光棘球海胆活体性别鉴定用DNA分子标记及鉴定方法

摘要

本发明公开一种光棘球海胆活体性别鉴定用DNA分子标记及鉴定方法，DNA分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，鉴定方法按照如下步骤进行：采集光棘球海胆管足，提取光棘球海胆DNA；以所得到的DNA为模板，进行PCR反应，所述PCR反应上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；所述PCR反应体系为模板30~100ng，2XPCRmix10µL，上游引物2µmol，1µL，下游引物2µmol，1µL，灭菌水补至20µl；所述PCR反应程序为98℃变性30s；98℃变性10s、60℃退火15s、72℃延伸1min、进行30个循环；72℃后延伸5min；4℃保存PCR反应产物；对PCR反应产物进行电泳检测，扩增出长度为362bp特异性条带的为雌性个体，否则为雄性个体。

说明书

技术领域

本发明属于水产养殖性别鉴定技术领域，尤其涉及一种光棘球海胆活体性别鉴定用DNA分子标记及鉴定方法。

背景技术

光棘球海胆（

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种光棘球海胆活体性别鉴定用DNA分子标记及鉴定方法。

本发明的技术解决方案是：一种光棘球海胆活体性别鉴定用DNA分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。

一种基于上述光棘球海胆性别鉴定用DNA分子标记的鉴定方法，其特征在于按照如下步骤进行：

a. 采集光棘球海胆管足，提取光棘球海胆DNA；

b. 以所得到的DNA为模板，进行PCR反应，所述PCR反应上下游引物

的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2 和SEQ ID NO：3所示；所述PCR反应体系为模板30~100ng，2XPCRmix10µL，上游引物2µmol，1µL，下游引物2µmol，1µL，灭菌水补至20µl；所述PCR反应程序为98℃变性30s；98℃变性10s、60℃退火15s、72℃延伸1min、进行30个循环；72℃后延伸5min；4℃保存PCR反应产物；

c.对PCR反应产物进行电泳检测，扩增出长度为362bp特异性条带的为雌性个体，否则为雄性个体。

本发明只需采集少量光棘球海胆的管足组织，即可实现活体性别鉴定，准确率达100%，采集管足后个体的生长状态及存活率与对照组相比无明显差异，具有操作简单、快速及可信度高等优点。

附图说明

图1是本发明实施例样本的PCR反应产物进行电泳检测结果图。

图2是本发明实施例样本性腺组织学判定结果图。

具体实施方式

本发明采用经典酚氯仿法分别提取十只雄性光棘球海胆管足的基因组DNA和十只雌性光棘球海胆管足的基因组DNA，利用Illumina Hiseq Xten测序平台，进行2b-Rad测序。根据2b-Rad测序结果进行GWAS分析，筛选性别差异的DNA标签位点。经比较发现了核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的一段长度为27bp的序列只存在于雌性个体中，在雄性个体中没有，故发明了核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示的362bp的光棘球海胆活体性别鉴定用DNA分子标记。

基于上述光棘球海胆活体性别鉴定用DNA分子标记的鉴定方法，按照如下步骤进行：

a. 分别采集18只光棘球海胆管足，可采用试剂盒法或碱裂解法提取光棘球海胆DNA；

b. 以所得到的DNA为模板，进行PCR反应，所述PCR反应上下游引物

的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2 和SEQ ID NO：3所示；所述PCR反应体系为模板30~100ng，2XPCRmix10µL，上游引物（2µmol），1µL，下游引物（2µmol），1µL，灭菌水补至20µl；所述PCR反应程序为98℃变性30s；98℃变性10s、60℃退火15s、72℃延伸1min、进行30个循环；72℃后延伸5min；4℃保存PCR反应产物；

c. 配制1%的琼脂糖凝胶对PCR反应产物进行电泳检测，电泳结果为如图1所示：扩增出特异性条带为雌性个体，扩增不出特异性条带为雄性个体。1引物扩增出的特异性条带长度为362bp，M表示2kbDNAladder。

结果表明18只光棘球海胆中有9只为雌性，9只为雄性，分别编号为雌性1~9、雄性1~9。

光棘球海胆性腺组织学鉴定实验：

a. 将经过本发明鉴定的18只受检个体与对照组（未经过采集管足的18只光棘球海胆）在同等条件下饲养一个月，生长状态及存活率与对照组相比无明显差异。

b. 将经过上述一个月饲养的18只受检个体性腺分别置于4%多聚甲醛中固定，用于下述性腺组织学判定；4%多聚甲醛固定过夜，倒掉固定液并用PBS洗三次，随后用30%蔗糖室温渗透2~3小时，OCT包埋机包埋性腺组织块，使用冰冻切片机进行冰冻切片，用伊红/苏木精染色后，在显微镜下拍照，判定所取得的海胆性腺性别。结果如图2所示，18个图片分别为编号1~9的雌性和编号1~9的雄性，表明本发明实施例的光棘球海胆活体性别鉴定方法准确率为100%。

序列表

<110> 大连海洋大学

<120> 光棘球海胆活体性别鉴定用DNA分子标记及鉴定方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 362

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1 )..(362)

<223> 人工序列（Artificial）

<400> 1

tggcactttg gtgacaatac atacacctaa ttagcagtaa aatataatca aattcaactc 60

accaatgttg gaaaaaaaac ttagatacaa aaatcggaaa tctaatgtca atcctagcga 120

agagctgctt cgtattcatt gggtgcattt tttggtcgcc tggagcactg aatctccgtg 180

caaaatcgca acaaacttga tccatacctc attatatcat gtcgcgcata catgtagggt 240

gtctgaacga ttttttcaat ttttcctttt ggtttgtttt tcacgattat ggttgaataa 300

ttgagaaaat caactaccgg tactcagaag aacacatttc caatttcaag actcgcggtt 360

gt 362

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1 )..(21)

<223> 引物

<400> 2

tggcactttg gtgacaatac a 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1 )..(20)

<223> 引物

<400> 3

acaaccgcga gtcttgaaat 20

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 光棘球海胆(Strongylocentrotus nudus)

<400> 4

gcctggagca ctgaatctcc gtgcaaa 27