用于胃癌早期筛查的基因标志物及其应用

摘要

本发明公开了一种用于胃癌早期筛查的基因标志物，所述基因标志物包含SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的外周血胃癌特征基因序列。本发明还公开了上述基因标志物在制备筛查早期胃癌的产品中的应用。本发明的基因标志物，用于胃癌早期筛查，敏感性高、特异性强，且由于是以临床上最易采集的外周血为检测样本，检测方便，适用于胃癌的大规模人群筛查和早期诊断，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于胃癌早期筛查的基因标志物及其应用。

背景技术

胃癌是一类起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，我国属于胃癌高发国家，每年胃癌新发病例约40万例，死亡约35万例，因胃癌死亡人数在所有恶性肿瘤致死人数中居第三位，如何降低我国胃癌的发病率和死亡率是亟待解决的重大公共卫生问题。胃癌的预后与诊治时机密切相关，中晚期胃癌的5年生存率不足30％，且患者生活质量低，给家庭及国家带来沉重的负担。而大部分早期胃癌在内镜下即可获得根治性治疗，5年生存率超过90％，大大节约了医疗资源。因此，卫生部发布的《中国癌症预防与控制规划纲要(2004—2010)》中明确指出，癌症的早期发现、早期诊断及早期治疗是降低死亡率及提高生存率的主要策略。在胃癌高危人群中进行筛查，促进胃癌的早诊早治，是改变我国胃癌诊治严峻形势的重要途径。

目前，我国早期胃癌的诊治率低于10％，远远低于日本(70％)和韩国(50％)。造成我国胃癌诊治率低的原因很多，其中一个重要的原因是缺乏可用于全体人群普查的简便、有效的胃癌筛查方法。内镜及内镜下活组织检查是目前诊断胃癌的金标准，然而内镜检查依赖设备和内镜医师资源，而且内镜检查费用相对较高，用于胃癌普查需要消耗大量的人力、物力。更重要的是，内镜检查等诊断方法作为侵入性检查方式，检查过程比较痛苦，患者接受程度较差，特别是很多无症状、低胃癌发病风险的患者更是难以接受。因此，即使对于日本等发达国家而言，也尚未采用内镜进行大规模胃癌筛查。

肿瘤的发生本质是机体正常细胞在遗传和环境等多种复杂因素的共同作用下，发生癌基因激活以及抑癌基因失活，这种演变是一种涉及多基因、多步骤的过程，最终导致细胞失去原有的生长分化调节而出现异常增生的结果。肿瘤组织作为一种异常组织形式，在体内的形成和增殖的过程中，不可避免的会受到机体免疫系统的识别和干预。同时，肿瘤细胞在免疫编辑(immunoediting)作用下，自身基因表达也会发生变化以逃脱免疫杀伤，并且肿瘤组织周围也会产生一个抑制免疫细胞的微环境(micro environment)。因此，肿瘤细胞在机体内的发生、发展过程也是一个免疫系统与肿瘤细胞相互作用的动态过程。

在免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用过程中，外周血细胞充当了一个重要角色。血液是人体最大的组织器官，而血细胞是为数不多的，可以同几乎所有组织细胞进行信息交流的细胞种类。当体内组织器官发生损伤、炎症以及肿瘤等疾病，血细胞参与全身免疫系统的信号传递和交流，自身的基因表达会发生相应变化以携带和传递相应信息。此外，当血液流经肿瘤组织周边的微环境时，血细胞也会直接或间接地响应肿瘤微环境的改变，发生相应的基因表达变化。血细胞正是通过这种调节自身基因表达变化的方式，参与免疫系统等全身各系统的信息传递和交换的。血细胞的这种基因表达变化远早于机体由于疾病产生的明显体征变化，因此，如果能在肿瘤病人的血液中发现肿瘤特征性的基因表达变化，就可以通过紧密监测血细胞基因的表达谱，敏感地捕捉到体内肿瘤等恶性疾病发生的微信息，为肿瘤的早期检测、监测提供可靠证据。而且外周血基因表达检测作为一种简便、无创性的检查方式，受检者易于接受，检查依从性高，对恶性肿瘤的早期筛查/诊断具有非常大的应用价值。

发明内容

本发明要解决目前早期胃癌筛查技术欠缺的问题，提供一种用于胃癌早期筛查的基因标志物，该标志物用于胃癌早期筛查和诊断，具有很高的敏感性和特异性，而且由于采用临床上最易采集的外周血进行检测，使用方便，适于胃癌早期大规模人群筛查。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种用于胃癌早期筛查的基因标志物，所述基因标志物包含：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的外周血胃癌特征基因序列。

在本发明的另一方面，提供了一种上述基因标志物在制备胃癌早期筛查的产品中的应用。

优选的，所述筛查早期胃癌的产品包括：用实时定量PCR、基因表达谱芯片检测或RNA测序方法筛查胃癌的产品。

所述用实时定量PCR筛查胃癌的产品包含特异扩增SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示SLC6A6、HNRNPA3、ERBB2IP、NPEPPS、KRAS和MLL这6个外周血胃癌特征基因序列的引物。

所述用基因表达谱芯片检测筛查早期胃癌的产品包含：与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示外周血胃癌特征基因序列杂交的探针。

在本发明的另一方面，还提供了一种用于胃癌早期筛查的检测试剂盒，包含特异性针对SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示外周血胃癌特征基因序列的引物。该试剂盒还包含特异性针对GAPDH内参基因序列的引物。

所述试剂盒还包含与PCR扩增片段特异性结合的水解探针或非特异性结合的SYBR Green染料。

优选的，所述引物的序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.20所示；所述水解探针的序列如SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.27所示。

在本发明的另一方面，还提供了一种用于胃癌早期筛查的检测试剂盒，包含特异性针对SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示外周血胃癌特征基因序列的探针。

利用本发明的试剂盒，可以检测受检者外周血中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示早期胃癌特征基因序列的表达情况，然后根据表达上调或下调的信息得出受检者患胃癌的风险概率，从而实现对胃癌的早期筛查和诊断。

本发明的基因标志物，用于胃癌早期筛查，敏感性高、特异性强，且由于是以临床上最易采集的外周血为检测样本，检测方便，适用于胃癌的大规模人群筛查和早期诊断，促进胃癌早期发现，提高胃癌治愈率，具有广阔的应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明利用筛选出的特征基因甄别胃癌的箱线图；

图2是本发明利用筛选出的特征基因对胃癌诊断的ROC AUC图。

具体实施方式

本发明是建立在人类全基因表达谱定量分析基础上，通过定量分析外周血总RNA的基因表达状况，比较胃癌病人、健康人、以及胃癌以外其它5种恶性肿瘤病人(肝癌、肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、前列腺癌)等三组样本中外周血基因的表达差异，再通过逻辑回归分析筛选出6个在早期胃癌患者外周血中发生差异表达(基因表达上调或下调)的基因信号，即外周血中胃癌特征性基因(生物标志物)的表达信号。采用逻辑回归分析方法，基于筛选出的6个胃癌外周血特征基因建立胃癌的风险预测模型。最后，采用荧光定量RT-PCR、基因表达谱芯片或RNA测序技术定量检测受检者外周血中该6个早期胃癌基因标志物的相对表达量，利用建立的胃癌的风险预测模型判别受检者是否患胃癌及相应的风险概率。

实施例1胃癌特征基因标志物的筛选

胃癌特征基因的筛选包括以下步骤：

1)采用PAXgene^TM>

2)采用PAXgene Blood RNA Kit抽提试剂盒提取上述外周血样本的总RNA。用AgilentBioanalyzer 2100生物分析仪检测RNA样本的片段完整度(RIN)，用Nano1000微量紫外分光光度仪检测RNA样本的纯度。所有RNA样本必须符合以下质控条件：RNA产率大于2微克，28S/18S峰的比值大于1，RIN值大于7，260nm/280nm的吸光度比值大于1.8。

3)采用Affymetrix Gene Profiling Array cGMP U133P2芯片(人类全基因表达谱芯片)检测上述RNA样本的基因表达信号。

4)利用AffymetrixExpression Console软件中的MAS5统计学方法对每个样本的基因表达谱芯片检测结果进行归一化处理(Normalization)，仅保留表达信号值在100-10000范围内且在所有样本中均表达的基因作为侯选基因进行后续分析。

5)分析上述侯选基因与胃癌的相关性，按基因与胃癌的相关性系数的高低进行排序，将与疾病相关性高的侯选基因和与疾病相关性低的侯选基因两两配对，组成一系列侯选基因组合。

6)用逻辑回归统计分析方法评估每种侯选基因组合对胃癌的诊断作用，计算每种侯选基因组合的受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve,ROC曲线)和曲线下面积值(Area Under Curve，AUC)，筛选出对胃癌具有最佳甄别能力的基因组合。

7)利用实时荧光定量PCR方法对筛选出的基因组合进行验证，保留在定量PCR和基因表达谱芯片检测中表达变化一致的基因作为胃癌的外周血特征基因，筛选出SLC6A6、HNRNPA3、ERBB2IP、NPEPPS、KRAS和MLL六个外周血胃癌特征基因，该6个外周血胃癌特征基因序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示。

8)用逻辑回归统计分析方法评估上述6个基因构成的基因组合对胃癌的诊断作用，计算该基因组合的ROC AUC，建立以下所示的胃癌风险预测模型：

$>X=\log it\left(P\right)=\ln \frac{P}{1-P}=b_0+b_1{\mathrm{\Delta Ct}}_1+b_2{\mathrm{\Delta Ct}}_2+b_3{\mathrm{\Delta Ct}}_3+b_4{\mathrm{\Delta Ct}}_4+b_5{\mathrm{\Delta Ct}}_5+b_6{\mathrm{\Delta Ct}}_6$>

其中，P为受检者患胃癌的风险概率；b₀至b₆分别为相应的逻辑回归模型参数；ΔCt₁至ΔCt₆分别为6个胃癌基因标志物与内参基因的定量PCR循环数Ct值的差值；X为逻辑回归对数似然比(log>

实施例2利用筛选出的早期胃癌的基因标志物检测受检者是否患胃癌

1.方法步骤：

1)待检测样本外周血样品的收集：使用PAXgene^TM>

2)待检测样本外周血样品中总RNA的提取纯化：采用PAXgene Blood RNA Kit抽提试剂盒提取和纯化外周血中的总RNA，并用Agilent BioAnalyzer 2100型微量电泳分析仪鉴定提取的总RNA片段完整性和产量，用Nano1000微量紫外分光光度仪检测RNA样本的纯度。

3)反转录反应：使用Life Techonolgy公司的High-Capacity cDNA Reverse Transcriptionkit反转录试剂盒，使用总RNA为模板，以Olig(dT)为逆转录引物，进行逆转录反应合成cDNA。

4)荧光定量RT-PCR检测：根据6个基因标志物(SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6)及内参基因GAPDH的相关序列，设计特异性引物SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.20(其中，引物SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8用于特异性扩增SEQ ID NO.1所示的SLC6A6基因标志物，引物SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10用于特异性扩增SEQ ID NO.2所示的HNRNPA3基因标志物，引物SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.12用于特异性扩增SEQ ID NO.3所示的ERBB2IP基因标志物，引物SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.14用于特异性扩增SEQ ID NO.4所示的NPEPPS基因标志物，引物SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.16用于特异性扩增SEQ ID NO.5所示的KRAS基因标志物，引物SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18用于特异性扩增SEQ ID NO.6所示的MLL基因标志物，引物SEQ ID NO.19～SEQID NO.20用于特异性扩增内参基因GAPDH)，以该SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.20为引物，以SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.27为荧光探针(其中SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.26分别为SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.6特征基因序列的探针序列，SEQ ID NO.27是内参基因GAPDH的探针序列)或者采用可与PCR扩增片段非特异性结合的SYBR Green染料，利用反转录获得的cDNA作为扩增模板，进行实时荧光定量RT-PCR反应，获得该6个基因标志物在外周血样本中的mRNA相对含量。下述表1所列为荧光定量PCR反应体系。

表1荧光定量PCR反应体系

试剂浓度体积胃癌特征基因引物800nM2μL胃癌特征基因荧光探针200nM0.5μL内参基因引物800nM2μL内参基因荧光探针200nM0.5μL2X PCR MasterMix12.5μLcDNA模板2.67ng/μL7.5μL总计25μL

5)待检测样本结果的诊断：根据实时荧光定量PCR检测的SLC6A6、HNRNPA3、ERBB2IP、NPEPPS、KRAS和MLL这6个基因标志物在外周血样本中的mRNA相对含量，通过实施例1建立的胃癌风险预测模型，计算样本的逻辑回归对数似然比X值，X值≥0的检测结果判定为阳性，即胃癌患者；X值<0的检测结果判定为阴性，即健康人。

2.结果

采集了34例胃癌、28例健康人(Control)以及114例除胃癌以外其它恶性肿瘤患者的外周血样本，用荧光定量RT-PCR检测了外周血中早期胃癌6个基因标志物以及内参基因GAPDH的相对表达量，计算每个样本的逻辑回归对数似然比X值，X值≥0的为阳性检测结果，反之为阴性检测结果。将检测结果与病理检测结果比较，得出本发明6个基因标志物对早期胃癌筛查的灵敏度高、特异性强，具体检测结果见图1-2和下表2，其它恶性肿瘤包括除胃癌以外的30例肝癌、33例肺癌、20例鼻咽癌、10例乳腺癌和21例前列腺癌等。

表2对胃癌检测的灵敏度、特异性和ROC AUC值

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。