用于早期宫颈癌筛查的基因标志物及其产品和应用

摘要

本发明公开了用于早期宫颈癌筛查的基因标志物及其产品和应用，所述基因标志物为基因SPRR2B和CLU的组合，本发明通过验证发现所述基因标志物对宫颈癌具有较好的诊断效能，准确性、敏感性和特异性均较高，此外，本发明还提供了用于早期筛查宫颈癌的产品，对早期筛查和早期干预治疗宫颈癌、提高患者的生存和生活质量具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于体外诊断领域，尤其是用于早期宫颈癌筛查的基因标志物SPRR2B和CLU，以及所述基因标志物相关的产品，及所述产品在早期宫颈癌筛查中的应用。

背景技术

宫颈癌在发展中国家是第二大常见的恶性肿瘤，在女性癌症死亡原因中位居第3位(Schiffman M,Solomon D.Clinical practice.Cervical-cancer screening withhuman papillomavirus and cytologic contesting[J].N Engl J Med.2013,369(24):2324-31.)，近年来，宫颈癌的全球发病呈“年轻化”的趋势，且近90％的宫颈癌死亡病例发生在发展中国家。宫颈癌发病率的地域性差异反映了宫颈癌筛查(用于检测和排除宫颈癌前病变)的有效性和人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)感染率的差异。人乳头瘤病毒已被证实是导致宫颈癌发生的确切病因，持续性感染高危型HPV是宫颈癌前病变及宫颈癌发生发展的必要条件，据统计，约99％的宫颈癌患者中可以检测到HPV，其中最常见的致癌亚型是HPV16和HPV18(Tommasino M.The human papillomavirus family and itsrole in carcinogenesis[J].Seminars in Cancer Biology.2014,26:13-21.)。此外，宫颈癌的发生是一个由量变到质变的连续发展过程，从癌前病变发展到宫颈癌大约需经历几年、甚至十几年(Petry KU.HPV and cervical cancer[J].Scand J Clin Lab InvestSuppl.2014,244:59-62)，因而早期的筛查与诊断非常关键，也是目前宫颈癌预防和控制的主要手段。

目前，宫颈脱落细胞检测一直是筛查宫颈癌的标准方法，该方法的应用使得宫颈癌的发病率和病死率均得到了一定程度的降低，然而，传统的宫颈脱落细胞检测方法具有明显的局限性，例如巴氏细胞学筛查方法，它是基于对宫颈样本形态学改变的主观解释，在取样过程中必须对转化区的样本细胞进行充分的收集。当病变发生率较低，尤其是在已接种HPV疫苗的人群中使用巴氏试验进行筛查时，得出正确的检查结果更加困难。此外，筛查工作的高度重复性所导致的医务人员疲劳可能会增加错误结果的发生率。即传统的宫颈脱落细胞检测方法存在低准确性，低灵敏度，主观性较强，容易造成误诊和漏诊等缺点。可见目前临床上尚缺乏可靠的反映宫颈癌发生、发展的基因标志物，以及所述基因标志物相关的产品，因此，发现能够用于宫颈癌早期快速、准确筛查的基因标志物，并将其应用于早期宫颈癌的筛查中对于本领域而言是至关重要的。

发明内容

本发明的目的在于提供用于早期宫颈癌筛查的基因标志物及其产品，并将其应用于宫颈癌的早期筛查中，经验证发现所述基因标志物SPRR2B和CLU与宫颈癌的发生密切相关，且将其联合应用于早期宫颈癌的筛查中的诊断效能较好，具有较高的准确性、敏感性和特异性，为宫颈癌的早期筛查诊断和临床预防治疗提供了具有价值的生物学信息。

本发明中所述的基因标志物包括基因SPRR2B和基因CLU，基因SPRR2B和基因CLU的信息分别如下：

基因SPRR2B(small proline rich protein 2B)在NCBI中的Gene ID为6701，位于1号染色体长臂2区1带3亚带上；

基因CLU(clusterin)在NCBI中的Gene ID为1191，位于8号染色体短臂2区1带1亚带上。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

本发明的第一方面提供了检测基因标志物表达水平的试剂在制备用于早期宫颈癌筛查的诊断产品中的应用。

进一步，所述基因标志物为SPRR2B和CLU。

进一步，所述诊断产品包括通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片检测样本中基因标志物SPRR2B和CLU表达水平的试剂。

本发明中所述的RT-PCR，是指逆转录聚合酶链式反应，本发明中所述的实时定量PCR，是指实时定量聚合酶链式反应，PCR通常使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；RT-PCR则将逆转录酶用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA)，然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝。

本发明中所述的免疫检测，是指蛋白免疫检测方法，包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别基因标志物上不同表位的两种抗体进行该基因标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫检测法。

本发明中所述的原位杂交，是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程，原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。

本发明中所述的芯片检测，是指基因芯片检测，又称DNA芯片检测或生物芯片检测，它是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而对靶分子的序列和数量进行分析。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别所述基因标志物的探针；或

特异性扩增所述基因标志物的引物；或

特异性结合所述基因标志物的抗体、抗体片段、亲和性蛋白。

进一步，所述样本为受试者的样本；

优选地，所述受试者的样本包括受试者来源的血液或组织。

本发明的第二方面提供了一种用于宫颈癌早期诊断的试剂盒。

进一步，所述试剂盒包含检测待测样本中基因标志物的试剂，所述基因标志物为SPRR2B和CLU。

进一步，所述检测待测样本中基因标志物的试剂包括检测待测样本中基因标志物的mRNA表达水平的试剂、检测待测样本中基因标志物编码的多肽和/或蛋白表达水平的试剂。

进一步，所述检测待测样本中基因标志物的mRNA表达水平的试剂包括特异性识别所述基因标志物的探针、特异性扩增所述基因标志物的引物。

进一步，所述检测待测样本中基因标志物编码的多肽和/或蛋白表达水平的试剂包括特异性结合所述基因标志物的抗体、抗体片段、亲和性蛋白。

进一步，所述试剂盒包括qPCR试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、ELISA试剂盒、电化学发光检测试剂盒；

优选地，所述试剂盒还包括用于评估受试者是否患有宫颈癌或患宫颈癌的风险的说明书。

进一步，所述试剂盒还包括使用说明书或标签、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

进一步，所述使用说明书或标签注明了所述试剂盒用于早期诊断受试者是否患有宫颈癌或患有宫颈癌的风险。

本发明中所述的引物，是指包含5-100个核苷酸的核酸片段，优选地，是指包含能起始酶促反应(例如，酶促扩增反应)的15-30个核苷酸。

本发明中所述的探针，是指包括至少5个核苷酸的核酸序列，例如，包含5-100个核苷酸，其能在指定条件下与目标基因的表达产物或者该表达产物的扩增产物杂交形成复合物，杂交探针上还可以包括用于检测的标记物，所述标记物包括(但不限于)用于荧光定量PCR或荧光原位杂交的标记物。

本发明中所述的抗体，是指针对抗原位点的特异性免疫球蛋白，本发明中的抗体是指与本发明中所述的基因标志物SPRR2B和CLU多肽和/或蛋白特异性结合的抗体，可以根据本领域中的常规方法来制造抗体，抗体的形式包括多克隆抗体或单克隆抗体、抗体片段(例如：Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)抗体、多特异性抗体(例如：双特异性抗体)、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白，以及包含抗原结合位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要该抗体表现出所需的生物结合活性即可。

本发明的第三方面提供了基因标志物SPRR2B和CLU在构建预测宫颈癌的计算模型或者嵌入了所述计算模型的系统中的应用；

优选地，所述计算模型以基因标志物SPRR2B和CLU的表达水平作为输入变量，通过生物信息学方法进行运算，输出宫颈癌患病的风险概率。

本发明的第四方面提供了一种用于宫颈癌早期筛查的系统。

进一步，所述系统包括：

(1)宫颈癌评估装置：包括控制单元和存储单元，用于评估受试者是否患有宫颈癌；

(2)彼此通信连接的信息通信终端装置：用于提供关于来自受试者的样本中基因标志物SPRR2B和CLU的表达水平的数据；

所述宫颈癌评估装置的控制单元包括如下四个单元：

1)数据接收单元：用于接收从所述信息通信终端设备传输的关于所述样本中基因标志物SPRR2B和CLU表达水平的数据；

2)判别值计算单元：其基于对由所述数据接收单元接收的所述样本中基因标志物SPRR2B和CLU的表达水平以及存储在所述存储单元中的作为解释变量的基因标志物SPRR2B和CLU的表达水平的判别来计算判别值；

3)判别值基准评价单元：其基于由所述判别值计算单元计算的判别值，对所述受试者宫颈癌的发生风险情况进行评价；

4)评估结果发送单元：其将由所述判别值基准评估单元获得的所述受试者的评估结果发送到所述信息通信终端装置。

进一步，所述样本选自受试者的血液或组织。

本发明中所述的受试者，是指任何动物，还指人类和非人类的动物。术语“非人类的动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等。在优选的实施方式中，所述受试者为人。

本发明中所述的基因标志物，是指在具有第二表型(例如没有疾病)的受试者和具有第一表型(例如患有疾病)的受试者之间差异表达的基因，具体地，与来自具有第二表型(例如没有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品相比，它在来自具有第一表型(例如患有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品中显著差异性地存在(即增加或减少)；基因标志物可以在任何水平上差异性地存在，但是一般以如下的水平存在，所述水平增加了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、或更多；或一般以如下的水平存在，所述水平减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％(即不存在)。

相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：

本发明首次发现基因SPRR2B和CLU联合可用于早期宫颈癌的筛查中，经验证发现，所述基因SPRR2B和CLU联合具有较好的诊断效能，敏感性和特异性均较高，此外，本发明验证所采用的样本量多，结果准确可靠，本发明为本领域宫颈癌的早期筛查提供了新的途径。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示基因SPRR2B、基因CLU在训练集中的差异表达的结果图，其中，A图：SPRR2B，B图：CLU；

图2显示基因SPRR2B、基因CLU在验证集中的差异表达的结果图，其中，A图：SPRR2B，B图：CLU；

图3显示基因SPRR2B、基因CLU在训练集中的ROC曲线结果图，其中，A图：SPRR2B，B图：CLU；

图4显示基因SPRR2B+CLU联合在训练集中的ROC曲线结果图；

图5显示基因SPRR2B、基因CLU在验证集中的ROC曲线结果图，其中，A图：SPRR2B，B图：CLU；

图6显示基因SPRR2B+CLU联合在验证集中的ROC曲线结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1筛选宫颈癌中差异表达的基因

1、数据来源

本研究中所采用的数据均来自于Gene Expression Omnibus(GEO)数据库，以“cervical cancer”为检索关键词，在GEO数据库中进行检索，在排除细胞系或动物水平上的研究、以及单样本的研究后有两套数据集被纳入，分别为GSE63514和GSE39001；

其中，GSE63514来自GPL570平台，包含了28个宫颈癌患者的组织样本和24个正常的组织样本；GSE39001数据集中包含两个平台的数据，分别是来自GPL201和GPL6244的数据，来自GPL201的数据中包含有43个宫颈癌患者的组织样本和12个正常的组织样本，来自GPL6244的数据中包含有19个宫颈癌患者的组织样本和5个正常的组织样本；

将上述从GEO数据库中下载的数据集GSE63514作为训练集，样本量为Case：Normal＝28：24；将上述从GEO数据库中下载的数据集GSE39001作为验证集，样本量为Case：Normal＝62：17。

2、数据预处理

对上述从GEO数据库下载的训练集和验证集的原始数据进行了标准化处理。其中，对于下载的数据集GSE63514的基因表达矩阵文件，使用GPL平台注释文件对基因表达谱进行注释，将基因探针转换成gene symbol，其中多个探针对应同一个基因的，取平均值作为该基因的表达量；对于下载的数据集GSE39001的基因表达矩阵文件，使用对应的GPL平台注释文件对基因表达谱进行注释，将基因探针转换成gene symbol，其中多个探针对应同一个基因的取平均值，使用R包“sva”中的combat函数移除批次效应。

3、差异表达分析

使用R软件中的“limma”包分别对上述数据集GSE63514和GSE39001中经预处理的数据进行差异表达分析，其中，差异表达基因的筛选标准均为：|log

4、实验结果

结果显示，筛选得到的训练集和验证集中的差异表达基因取交集后得到92个共有的表达趋势一致的差异表达基因，其中，筛选出的差异表达基因SPRR2B和CLU在训练集中的差异表达情况见表1和图1A-B，在验证集中的差异表达情况见表2和图2A-B，基因SPRR2B和CLU在宫颈癌中的表达情况均为下调，且差异具有统计学意义。

表1基因在训练集中的差异表达结果

表2基因在验证集中的差异表达结果

实施例2基因SPRR2B和CLU诊断效能的验证

1、实验方法

对实施例1中筛选出的在宫颈癌中差异表达的基因SPRR2B和CLU，使用R包“pROC”(版本1.15.0)执行接收器工作特性(ROC)分析，计算曲线下面积(AUC)以评估基因SPRR2B、基因CLU、基因SPRR2B+CLU联合分别在训练集和验证集中对诊断宫颈癌的准确性，以及其敏感性和特异性。AUC值的范围是0到1，其中，0.7是可接受的性能，而0.9是优异的性能；

在判断单独指标在训练集和验证集中的诊断效能时，直接使用基因的表达量进行分析，选择Youden指数最大的一点对应的水平作为其cutoff值，AUC在0.5

在判断指标联合在训练集和验证集中的诊断效能时，对各基因的表达水平进行Logistics回归分析，通过拟合出的回归曲线计算出每个个体患病与否的概率，确定不同的概率划分阈值，根据确定的概率划分阈值，计算得出联合诊断方案的灵敏度、特异性以及准确性等。

2、实验结果

结果见表3-4和图3-6，结果显示基因组合SPRR2B+CLU对宫颈癌的诊断效能显著优于单个基因SPRR2B、CLU的诊断效能，基因组合SPRR2B+CLU在训练集和验证集中的AUC值分别为0.863、0.880，敏感性和特异性分别为0.833和0.821、0.765和0.887，表明了基因组合SPRR2B+CLU具有较好的诊断效能，能够应用于宫颈癌的早期筛查诊断中。

表3基因在训练集中的诊断效能结果

表4基因在验证集中的诊断效能结果

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。