一种紫草素抗菌最强部位的制备方法

摘要

本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种紫草素氯抗菌最强部位的制备方法。其技术方案：一种紫草素抗菌最强部位的制备方法，包括如下步骤：S1：称取干燥的紫草，粉碎后，加入乙醇反复浸提多次直至浸提液无色；收集浸提液，浓缩，得醇提物；S2：将醇提物与纯净水混悬，然后加入石油醚，分离除去石油醚部位；S3：在石油醚萃取后的剩余液体中，加入乙酸乙酯，反复萃取多次直至萃取液无色，分离除去乙酸乙酯部位；S4：在乙酸乙酯萃取后的剩余液体中，加入氯仿，反复萃取多次直至萃取液无色，收集、合并萃取液，回收溶剂，浓缩至浸膏，即得氯仿萃取部位。本发明提供了一种紫草素最强抗菌部位的制备方法。

说明书

技术领域

本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种紫草素氯抗菌最强部位的制备方法。

背景技术

紫草是紫草科植物新疆紫草或内蒙古紫草的干燥根，为常用中药之一，最早记载在《神农本草经》中。其味甘、咸，性寒，归心、肝经，具有清热、活血、解毒等功能。新疆紫草也被称为软紫草，其主要活性成分具有多种生理活性，包括抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等。

紫草具有抗菌作用，并有相关文献作为佐证。但是关于紫草抗菌，大多数研究关注于其综合提取物的抗菌活性，未见其有进一步筛选抗菌最强有效部位的相关报道，这使得紫草的临床应用受到了限制。

发明内容

本发明克服了现有技术的不足，提供一种紫草素最强抗菌部位的制备方法，解决了现有技术中仅能得到紫草素综合提取物的问题。

为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种紫草素抗菌最强部位的制备方法，包括如下步骤：

S1：称取干燥的紫草，粉碎后，加入乙醇反复浸提多次直至浸提液无色；收集浸提液，浓缩，得醇提物；

S2：将醇提物与纯净水混悬，然后加入石油醚，分离除去石油醚部位；

S3：在石油醚萃取后的剩余液体中，加入乙酸乙酯，反复萃取多次直至萃取液无色，分离除去乙酸乙酯部位；

S4：在乙酸乙酯萃取后的剩余液体中，加入氯仿，反复萃取多次直至萃取液无色，收集、合并萃取液，回收溶剂，浓缩至浸膏，即得氯仿萃取部位。

经药理实验证明，紫草95％乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的MIC值分别为20g·L-1、50g·L-1。氯仿萃取物对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的MIC值均为5g·L-1。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为20g·L-1。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物对粪肠球菌的MIC值分别为20g·L-1。因此，氯仿萃取部位具有显著的抗菌活性。

作为本发明的优选方案，在步骤S4之后，进行以下步骤：

S5：从氯仿萃取部位分离出异戊酰紫草素。

氯仿萃取部位中含有紫草素、左旋紫草素、β-β-二甲基丙烯紫草素、乙酰紫草素、异戊酰紫草素。紫草素、左旋紫草素、β-β-二甲基丙烯紫草素、乙酰紫草素、异戊酰紫草素对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为1.98mmol/L、0.87mmol/L、2.17mmol/L、0.69mmol/L、0.13mmol/L，则异戊酰紫草素抑菌效果较好。异戊酰紫草素对粪肠球菌的MIC值为0.26mmol/L(P<0.01)。本发明提取并筛选出氯仿萃取部位具有显著的抗菌活性，氯仿萃取部位中单体异戊酰紫草素抑菌效果最显著。

作为本发明的优选方案，在步骤S1中，加入乙醇反复浸提时，先加紫草粉1～2倍量的95％乙醇，室温浸泡24～72h后，取出浸提液加入新的乙醇，反复浸提多次直至浸提液无色。先加1～2倍量的95％乙醇在室温浸泡24～72h，保证紫草粉能被充分浸提，提高浸提率。

作为本发明的优选方案，在步骤S1中，加入乙醇反复浸提时，先加紫草粉1.5倍量的95％乙醇，室温浸泡48h后，取出浸提液加入新的乙醇，反复浸提多次直至浸提液无色。当加入的乙醇的量为紫草粉的1.5倍，且浸泡时间为48h时，浸提效果最好。

作为本发明的优选方案，在步骤S2中，将醇提物与纯净水混悬时，醇提物与纯净水的比例为1：1，然后加入石油醚的体积为醇提物与纯净水混悬液体积的1倍。醇提物与纯净水的比例为1：1，保证醇提物与纯净水充分混悬。加入石油醚的体积为醇提物与纯净水混悬液体积的1倍，可有效得到石油醚部位。

作为本发明的优选方案，在步骤S3中，加入的乙酸乙酯的体积为石油醚萃取后的剩余液体体积的1倍。加入的乙酸乙酯的体积为石油醚萃取后的剩余液体体积的1倍时，可有效得到乙酸乙酯部位。

作为本发明的优选方案，在步骤S4中，加入的氯仿的体积为乙酸乙酯萃取后的剩余液体体积的1倍。加入的氯仿的体积为乙酸乙酯萃取后的剩余液体体积的1倍，可有效得到氯仿萃取部位。

作为本发明的优选方案，在步骤S1中，浓缩时，将浸提液于40℃水浴锅中用旋转蒸发仪旋转浓缩。浸提液在40℃水浴锅中用旋转蒸发仪旋转浓缩，可提高浓缩效率，提升浓缩效果。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明通过在紫草粉中加入乙醇，得到醇提物，再依次通过在剩余液体中加入石油醚、乙酸乙酯、氯仿，得到氯仿萃取部位，从而精确分离出紫草中抗菌活性最强部位。氯仿萃取部位具有较强抗金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的功效，相比于紫草综合提取物的抗菌活性大大提高，可用于可压疮导致的开放性皮肤溃疡及细菌感染；可用于缓解人们近年来对抗生素的不合理使用导致的耐药菌不断增加的问题，也可用于作为对青霉素过敏的替代抗菌药。

2、氯仿萃取部位中异戊酰紫草素对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为0.13mmol/L，则异戊酰紫草素抑菌效果较好。异戊酰紫草素对粪肠球菌的MIC值为0.26mmol/L(P<0.01)。本发明通过将异戊酰紫草素，得到单体异戊酰紫草素，其抑菌效果最显著。

3、本发明通过对紫草95％乙醇提取物、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的MIC值进行测定，发现氯仿萃取部位具有最强的抗菌活性。通过分离氯仿萃取部位中的紫草素、左旋紫草素，β-β-二甲基丙烯紫草素、乙酰紫草素、异戊酰紫草素，并进行金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的MIC值进行测定，发现氯仿萃取部位中异戊酰紫草素的抗菌活性最强。因此，本发明通过科学的实验，分析出紫草抗菌活性最强部位，实验可靠简便。

附图说明

图1是紫草各部位的提取、分离流程图；

图2是紫草提取物及不同溶剂萃取物抑菌圈直径；

图3是紫草乙醇提取物、不同溶剂萃取物对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌生长动力学的影响；

图4是异戊酰紫草素对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌生物扫描电子显微镜SEM观察结果；

图5是异戊酰紫草素对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌生物透射电子显微镜TEM观察结果。

图中，A-石油醚；B-乙酸乙酯；C-氯仿；D-正丁醇。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明作详细的说明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例：

一种紫草素抗菌最强部位的制备方法，包括如下步骤：

S1：称取干燥的紫草，粉碎后，加紫草粉1.5倍量的95％乙醇，室温浸泡48h后，取出浸提液加入新的乙醇，反复浸提多次直至浸提液无色；收集浸提液，于40℃水浴锅中用旋转蒸发仪旋转浓缩，得醇提物；

S2：将醇提物与纯净水1:1混悬，然后加入1倍体积的石油醚，分离除去石油醚部位；

S3：在石油醚萃取后的剩余液体中，加入1倍体积的乙酸乙酯，反复萃取多次直至萃取液无色，分离除去乙酸乙酯部位；

S4：在乙酸乙酯萃取后的剩余液体中，加入1倍体积的氯仿，反复萃取多次直至萃取液无色，收集、合并萃取液，回收溶剂，浓缩至浸膏，即得氯仿萃取部位；

S5：从氯仿萃取部位分离出异戊酰紫草素。

经药理实验证明，紫草95％乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的MIC值分别为20g·L-1、50g·L-1。氯仿萃取物对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的MIC值均为5g·L-1。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为20g·L-1。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物对粪肠球菌的MIC值分别为20g·L-1。因此，氯仿萃取部位具有显著的抗菌活性。

氯仿萃取部位中含有紫草素、左旋紫草素、β-β-二甲基丙烯紫草素、乙酰紫草素、异戊酰紫草素。紫草素、左旋紫草素、β-β-二甲基丙烯紫草素、乙酰紫草素、异戊酰紫草素对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为1.98mmol/L、0.87mmol/L、2.17mmol/L、0.69mmol/L、0.13mmol/L，则异戊酰紫草素抑菌效果较好。异戊酰紫草素对粪肠球菌的MIC值为0.26mmol/L(P<0.01)。本发明提取并筛选出氯仿萃取部位具有显著的抗菌活性，氯仿萃取部位中单体异戊酰紫草素抑菌效果最显著。

实验过程：

1、紫草各提取部位的制备

称取干燥的紫草，粉碎后放入提取桶，加1.5倍量95％乙醇，室温浸泡48h后，取出浸提液加入新的乙醇，反复浸提多次直至浸提液无色。收集浸提液，于40℃水浴锅中用旋转蒸发仪旋转浓缩，得醇提物；醇提物与纯净水1:1混悬，然后加入1倍体积的石油醚，反复萃取多次直至萃取液无色，收集、合并萃取液，回收溶剂，浓缩至浸膏，即得有效部位A；在石油醚萃取后的剩余液体中，加入1倍体积的乙酸乙酯，反复萃取多次直至萃取液无色，收集、合并萃取液，回收溶剂，浓缩至浸膏，即得有效部位B；在乙酸乙酯萃取后的剩余液体中，加入1倍体积的氯仿，反复萃取多次直至萃取液无色，收集、合并萃取液，回收溶剂，浓缩至浸膏，即得有效部位C，在氯仿萃取后的剩余液体中，加入1倍体积的正丁醇，反复萃取多次直至萃取液无色，收集、合并萃取液，回收溶剂，浓缩至浸膏，即得有效部位D。过程如图1所示。

2、供试液的制备

称取一定量的供试品浸膏，用DMSO溶解后，配制成不同浓度的供试液。

3、各部位抑菌活性研究

对紫草提取和萃取部位进行了抑菌活性研究，具体方法和结果如下：

1)菌悬液的制备

在超净台中，用接种环将冻存的供试菌种接种至营养琼脂平板上，在恒温培养箱中37℃培养24h。再挑取单个菌落接种于NB培养基内，37℃、180r/min振荡培养24h，得所需菌悬液。

2)牛津杯法测定抑菌圈直径

将0.1mL菌悬液加入到营养琼脂平板上均匀涂布，再用无菌镊子将灭菌的牛津杯(内径6mm，外径8mm，高10mm的不锈钢杯)放在含菌培养基上，往杯中加入0.1mL供试药液，使用DMSO作阴性对照，青霉素(6g/L)作阳性对照，放入恒温培养箱中37℃培养24h后，测量抑菌圈直径。

结果见图2。

3)二倍稀释法测定MIC

取无菌96孔板，每孔加入营养肉汤培养基(含1％TTC)0.1mL，在第1孔加入已知浓度的供试药液0.1mL，充分混匀后，吸取0.1mL加入第2孔充分混匀，照此重复至第7孔，吸取0.1mL弃去，再在1-7孔各加入0.02mL的菌液。第8孔只加菌液，作细菌对照，第9孔只加供试药液，作为供试药液对照。然后将96孔板放入恒温培养箱中37℃培养24h，观察培养基的颜色变化。

得到结果，紫草95％乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的MIC值分别为20g/L、50g/L；氯仿萃取物对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的MIC值均为5g/L。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为20g/L。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物对粪肠球菌的MIC值分别为20g/L。紫草素、左旋紫草素，β-β-二甲基丙烯紫草素、乙酰紫草素、异戊酰紫草素对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为1.98mmol/L、0.87mmol/L、2.17mmol/L、0.69mmol/L、0.13mmol/L。异戊酰紫草素抑菌效果较好。异戊酰紫草素对粪肠球菌的MIC值为0.26mmol/L(P<0.01)。

4)生长曲线法观察细菌生长状况

将金黄色葡萄球菌、粪肠球菌菌悬液分别转接到含浓度为MIC、1/2MIC、1/4MIC的紫草提取物的营养肉汤培养基中，调整初始菌量为106CFU·L-1，未处理的菌悬液作为空白对照，6g/L青霉素作为阳性对照。37℃、180r/min振荡培养。每2h用酶标仪测量样品在580nm处的光密度值(OD值)，以绘制生长曲线。

由图3可知，与空白对照组相比，紫草95％乙醇提取物浓度为20、10、5g/L时，对金黄色葡萄球菌增殖具有明显的抑制作用(P<0.01，Fig 3A)；紫草氯仿萃取物浓度为5、2.5、1.25g/L时，对金黄色葡萄球菌增殖也具有明显的抑制作用(P<0.01，Fig 3B)。紫草95％乙醇提取物浓度为50、25g/L时，对粪肠球菌增殖具有明显抑制作用(P<0.01)，浓度为12.5g/L时，对粪肠球菌增殖也有一点的抑制作用(P<0.05)，见Fig 3C)；氯仿萃取物浓度为5、2.5g/L时，对粪肠球菌皆具有明显抑制增殖作用(P<0.01，Fig 3D)。结果表明，紫草95％乙醇提取物、氯仿萃取物对金黄色葡萄球菌抑制效果较好，对粪肠球菌抑制作用较明显。

5)生物扫描电子显微镜SEM，透射电镜TEM观察

按照“1)”的方法对细菌进行前处理，加药后37℃、180r/min振荡孵育，取样5mL，2000r/min离心10min，收集细菌取样，用2.5％的戊二醛溶液4℃固定过夜。倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用1％的锇酸溶液固定样品1-2h；小心取出锇酸废液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用梯度浓度(包括30％，50％，70％，80％，90％和95％五种浓度)的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100％的乙醇处理两次，每次20min。用乙醇与醋酸异戊酯的混合液(V/V＝1/1)处理样品30min，再用纯醋酸异戊酯处理样品1h或放置过夜。临界点干燥。镀膜，观察。

如图4，空白组细胞表面光滑，细胞间有清晰边界，SEM下细胞成簇状排列(4A图4C图)。异戊酰紫草素组细胞排列松散，未成簇状，细胞边界模糊，表明其细胞壁受损(4B组4D组)，说明异戊酰紫草素具有很好的抗金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的作用。

如图5,空白组细胞结构完整清晰，细胞结构光滑，细胞浆和核质体明显，细胞分裂间隙明显(5A图5C图)。异戊酰紫草素给药组，细胞胞内物质丢失，细胞质凝结，空泡明显，细胞边界模糊，分裂异常(5B图5D图)。说明异戊酰紫草素具有很好的抗金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的作用。