为：中链甘油三酯(MCT)粉36份、橄榄油微囊粉13份、亚麻仔油微囊粉3份、共轭亚油酸微囊粉8份、DHA藻油粉0.5份、花生四烯酸油脂粉0.5份、大豆分离蛋白粉6.3份、分离乳清蛋白6份、BCAA支链氨基酸6份、抗性糊精2份、纤维素13.3份、维生素组合物0.2份、矿物质与微量元素的组合物0.2份。

制备方法如下：

(1)按照重量配比称取各原料；

(2)将维生素组合物、矿物质与微量元素的组合物按照质量比，充分混合后，得到物料A；

(3)将中链甘油三酯(MCT)粉、橄榄油微囊粉、亚麻仔油微囊粉、共轭亚油酸微囊粉、DHA藻油粉、花生四烯酸油脂粉、大豆分离蛋白粉、分离乳清蛋白、BCAA支链氨基酸、抗性糊精、纤维素按照质量比，充分混合后，得到物料B；

(4)将物料A和物料B加入混合机中继续混合，搅拌均匀，混合时间控制在55min，再100目过筛混合，混合工艺操作温度为20℃，相对湿度控制在50％；

(5)消毒，将混合料采用巴氏杀菌法消毒灭菌，温度控制在128℃，时间控制在25min；

(6)封装：将消毒后的混合料冷却至室温，用常规方法真空包装，即为生酮饮食组合物。

对比例3

有中药活性成分中链甘油三酯生酮饮食组合物，生酮率(脂肪：蛋白质:+碳水的质量比)是1：1，各组分原料为：中链甘油三酯(MCT)粉25.2份、橄榄油微囊粉10份、亚麻仔油微囊粉3份、共轭亚油酸微囊粉6份、DHA藻油粉0.4份、花生四烯酸油脂粉0.4份、大豆分离蛋白粉10份、分离乳清蛋白9份、BCAA支链氨基酸份6、抗性糊精12份、低聚果糖的8份、纤维素5.6份、岩藻黄质1份、川芎嗪2份、黄腐酚1份，维生素组合物0.2份、矿物质与微量元素的组合物0.2份。

制备方法如下：

(1)按照重量配比称取各原料；

(2)将岩藻黄质、川芎嗪、黄腐酚、维生素组合物、矿物质与微量元素的组合物按照质量比，充分混合后，得到物料A；

(3)将中链甘油三酯(MCT)粉、橄榄油微囊粉、亚麻仔油微囊粉、共轭亚油酸微囊粉、DHA藻油粉、花生四烯酸油脂粉、大豆分离蛋白粉、分离乳清蛋白、BCAA支链氨基酸、抗性糊精、低聚果糖、纤维素按照质量比，充分混合后，得到物料B；

(4)将物料A和物料B加入混合机中继续混合，搅拌均匀，混合时间控制在45min，再150目过筛混合，混合工艺操作温度为24℃，相对湿度控制在50％；

(5)消毒，将混合料采用巴氏杀菌法消毒灭菌，温度控制在130℃，时间控制在25min；

(6)封装：将消毒后的混合料冷却至室温，用常规方法真空包装，即为生酮饮食组合物。

一、效果实验1：实施例2与对比例2比较

6周龄健康雄性C57BL/6小鼠30只，体重20-21g，所有小鼠均能随意获得足够食物和水，通风良好，压差20Pa～50Pa，室温23±2℃，相对湿度40％～70％，光照12h/天。建立CPZ脱髓鞘模型并进行生酮饮食干预：CPZ脱髓鞘模型的建立，按照质量为0.2％的比例，将CPZ加入到饲料中，混匀喂养小鼠35天，诱导脱髓鞘。将30只小鼠随机分为3组(每组10只)，分别为：(i)双环己酮草酰二腙组(CPZ+ND)，含有0.2％双环己酮草酰二腙的标准常规饮食喂养小鼠；(ii)生酮饮食(实施例2)干预治疗双环己酮草酰二腙组(CPZ+实施列2)，喂养0.2％双环己酮草酰二腙的同时进行生酮饮食干预，直到实验结束；(iii)生酮饮食(对比例2)干预治疗双环己酮草酰二腙组(CPZ+对比例2)，喂养0.2％双环己酮草酰二腙的同时进行生酮饮食干预，直到实验结束。

统计分析

采用SPSS 20.0软件进行数据分析。多组间比较采用One-way ANOVA分析及Tukeypost hoctest的事后检验分析。数据表示为平均值±平均值标准误差(Mean±SEM)。组间差异用采用“*”表示：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

1.血酮及血糖的测量。

采用手持式酮体测定仪及手持式血糖测定仪测定血酮和血糖浓度。每7天测一次血酮及血糖含量，结果见表1和表2。本研究结果显示，与CPZ+ND组相比，CPZ+实施列2和CPZ+对比例2组的血酮水平显着增加而血糖水平显著降低(表1和表2)。上述结果表明，实施列2组和对比例2组生酮饮食均可以升高血酮浓度及降低血糖浓度。

表1：表示生酮饮食组合物(实施例2和对比例2)对小鼠血酮的影响

标注：与CPZ+常规饮食相比，组间差异用采用a表示：a<0.05，n＝10只/组；表1中，数据表示为平均值±平均值标准误差(Mean±SEM)表示。

表2：表示生酮饮食组合物(实施例2和对比例2)对小鼠血糖的影响。

标注：与CPZ+常规饮食相比，组间差异用采用a表示：a<0.05；n＝10只/组；表2中数据表示为平均值±平均值标准误差(Mean±SEM)表示。

2.实验动物行为学检测

Morris水迷宫实验(Morriswatermaze，MWM)

实验用恒温(25±1℃)游泳池1台，直径1.5m，平台直径10cm，高度35am，游泳池内水位没过平台1cm，加入足够白色染料混匀，以免小鼠看到平台，在造模结束前5天，进行Morris水迷宫训练，共5天，每天4次，相邻两次间隔时间为(30±3)min，小鼠头朝池壁放入水中，随机取四个象限的中点为下水位置。如果游泳时间超过60s/次，则引导动物到平台，在平台上停留15秒，为一次训练结束。第6天进行空间探索实验，撤掉平台，记录小鼠到达目标的距离，到达目标平台的次数及在目标象限中停留的时间。Morris水迷宫实验用于检测小鼠空间学习记忆能力。

通过测量小鼠到达目标的总距离，穿越目标平台的次数及在目标象限中花费的时间，评估小鼠的记忆认知能力。本研究结果表明，实施例2和对比例2干预治疗5周后，尤其是实施例2治疗后小鼠到达目标的总距离减少，穿越目标平台的次数增加及在目标象限中花费的时间增多(见图1，左图为CPZ+常规饮食，中间图为CPZ+实施例2，右图为CPZ+对比例2)。以上数据表明，两种生酮饮食组合物虽然都可以挺高小鼠的空间记忆力，尤其是实施例2能更有效地增强了CPZ小鼠的学习记忆能力，说明本组合物添加的岩藻黄质及中药活性成分，如川芎嗪、黄腐酚及金丝桃苷能更有效的提高海马区的神经保护作用，这可能与它们本的功能有关，结果见图1和表3。

表3：实例2和对比例2对Morris水迷宫实验各参数的影响

图1：实例2和对比例2Morris水迷宫实验小鼠的运动轨迹，B代表起点，E代表终点。表3：实例2和对比例2对Morris水迷宫实验各参数的影响。数据以Mean±SEM表示。N＝10只/组。与CPZ+常规饮食相比，组间差异用采用a表示：a<0.05，与CPZ+对比例2相比，组间差异用采用b表示：b<0.05

3.组织制备

灌注取脑

(1)小鼠取完血样后，称重并对小鼠进行麻醉，将输液泵连接4℃预冷的生理盐水和多聚甲醛；

(2)将麻醉好的小鼠固定在工作台上，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。充分暴露心脏后，将输液针从左心室心尖部插入，打开输液泵，用眼科剪将右心耳剪开，灌注生理盐水，小鼠四肢僵硬抽搐且尾巴变硬变直视为灌注成功；

(3)灌注成功后，快速断头取脑，将完整剥离的小鼠大脑置于多聚甲醛溶液中，放入4℃冰箱中过夜；

新鲜取脑

(1)处死小鼠后，用剪刀将小鼠头部剪下，迅速将将颅骨去除，此步骤尽量在冰上快速操作；

(2)在冰上按照解剖图谱所示的位置快速分离小鼠额海马区，放入-80℃超低温冰箱中保存待用。

Western-blot

获取小鼠海马总蛋白(MinuteTM Total Protein Extraction Kit，Invent)。使用BCA法测定蛋白浓度(BCA Protein Assay kit，SangonBiotech)。随后，通过SDS-PAGE电泳分离出目的蛋白，然后将其转印到PVDF膜(Millipore，Billerica，MA，USA)上，将膜放入Tris缓冲盐溶液pH 7.4的5％脱脂奶中室温封闭2小时后，用TBST清洗3遍，加入一抗孵育过夜，包括：兔抗iNOS(Abcam，1：1,000)和兔抗CNPase(Proteintech，1：1,000)。第二天，将PVDF膜取出，用TBST洗涤三次，每次5分钟，并在室温放入含TBST配制1:5000的山羊抗兔二抗的孵育盒中，置于37℃温箱中缓慢震荡1h，取出后，并用TBST洗涤3次，每次5分钟。用吸水纸将PVDF膜上的TBST液吸干后，取适量混匀的ECL化学发光液均匀滴加在PVDF膜上，将其放入凝胶成像系统的机器中，调整曝光时间进行摄片，利用Image-Pro Plus软件分析条带的IOD值并记录数据。通过与ND组蛋白水平比较各组之间蛋白表达水平。

iNOS结果显示，与CPZ+ND组相比，实施例2与对比例2干预治疗5周后，两种生酮组合物都能抑制促进海马区iNOS的过表达(图2)。尤其是与对比例2相比，实施例2更有效的抑制了海马区iNOS的表达，说明实施例2更有效的抑制了炎性反应，这与实施例2种所添加的岩藻黄质及中药活性成分，如川芎嗪、黄腐酚及金丝桃苷的抗炎性有关。

CNPase结果显示，与CPZ+ND组相比，实施例2与对比例2干预治疗5周后，两种生酮组合物都促进海马区CNPase的表达(图2)。尤其是与对比例2相比，实施例2更有效的促进了海马区CNPase的表达，说明实施例2更有效的促进髓鞘的髓鞘生产，这与实施例2种所添加的岩藻黄质及中药活性成分，如川芎嗪、黄腐酚及金丝桃苷有关。

图2，表示在CPZ诱导脱髓鞘模型中，实施例2与对比例2对iNOS及CNPase蛋白表达的影响。(A)：第35天，Western-blot法检测各组海马中iNOS及CNPase的蛋白表达水平，以β-action蛋白作为内参；(B-C)定量分析各组中iNOS(B)和CNPase(C)的蛋白表达水平。数据以Mean±SEM表示，组间差异，用***p<0.001表示，N＝5只/组。

二、效果实验2：实施例1与标准常规饮食对比。

1、动物实验

6周龄健康雄性C57BL/6小鼠30只，体重20-21g，购自购自济南鹏跃实验动物公司(Jinan，China)。所有小鼠均能随意获得足够食物和水，通风良好，压差20Pa～50Pa，室温23±2℃，相对湿度40％～70％，光照12h/天。

1.建立CPZ脱髓鞘模型并进行生酮饮食干预：CPZ脱髓鞘模型的建立，按照质量为0.2％的比例，将CPZ加入到饲料中，混匀喂养小鼠35天，诱导脱髓鞘。将30只小鼠随机分为3组(每组10只)，分别为：(i)标准常规对照组(ND)，标准常规饮食喂养小鼠；(ii)双环己酮草酰二腙组(CPZ+ND)，含有0.2％双环己酮草酰二腙的标准常规饮食喂养小鼠；(iii)生酮饮食(实施例1)干预治疗双环己酮草酰二腙组(CPZ+KD)，喂养0.2％双环己酮草酰二腙的同时进行生酮饮食干预，直到实验结束。

统计分析

采用SPSS 20.0软件进行数据分析。多组间比较采用One-way ANOVA分析及Tukeypost hoctest的事后检验分析。数据表示为平均值±平均值标准误差(Mean±SEM)。组间差异用采用“*”表示：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；或采用“#”表示：#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001。

实验动物体重测量：每天早上8:00-9:00测量每只实验动物的体重。给予C57BL/6小鼠喂食0.2％CPZ 5周。统计各组小鼠平均体重变化的差异，图3所示为每2天各组小鼠平均体重的变化曲线。数据以Mean±SEM表示，组间差异，用*p<0.05，***p<0.001表示，N＝10只/组。生酮饮食可以减少CPZ组引起的体重降低，ND组中，小鼠的体重逐渐增加，而CPZ+ND组体重显著下降(见图3.)经生酮饮食干预(实施例1)后，小鼠体重明显上升。本研究结果表明，生酮饮食(实施例1)可以降低CPZ引起的体重下降。结果见图3。

图3显示，生酮饮食组合物(实施例1)对小鼠探体重的影响。将C57BL/6小鼠随机分为三组，ND：标准常规饮食组；②CPZ+ND：CPZ+标准常规饮食组；③CPZ+KD：CPZ+生酮饮食组合物干预组。组间差异，用*p<0.001表示，***p<0.001表示。

2.实验动物行为学检测

(1)旷场实验(Open field test)

旷场实验来评价小鼠自发活动与探索行为。本实验采用的旷场活动箱为底部面积45cm×45cm，高35cm不透明深灰色的有机玻璃箱，旷场箱上方采用无影灯照射。小鼠活动轨迹被旷场箱上方的索尼摄像头进行拍摄，传入到电脑中的Smart软件进行追踪并分析。将小鼠放在中央区域，让其适应旷场箱环境30S，开始记录小鼠的活动轨迹，5min后，记录小鼠运动的总距离，中央距离及在中央区域停留的时间，之后将小鼠取出，用酒精将旷场箱彻底擦拭，以便检测下一只小鼠的活动轨迹。结果见图4.1，左图为常规饮食，中间图为CPZ+常规饮食，右图为CPZ+实施例1。

通过测量小鼠运动的总距离、在中心区域的行进距离及在中心区域的停留时间，评估小鼠的焦虑和探索能力。本研究结果表明，在2％CPZ喂食5周后，与ND组相比，小鼠运动的总距离，中心区域运动的总距离及中心区域停留的时间明显减少(图4.1B)。可能与CPZ诱导脱髓鞘引起的焦虑有关。KD(实施例1)干预治疗5周后，与CPZ组比，KD(实施例1)干预治疗后小鼠运动的总距离，中心区域行进距离，中心区域停留的时间显著升高(图4.1B)。以上数据表明，KD(实施例1)降低了CPZ诱导脱髓鞘小鼠的焦虑样行为，增强了行为探索能力。

图4.1,表示生酮饮食组合物(实施例1)对小鼠探索能力的影响。(A)：显示了ND、CPZ+ND和CPZ+KD各组小鼠的探索行为；(B)：总距离；(C)：中心距离；(D)中心区域花费的时间；数据以Mean±SEM表示。B代表起点，E代表终点。与ND组比较，组间差异，用***p<0.001表示；与CPZ+ND组比较，组间差异用###p<0.001表示。

(2)Morris水迷宫实验(Morriswatermaze，MWM)

通过测量小鼠到达目标的总距离，穿越目标平台的次数及在目标象限中花费的时间，评估小鼠的记忆认知能力。研究方法与上述效果实验1中Morris水迷宫实验方法一致。本研究结果表明，在2％CPZ喂食5周后，与ND组相比，小鼠到达目标的总距离增多，穿越目标平台的次数减少及在目标象限中花费的时间减少(图4.2B)。这可能与CPZ诱导脱髓鞘引起的认知障碍有关。KD(实施例1)干预治疗5周后，与CPZ组比，KD(实施例1)干预治疗后小鼠到达目标的总距离减少，穿越目标平台的次数增加及在目标象限中花费的时间增多(图4.2B)。以上数据表明，KD(实施例1)增强了CPZ小鼠的学习记忆能力，结果见图4.2，左图为常规饮食，中间图为CPZ+常规饮食，右图为CPZ+实施例1。

图4.2,表示生酮饮食组合物(实施例1)对小鼠认识能力的影响。(A)：小鼠运动轨迹；(B)到达目标的距离；(C)穿越目标平台的次数；(D)在目标象限中花费的时间，绿色圆圈代表起点，红色圆圈代表终点。数据以Mean±SEM表示，与ND组比较，组间差异，用***p<0.001表示；与CPZ+ND组比较，组间差异用##p<0.01，###p<0.001表示。N＝10只/组。

3.血酮，海马β羟基丁酸水平、血生化指标及血糖的测量

采用手持式酮体测定仪和血糖测定仪测定血酮和血糖的浓度。根据β-羟基丁酸说明书(DBHB Assay kit，MAK041，Sigma，USA)测量海马中β羟基丁酸水平。此外，将分离得到的各组血清样本转移到Eppendorf试管中。根据血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、氮肌酐(Cr)和血尿素氮(BUN)检测试剂盒说明书，用紫外可见分光光度计(U-3900H，日立公司，日本)测量相应波长下的光吸收率，测定各组AST、ALT、Cr和BUN的水平。AST、ALT、Cr和BUN检测试剂盒均够自中国南京建城生物工程研究所。结果见图5。

本研究结果显示，与CPZ组相比，KD(实施例1)+CPZ组的血酮和海马中β-羟基丁酸水平显着增加(p<0.001，图5A和5B)，而KD(实施例1)+CPZ组的血糖明显降低(p<0.05，表4)。此外，ND，CZP+ND及CPZ+KD(实施例1)这三组中的AST,ALT,Cr和BUN水平无差异(图5C-5F)。上述结果表明，生酮饮食升高血酮浓度及海马β-羟基丁酸的浓度，且CPZ及生酮饮食均不会引起肝肾功能异常。

图5,表示生酮饮食组合物(实施例1)对小鼠血酮，海马β羟基丁酸水平及血生化指标的影响。(A)：第35天，各组小鼠血酮的含量变化；(B)：第35天，各组小鼠脑中β-羟基丁酸浓度的含量变化；(C-F)喂养小鼠5周后测定各组ALT(C)、AST(D)、BUN(E)和Cr(F)的含量变化。数据以Mean±SEM表示，与ND组比较，组间差异，用***p<0.001表示；与CPZ+ND组比较，组间差异用####p<0.001表示。N＝10只/组。

表4：表示生酮饮食组合物(实施例1和标准常规饮食对比)对小鼠血糖的影响。

标注：与CPZ+常规饮食相比，组间差异用采用a表示：a<0.05；表4中，数据表示为平均值±平均值标准误差(Mean±SEM)表示。

4.组织制备方法与上述效果实验1中的大脑组织制备方法一致。

免疫组化染色

脑切片经过脱蜡和水化后，将脑切片放在0.3％H2O2的0.01M PBS中30min，以消除内源性过氧化物酶活性，然后将切脑片浸入柠檬酸盐缓冲液(pH＝6.0)中，在微波炉中煮沸进行抗原修复，取出切片后，用10％的正常山羊血清(Sigma，USA)封闭1h。脑切片与一抗体在4℃下孵育过夜：对于髓鞘碱性蛋白，兔抗MBP多克隆抗体(1：1,000，Millipore)；对于少突胶质前体细胞，兔抗NG2多克隆抗体(1：200，Dako Cytomation)；对于活化的小胶质细胞，兔抗CD68多克隆抗体(1：600，Abcam)，对于活化的M1型小胶质细胞，兔抗CD16/32多克隆抗体(1：600，Abcam)，对于星型胶质细胞，兔抗GFAP多克隆抗体(1：200，Dako Cytomation)，第二天，将脑切片在PBS中洗涤3次，每次5分钟，并在室温下与二抗山羊抗兔IgG(1：500，Proteintech)孵育2h，PBS洗涤3次，每次5分钟，之后加入亲和素-生物素-过氧化物酶复合物工作液，孵育30min(ABC Kit，Vector Laboratories，Burlingame)。二氨基-3,3'联苯胺显色(DAB，Dako Cytomation，Germany)。在Zeiss Axioskop 40显微镜(Carl Zeiss，Oberkochen，Germany)下观察免疫染色。每平方毫米计算NG2、CD68+、CD16/32+和GFAP+阳性细胞数。

Western-blot

获取小鼠海马总蛋白(MinuteTM Total Protein Extraction Kit，Invent)。使用BCA法测定蛋白浓度(BCA Protein Assay kit，SangonBiotech)。随后，通过SDS-PAGE电泳分离出目的蛋白，然后将其转印到PVDF膜(Millipore，Billerica，MA，USA)上，将膜放入Tris缓冲盐溶液pH 7.4的5％脱脂奶中室温封闭2小时后，用TBST清洗3遍，加入一抗孵育过夜，包括：兔抗CNPase(Proteintech，1：10,000)，兔抗抗SIRT1(MilliporeCorporate，1：2,000)，兔抗p-Akt(Ser473)(Abcam，1：125)，兔抗-mTOR(Abcam，1：2,000)和兔抗PPAR-γ(Abcam，1：800)，β-actin(Proteintech，1：10,000)，GAPDH(Ambion，1：20,000)。第二天，将PVDF膜取出，用TBST洗涤三次，每次5分钟，并在室温放入含TBST配制1:5000的山羊抗兔二抗的孵育盒中，置于37℃温箱中缓慢震荡1h，取出后，并用TBST洗涤3次，每次5分钟。用吸水纸将PVDF膜上的TBST液吸干后，取适量混匀的ECL化学发光液均匀滴加在PVDF膜上，将其放入凝胶成像系统的机器中，调整曝光时间进行摄片，利用Image-ProPlus软件分析条带的IOD值并记录数据。通过与ND组蛋白水平比较各组之间蛋白表达水平。

MBP免疫组化结果显示，ND组海马区颜色分布较均匀，CPZ脱髓鞘组较正常组相比染色变浅且不均匀(p<0.001，图6A和图6C),而KD(实施例1)干预治疗后，海马区域MBP髓鞘染色明显变深，显著高于CPZ+ND组(p<0.001，图6A和图6C)，但仍不如ND组染色深。

NG2免疫组化结果显示，与ND组相比，CPZ+ND脱髓鞘组阳性NG2细胞密度较高(p<0.001，图6B和图6D),而KD(实施例1)干预治疗后，海马区域阳性NG2细胞密度降低(图6B和图6D)。

CNPase Western-blot结果显示，与ND组相比，CPZ+ND脱髓鞘组显著抑制CNPase的表达(p<0.001，图6E和图6F)，而KD(实施例1)干预治疗后，促进海马区CNPase的表达(图6E和图6F)。上述结果表明，生酮饮食促进少如胶质前体细胞分化为成熟的少突胶质细胞。结果表明生酮饮食(实施例1)减少了CPZ诱导海马区脱髓鞘的程度。

图6，表示生酮饮食(实施例1)对小鼠海马区髓鞘变化的影响。(A)：MBP免疫组化染色，(B)：NG2免疫组化染色；(C)：各组MBP免疫阳性百分比；(D)：定量分析各组中组海马区NG2+细胞的密度；(E)：Western-blot法检测小鼠海马CNPase蛋白表达水平，以β-action蛋白作为内参；(F)：定量分析ND、CPZ和KD+CPZ组CNPase蛋白表达水平。比例尺＝200μm；数据以Mean±SEM表示，与ND组比较，组间差异，用***p<0.001表示；与CPZ+ND组比较，组间差异用####p<0.001表示。N＝5只/组。

5.组织学检测

HE染色

(1)各组脑组织经固定后，石蜡包埋，4μm切片

(2)脑组织切片经二甲苯脱蜡，再经各级乙醇至水洗：二甲苯(I)5min→二甲苯(Ⅱ)5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min

(3)苏木素染色5min，自来水冲洗

(4)盐酸乙醇分化30s。

(5)自来水冲洗10min

(6)置伊红液2min。

(7)常规脱水，透明，封片：95％乙醇(I)min→95％乙醇(Ⅱ)1min→100％乙醇(I)1min→100％乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性树脂封固。

尼氏染色

将大脑切片置于Milli-Q水中20分钟，然后在焦油紫染色液中染色30分钟，Milli-Q水中冲洗3次，每次5分钟。大脑切片在以下梯度乙醇(75％，90％，100％))中进行水化。之后，在二甲苯中透明5分钟，中性树脂封固。

HE染色法检测海马神经元的完整性和有序性。ND组，海马神经元形态圆润光滑，完整性好，且排列规则紧密(图7A)。图7B是图7A黑色方框标记的区域代表海马区的DG区域的放大图，如图7B所示，CPZ喂食后，小鼠海马区出现神经元萎缩且海马神经元排列不规则。KD(实施例1)治疗后，海马DG区神经元回复正常形态(图7B)。尼氏染色结果显示(图7C)，ND组齿状回颗粒神经元排列相对线性，尼氏小体丰富。与ND组相比，CPZ+ND组出齿状回颗粒神经元固缩和神经元分层紊乱，而KD(实施例1)干预治疗后，受损的海马齿状回颗粒神经元神经元恢复。上述结果表明，生酮饮食有益于海马神经元的恢复。

图7，表示生酮饮食(实施例1)海马区组织病理学分析。(A)第35天，ND、CPZ+ND和CPZ+KD组小鼠海马区H&E染色，比例尺＝200μm；(B)海马DG区H&E染色，图7B是图7A黑色方框区域的放大，为海马的DG区，比例尺＝100μm；(C)第35天，海马DG区Nissl染色，比例尺＝100μm。

6.组织学检测

为了进一步说明KD(实施例1)对脱髓鞘的保护作用是否与抑制小胶质细胞的过度活化有关，本研究通过对小胶质细胞标记分子CD68及M1型小胶质细胞标记分子CD16/32进行免疫组化染色鉴定，分析KD(实施例1)对活化小胶质细胞的影响。结果见图8，与ND组相比，CPZ+ND组CD68+细胞(图8A和8C，p<0.001)和CD16/32+细胞(图8B和8D，p<0.001)的数量均显着增加。然而，KD(实施例1)干预治疗5周后，CD68+和CD16/32+细胞的数量显着减少(图8C和8D，p<0.001)，表明KD(实施例1)抑制了CPZ过度活化的小胶质细胞，尤其是抑制了促炎M1型小胶质细胞。

图8，表示生酮饮食(实施例1)在海马区对活化小胶质细胞的影响。(A)：各组海马区CD68免疫组化标记图；(B)：各组海马区CD16/32免疫组化标记图；(C)：定量分析ND、CPZ+ND和KD+CPZ组中CD68+细胞的密度；(D)定量分析ND、CPZ+ND和KD+CPZ组中CD 16/32+细胞的密度。细胞核呈蓝色。比例尺＝200μm。数据以Mean±SEM表示，与ND组比较，组间差异，用*p<0.05,***p<0.001表示；与CPZ+ND组比较，组间差异用####p<0.001表示。N＝5只/组。

7.本发明通过对星型胶质细胞标记分子GFAP进行免疫组化染色鉴定，分析生酮饮食(实施例1)对活化星型胶质细胞的影响。与ND组相比，CPZ+ND组GFAP+细胞(图9A和9B，p<0.001)的数量均显着增加。然而，KD(实施例1)干预治疗5周后，GFAP+细胞的数量显着减少(图9A和9B，p<0.01)，表明KD(实施例1)抑制了CPZ引起的星型胶质细胞的过度增值。

图9，表示生酮饮食(实施例1)在海马区对星型胶质细胞的影响。(A)第35天，ND、CPZ+ND和CPZ+KD组小鼠海马区GFAP免疫组化染色，比例尺＝200μm；(B)定量分析ND、CPZ+ND和KD+CPZ组中小鼠海马区GFAP+细胞的密度。数据以Mean±SEM表示，与ND组比较，组间差异，用***p<0.001表示；与CPZ+ND组比较，组间差异用###p<0.01表示。N＝5只/组。

8.本研究通过对海马中GSH水平、GSH-Px活性和MDA的含量进行检测，分析生酮饮食(实施例1)抗氧化的能力。取定量的脑组织加入预冷的Tris-Hcl缓冲液(pH＝7.40),用玻璃匀浆器上下研磨制成10％的组织匀浆(w/v)。GSH-Px活性、GSH和MDA含量按照试剂盒说明书进行测定。GSH-Px检测试剂盒、GSH检测试剂盒和MDA检测试剂盒均来自中国南京建城生物工程研究所。

与ND组相比，CPZ+ND组GSH水平及GSH-Px活性显著降低，MDA水平显著升高(图10，p<0.001)。然而，KD(实施例1)干预治疗5周后，GSH水平及GSH-Px活性显著升高，MDA水平显著降低，说明KD(实施例1)可提高海马区抗氧化应激的能力，对缓解氧化应激反应有一定效果。

图10，表示生酮饮食(实施例1)抗氧化应激的能力。(A-C)第35天，定量分析小鼠海马中GSH水平(A)、GSH-Px活性(B)和MDA含量(C)。数据以Mean±SEM表示，与ND组比较，组间差异，用*p<0.05,***p<0.001表示；与CPZ+ND组比较，组间差异用####p<0.01，####p<0.001表示。N＝5只/组。

9.Western-blot结果显示，与ND组相比，CPZ+ND组SIRT1、p-Akt、mTOR和PPAR-γ的蛋白表达水平性显著降低(图11)。然而，KD(实施例1)干预治疗5周后，SIRT1、p-Akt、mTOR和PPAR-γ的蛋白表达水平显著升高，(图11)。因此，本研究结果说明，KD(实施例1)可通过增强SIRT1/p-Akt/mTOR/PPAR-γ的蛋白表达来降低CPZ诱导的中枢神经系统海马区髓鞘脱失的程度。

图11，表示在CPZ诱导脱髓鞘模型中，生酮饮食(实施例1)促进SIRT1、p-Akt、mTOR和PPAR-γ的蛋白表达。(A)：第35天，Western-blot法检测各组海马中SIRT1、p-Ak和mTOR的蛋白表达水平，以β-action蛋白作为内参；(B-D)定量分析ND、CPZ+ND和CPZ+KD组中SIRT1(B)、p-Ak(C)和mTOR(D)的蛋白表达水平。(E)第35天，Western-blot法检测各组海马中的PPAR-γ蛋白表达水平，以GAPDH蛋白作为内参；(F)定量分析ND、CPZ+ND和CPZ+KD组中PPAR-γ的蛋白表达水平。数据以Mean±SEM表示，与ND组比较，组间差异，用**p<0.01,***p<0.001表示；与CPZ+ND组比较，组间差异用#p<0.05，####p<0.001表示。N＝5只/组。

三、效果实验3：实施例1与对比例3对比。

CPZ脱髓鞘模型的建立，按照质量为0.2％的比例，将CPZ加入到饲料中，混匀喂养小鼠35天，诱导脱髓鞘。将30只小鼠随机分为3组(每组10只)，分别为：(i)双环己酮草酰二腙组(CPZ+ND)，含有0.2％双环己酮草酰二腙的标准常规饮食喂养小鼠；(ii)生酮饮食(实施例1)干预治疗双环己酮草酰二腙组(CPZ+实施列1)，喂养0.2％双环己酮草酰二腙的同时进行生酮饮食干预，直到实验结束；(iii)生酮饮食(对比例3)干预治疗双环己酮草酰二腙组(CPZ+对比例3)，喂养0.2％双环己酮草酰二腙的同时进行生酮饮食干预，直到实验结束。

统计分析

采用SPSS 20.0软件进行数据分析。多组间比较采用One-way ANOVA分析及Tukeypost hoctest的事后检验分析。数据表示为平均值±平均值标准误差(Mean±SEM)。组间差异用采用“*”表示：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

1.血酮及血糖的测量。

采用手持式酮体测定仪及手持式血糖测定仪测定血酮和血糖浓度。每7天测一次血酮及血糖含量，结果见表5。本研究结果显示，与CPZ+ND组相比，CPZ+实施列2和CPZ+对比例3组的血酮水平显着增加而血糖水平显著降低。尤其是脂肪：(蛋白质+碳水化合物)质量比为4：1的实施例1生酮组合物比对比例3[脂肪：(蛋白质+碳水化合物)质量比为1：1]的生酮组合物血酮浓度升高的更高，说明质量比为4:1的生酮饮食组合物更有效的产生酮体。

表5：表示生酮饮食组合物(实施例1和对比例3)对小鼠血酮的影响

标注：与CPZ+常规饮食相比，组间差异用采用a表示：a<0.05；与CPZ+对比例3，组间差异用采用b表示：b<0.05,n＝10只/组，表5中，数据表示为平均值±平均值标准误差(Mean±SEM)表示。

2.实验动物行为学检测

Morris水迷宫实验(Morriswatermaze，MWM)

本研究结果表明，实施例1和对比例3干预治疗5周后，尤其是实施例1治疗后小鼠到达目标的总距离减少，穿越目标平台的次数增加及在目标象限中花费的时间增多(图12)。以上数据表明，两种生酮饮食组合物虽然都可以挺高小鼠的空间记忆力，尤其是实施例1能更有效地增强了CPZ小鼠的学习记忆能力，说明质量比为4：1的实施例1能更有效的提高海马区的神经保护作用，这可能与实施例1能更有效的产生酮体有关，见图12(左图为常规饮食，中间图为CPZ+实施例1，右图为CPZ+对比例3)和结果表6。

表6：实例1和对比例3对Morris水迷宫实验各参数的影响

水迷宫检测指标CPZ+常规饮食CPZ+实施例1CPZ+对比例3达目标的总距离(mm)1282±45.103800.59±17.383^ab972.67±36.818^a穿越目标平台的次数增加(次数)3.29±0.1527.89±0.169^ab6.26±0.415^a目标象限中花费的时间(s)22.09±0.66229.08±0.594^ab25.42±0.652^a

图12：实例1和对比例3Morris水迷宫实验小鼠的运动轨迹，B代表起点，E代表终点。。表3：实例1和对比例3对Morris水迷宫实验各参数的影响。数据以Mean±SEM表示。N＝10只/组。与CPZ+常规饮食相比，组间差异用采用a表示：a<0.05，与CPZ+对比例3相比，组间差异用采用b表示：b<0.05

四、工艺方法对于产品形态的影响。

利用实施例1所述的方法制备得到的产品与对比例1所述的制备方法得到的产品进行对比，本发明的中药活性成分中链甘油三酯生酮饮食组合物实施例1冲调后整杯呈现均匀的状态，且无沉淀，而对比例1所述的产品冲调后整杯不均匀，有少量沉淀和悬浮，实施例1的产品形态明显要比对比例1中的形态好。即本发明所述的过塞混合和分步混合，及混合时候的温度和湿度的控制效果明显，获得的产品品质明显更优。

根据本发明的研究结果表明，本研究构建的含有中药活性成分中链甘油三酯生酮饮食组合物在CPZ诱导的急性髓鞘脱失动物模型中，能够抑制中枢神经系统海马区的神经病变，改善实验动物的认知功能，增强动物的探索能力，促进髓鞘脱失部位少突胶质前体细胞的分化成熟，抑制小胶质细胞(尤其是M1型小胶质细胞)的过度活化，抑制过度活化的星型胶质细胞，增强中枢神经系统海马区抗氧化能力，对海马区神经元起到保护的作用，此外，研究结果显示，本研究构建的含有中药活性成分中链甘油三酯生酮饮食组合物通过激活SIRT1/PPAR-γ和SIRT1/p-Akt/mTOR信号通路，抑制CPZ诱导的中枢神经系统病变。由上可知，通过以上实施例的实验结果表明，本研究构建的含有中药活性成分中链甘油三酯生酮饮食组合物能够减轻神经炎症、提高抗氧化能力和缓解海马神经元损伤，抑制海马区髓鞘脱失的作用，起到神经保护作用。因此可以证实，本发明的生酮饮食组合物可作为预防或治疗改善多发性硬化症临床症状的有效策略和途径。

以上对本发明所提供的一种含有中药活性成分中链甘油三酯生酮饮食组合物可以缓解海马神经元损伤，具有抗氧化和抑制神经炎性的作用，对神经系统起到保护的作用。本发明中应用了具体个例对本发明的抑制髓鞘脱失、抗氧化、抑制神经炎性及加强海马神经元的保护作用的机理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进，修饰及抑制海马脱髓鞘机理的探究，如抑制或是增强SIRT1、PPAR-γ、p-Akt和mTOR基因/蛋白表达的化合物设计与修饰。这些改进，修饰及抑制/促进脱髓鞘机理的探究，也应当落入本发明权利要求的保护范围内。