一种含哌嗪的阿魏酸衍生物、其制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种含哌嗪的阿魏酸衍生物、其制备方法及应用，属于药物合成和农业病害防治技术领域，其结构通式（Ӏ）如下所示，式中R

说明书

技术领域

本发明属于药物合成和农业防护技术领域，具体涉及一种含哌嗪的阿魏酸类衍生物，同时还涉及该含哌嗪的阿魏酸类衍生物的制备方法，及在抗植物病毒中的应用。

背景技术

植物病毒病在农业生产中是仅次于真菌的第二大类植物病害。近年来，植物病毒病的流行和暴发，对-作物产量和质量构成严重威胁。在农业生产中较为常见的植物病毒有烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)等，每年因植物病毒病所造成的经济损失高达200亿美元。由于病毒在植物体内具有绝对寄生性，使得植物病毒病防治较为困难。目前防治植物病毒病的主要方式以化学药剂防治为主，主要的化学药剂有宁南霉素和病毒唑，但宁南霉素具有见光易分解、易吸潮等不稳定性质；病毒唑存在防效差等问题。因此，亟待开发出绿色、高效、稳定的抗植物病毒药剂。

天然产物又称次级代谢产物，具有药效高，作用机制独特，环境友好等优点，在新药创制研发中起着重要作用。因此。基于天然产物对其进行结构修饰改造，已成为科研人员研究绿色农药的途径之一。阿魏酸是一种典型的天然酚酸，它是阿魏，当归，川穹等多种中药材的有效成分之一。药理活性研究发现，阿魏酸具有广谱的生物活性，如抑菌，消炎，抗病毒等。

发明人汪清民，王开亮，王兹稳，中国专利公开号CN102090412A于2011 年06月15日公开了阿魏酸及其衍生物在农药上的应用，其用作新型抗植物病毒剂能够很好的抑制植物病毒，对烟草花叶病毒显现出较好的抑制作用。在500 μg/mL的浓度下，阿魏酸对烟草花叶病毒的抑制率高达80％以上，高于病毒A，病毒唑，DADHT和DHT(抑制率均低于50％)。

发明人汪清民，吴萌，王兹稳，孟垂松，王开亮，呼艳娜，王力钟，中国专利公开号CN103626652A于2014年03月12日公开了3-芳基丙烯酸及其衍生物在农药方面的应用。汪清民课题组将阿魏酸母体结构扩宽为3-芳基丙烯酸类衍生物，以不同的芳香醛为原料设计合成了一系列的3-芳基丙烯酸类衍生物。生物活性测试结果表明，该系列化合物对烟草花叶病毒具有较高的抑制率。

2015年，Anurag Khatkar等(Res Chem Intermed.,2015,41:299–309)通过试管稀释法评价了所合成的阿魏酸衍生物对金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌的体外抗菌活性以及对白色念珠菌和黑曲霉的抗真菌活性。MBC/MFC研究的结果表明，合成的化合物活性范围在0.14-0.24mM之间，因此它们具有较好的抗细菌和抗真菌作用。

2020年，Maria

在对哌嗪类药物的研究发现，含哌嗪且N-取代的化合物表现出广泛的生物活性，如抗病毒和抗炎等。

2018年，Daniel C.Batista等(Inflammopharmacol.,2018,26:217–226)通过使用角叉菜胶诱导的爪水肿模型评估新型哌嗪衍生物的抗炎活性。实验结果表明，哌嗪衍生物在100mg/kg的剂量下所有小时内均减轻了水肿，其中以消炎痛为阳性对照药剂。

2020年，Vadabingi Nagalakshmamma等(Bioorganic Chemistry.,2020,104084)合成了一系列含脲/硫脲的哌嗪类衍生物。利用叶半枯斑法，对哌嗪类衍生物进行了抗TMV的活性评估。初步的研究结果表明：在500mg/mL浓度下，部分化合物的治疗，保护和钝化活性与阳性对照药剂宁南霉素相当。

综上所述，含阿魏酸、哌嗪结构的药物小分子具有广谱的生物活性，通过前期文献的调研，目前还未有将哌嗪活性基团引入阿魏酸结构中，并进行抗植物病毒的活性研究报道。

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种药物分子的活性强，对TMV 和CMV的抑制活性显著，其结构源于天然产物，环境友好、易代谢和降解，制备工艺简单，安全，理化性质相对稳定的含哌嗪的阿魏酸衍生物类抗植物病毒剂。

本发明的另一个目的在于提供该含哌嗪的阿魏酸衍生物的制备方法。

本发明的再一个目的提供该含哌嗪的阿魏酸衍生物在制备抗植物病毒(烟草花叶病毒(TMV)，黄瓜花叶病毒(CMV)药物方面的应用。

本发明的一种含哌嗪的阿魏酸衍生物，其结构通式(I)如下所示：

式中R

R

优选化合物如下：

化合物C1:(E)-1-(4-苄基哌嗪-1-基)-3-(4-((2-氟苄基)氧基)-3-甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮；

化合物C2:(E)-3-(4-((2-氟苄基)氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-(2-氧代-2-苯基乙基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物C3:(E)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(4-(2-甲氧基苄基) 哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物C4:(E)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(4-(2-(2-甲氧基苯基)-2-氧乙基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物C5:(E)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(4-(3,4,4-三氟丁-3- 烯-1-基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物C6:(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-(4-氟苄基) 哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物D1:(E)-1-(4-(4-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-3-(4-((2-氟苄基) 氧基)-3-甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮；

化合物D2:(E)-4-氯-1-(4-(3-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)丙烯酰基)哌嗪-1-基)丁-1-酮；

化合物D3:(E)-3-(3-甲氧基-4-(3-甲基苄基氧基)苯基)-1-(4-(4-甲氧基苯甲酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物D4:(E)-1-(4-(3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)丙烯酰基) 哌嗪-1-基)-5-氯戊烷-1-酮；

化合物D5:(E)-3-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(4-(2-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物D6:(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-(4-甲氧基苯甲酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物D7:(E)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(4-(3-(三氟甲基) 苯甲酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E1:(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-甲苯磺酰基哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E2:(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-((4-氟苯基) 磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E3:(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-((4-溴苯基) 磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E4:(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-((4-硝基苯基) 磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E5:(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E6:(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-((2,5-二氯苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E7:(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-((4-溴-3-(三氟甲基)苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E8:(E)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(4-((4-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E9:(E)-1-(4-((4-溴苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)-3-(4-异丙氧基 -3-甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E10:(E)-1-(4-((2,5-二氯苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E11:(E)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(4-((4-(三氟甲基) 苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E12:(E)-1-(4-((4-溴苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)-3-(3-甲氧基-4- (丙-2-炔-1-基氧基)苯基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E13:(E)-1-(4-((4-氟苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)-3-(3-甲氧基-4- (丙-2-炔-1-基氧基)苯基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E14:(E)-3-(3-甲氧基-4-(丙-2-炔-1-基氧基)苯基)-1-(4-((4- 硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E15:(E)-3-(3-甲氧基-4-(丙-2-炔-1-基氧基)苯基)-1-(4-((4- (三氟甲基)苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E16:(E)-3-(3-甲氧基-4-(2-甲基苄基氧基)苯基)-1-(4-((4- 硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-烯-1-酮；

化合物E17:(E)-3-(3-甲氧基-4-((2-甲基苄基)氧基)苯基)-1-(4-((4- (三氟甲基)苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E18:(E)-3-(4-(苄氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-((4-硝基苯基) 磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E19:(E)-3-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(4-(乙基磺酰基)哌嗪 -1-基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E20:(E)-1-(4-(乙基磺酰基)哌嗪-1-基)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮；

化合物E21:(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-(乙基磺酰基) 哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮。

本发明的含哌嗪的阿魏酸类衍生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)以反式阿魏酸为原料，浓硫酸为催化剂，甲醇为溶剂制备阿魏酸甲酯 (中间体1)，如下所示：

(2)以中间体1和不同取代的卤代烃为原料，碳酸钾和碘化钾为催化剂，乙腈为溶剂制备(E)-3-(4-取代氧基-3-甲氧基苯基)丙烯酸甲酯(中间体2)，如下所示：

(3)将制备的中间体2在碱性条件下水解，酸性调节至3-4左右得到(E)-3- (4-取代氧基-3-甲氧基苯基)丙烯酸(中间体3)，如下所示：

(4)以中间体3和1-Boc-哌嗪为原料，CDI为缩合剂，二氯甲烷为溶剂进行酰胺缩合得到(E)-4-(3-(4-(4-取代氧基-3-甲氧基苯基)丙烯酰基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(中间体4)，如下所示：

(5)以中间体4为原料，三氟乙酸(TFA)存在的条件下脱保护得到(E)-3- (4-取代氧基-3-甲氧基苯基)-1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(中间体5)，如下所示：

(6)以中间体5，取代的苯磺酰氯或取代的酰氯或卤代烃为原料，二氯甲烷为溶剂制备含哌嗪的阿魏酸类衍生物(目标化合物C，D，E)，如下所示：

本发明的含哌嗪的阿魏酸类衍生物在用于制备抗植物病毒(TMV和CMV)的药物上的应用。

本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明通过哌嗪结构单元桥接，将易得到的天然产物阿魏酸和取代的苯磺酰氯或取代的酰氯或卤代烃进行活性拼接，制备一系列结构新颖的含哌嗪的阿魏酸衍生物，哌嗪具有较好的氮平衡对称结构，将其引入药物分子中，能够有效的改善药物的药代动力学性质，调节药物的脂水分配系数和酸碱平衡常数；有效地增加了阿魏酸衍生物分子的碱性和水溶性，从而增强药物分子的活性。本发明是以天然产物反式阿魏酸、卤代烃、取代的酰氯、取代的磺酰氯为原料，分别经酯化、取代、水解、缩合等合成目标化合物，其结构源于天然产物，环境友好、易代谢和降解，制备工艺简单，安全，理化性质相对稳定。本发明的含哌嗪的阿魏酸类衍生物对TMV和CMV的抑制活性十分显著，明显优于阳性对照药剂宁南霉素和病毒唑。

具体实施方式：

实施例1：(E)-1-(4-苄基哌嗪-1-基)-3-(4-((2-氟苄基)氧基)-3-甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为C1)的制备方法，包括以下步骤：

(1)反式阿魏酸甲酯的制备

在250mL的三颈烧瓶中加入反式阿魏酸(20.00g，102.99mmoL)和100mL 的无水甲醇溶液，常温搅拌5min后，缓慢滴加浓H

(2)(E)-3-(4-((2-氟苄基)氧基)-3-甲氧基苯基)丙烯酸甲酯的制备

在50mL的三颈烧瓶中加入反式阿魏酸甲酯(1.00g，4.80mmoL)、结晶碳酸钾(1.00g,4.80mmoL)和10mL乙腈溶液，常温搅拌1h后，向体系中加入邻氟苄氯(0.69g，4.80mmoL)和KI(0.079g，0.48mmoL)，升温至80℃。反应结束后，过滤，减压回收溶剂得结晶状固体1.35g，收率88.86％。

(3)(E)-3-(4-((2-氟苄基)氧基)-3-甲氧基苯基)丙烯酸的制备

在50mL的三颈烧瓶中加入(E)-3-(4-(((2-氟苄基)氧基)-3-甲氧基苯) 丙烯酸甲酯(1.35g，4.27mmoL)和40％的NaOH水溶液(NaOH 0.35g，8.54mmoL) 和甲醇溶液，升温至75℃。反应结束后，减压回收溶剂，浓缩物溶于10mL水中，再将体系用稀盐酸调节pH至3～4。最后，减压过滤得白色固体0.85g，收率65.88％。

(4)(E)-4-(3-(4-((2-氟苄基)氧基)-3-甲氧基苯基)丙烯酰基)哌嗪-1- 甲酸叔丁酯的制备

在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-((2-氟苄基)氧基)-3-甲氧基苯基) 丙烯酸(0.85g，2.81mmoL)、CDI(0.46g，2.81mmoL)和干燥的二氯甲烷溶液，常温搅拌20min后，向体系中加入1-Boc-哌嗪(0.53g、2.81mmoL)，继续进行常温搅拌。反应结束后，减压浓缩，柱层析得中间体(E)-4-(3-(4-((2- 氟苄基)氧基)-3-甲氧基苯基)丙烯酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯0.65g，收率49.13％。

(5)(E)-3-(4-((2-氟苄基)氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(哌嗪-1-基)丙 -2-烯-1-酮的制备

在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-4-(3-(4-((2-氟苄基)氧基)-3-甲氧基苯基)丙烯酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.65g，1.38mmoL)，CF

(6)(E)-1-(4-苄基哌嗪-1-基)-3-(4-((2-氟苄基)氧基)-3-甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为C1)的制备

在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-((2-氟苄基)氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.81mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入苄氯(0.10g，0.81mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到油状化合物0.22g，收率58.98％。

实施例2：(E)-3-(4-((2-氟苄基)氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-(2-氧代-2-苯基乙基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为C2)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-((2-氟苄基)氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.81mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入α-溴代苯乙酮(0.16g，0.81mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到油状化合物0.24g，收率49.84％。

实施例3：(E)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(4-(2-甲氧基苄基) 哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为C3)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)-1- (哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入邻甲基苄氯(0.14g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到油状化合物0.23g，收率57.12％。

实施例4：(E)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(4-(2-(2-甲氧基苯基)-2-氧乙基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为C4)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)-1- (哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入邻甲氧基-2-溴苯乙酮(0.23g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到油状化合物0.21g，收率47.08％。

实施例5：(E)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(4-(3,4,4-三氟丁-3- 烯-1-基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为C5)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)-1- (哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-溴-1,1,2-三氟丁烯(0.23g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到油状化合物0.20g，收率49.20％。

实施例6：(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-(4-氟苄基) 哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为C6)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基) -1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-氟苄氯(0.23g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到0.20g，收率49.11％。

实施例7：(E)-1-(4-(4-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)-3-(4-((2-氟苄基) 氧基)-3-甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为D1)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-((2-氟苄基)氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.81mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入对氟苯甲酰氯(0.13g，0.81mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.19g，收率47.63％。

实施例8：(E)-4-氯-1-(4-(3-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)丙烯酰基)哌嗪-1-基)丁-1-酮(化合物编号为D2)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，1.03mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-氯丁酰氯(0.15g，1.03mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到油状化合物0.20g，收率49.02％。

实施例9：(E)-3-(3-甲氧基-4-(3-甲基苄基氧基)苯基)-1-(4-(4-甲氧基苯甲酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为D3)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(3-甲氧基-4-(3-甲基苄基氧基) 苯基)-1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.81mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入对甲氧基苯甲酰氯(0.14g，0.81mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.12g，收率37.12％。

实施例10：(E)-1-(4-(3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)丙烯酰基) 哌嗪-1-基)-5-氯戊烷-1-酮(化合物编号为D4)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基) -1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入5-氯戊酰氯(0.15g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到油状化合物0.18g，收率45.21％。

实施例11：(E)-3-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(4-(2-氟苯甲酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为D5)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，1.03mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入邻氟苯甲酰氯(0.16g，1.03mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到油状化合物0.18g，收率42.24％。

实施例12：(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-(4-甲氧基苯甲酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为D6)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基) -1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-甲氧基苯甲酰氯(0.16g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.17g，收率39.25％。

实施例13：(E)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(4-(3-(三氟甲基) 苯甲酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为D7)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-(异丙氧基)-3-甲氧基苯基) -1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入间三氟甲基苯甲酰氯(0.21g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到油状化合物0.22g，收率51.14％。

实施例14：(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-甲苯磺酰基哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E1)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基) -1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入对甲基苯磺酰氯(0.19g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.16g，收率36.94％。

实施例15：(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-((4-氟苯基) 磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E2)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基) -1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-氟苯磺酰氯(0.19g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.11g，收率25.40％。

实施例16：(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-((4-溴苯基) 磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E3)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基) -1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-溴苯磺酰氯(0.25g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.12g，收率23.20％。

实施例17：(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-((4-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E4)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基) -1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-硝基苯磺酰氯(0.22g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到黄色固体0.12g，收率27.71％。

实施例18：(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E5)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基) -1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-三氟甲基苯磺酰氯(0.24g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.14g，收率32.33％。

实施例19：(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-((2,5-二氯苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E6)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基) -1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入2,5-二氯苯磺酰氯(0.22g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.15g，收率34.64％。

实施例20：(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-((4-溴-3- (三氟甲基)苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E7)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基) -1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-溴-3-三氟甲基苯磺酰氯(0.32g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.18g，收率41.56％。

实施例21：(E)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(4-((4-硝基苯基) 磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E8)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-(异丙氧基)-3-甲氧基苯基) -1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-硝基苯磺酰氯(0.22g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到黄色固体0.17g，收率39.33％。

实施例22：(E)-1-(4-((4-溴苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E9)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-(异丙氧基)-3-甲氧基苯基) -1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-溴苯磺酰氯(0.25g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.15g，收率34.71％。

实施例23：(E)-1-(4-((2,5-二氯苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E10)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-(异丙氧基)-3-甲氧基苯基) -1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入2,5-二氯苯磺酰氯(0.24g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.21g，收率48.91％。

实施例24:(E)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(4-((4-(三氟甲基) 苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E11)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-(异丙氧基)-3-甲氧基苯基) -1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-三氟甲基苯磺酰氯(0.24g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.20g，收率46.27％。

实施例25:(E)-1-(4-((4-溴苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)-3-(3-甲氧基-4- (丙-2-炔-1-基氧基)苯基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E12)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(3-甲氧基-4-(丙-2-炔-1-基氧基) 苯基)-1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，1.00mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-溴苯磺酰氯(0.26g，1.00mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.19g，收率36.62％。

实施例26:(E)-1-(4-((4-氟苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)-3-(3-甲氧基-4- (丙-2-炔-1-基氧基)苯基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E13)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(3-甲氧基-4-(丙-2-炔-1-基氧基) 苯基)-1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，1.00mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-氟苯磺酰氯(0.19g，1.00mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.13g，收率25.06％。

实施例27:(E)-3-(3-甲氧基-4-(丙-2-炔-1-基氧基)苯基)-1-(4-((4- 硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E14)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(3-甲氧基-4-(丙-2-炔-1-基氧基) 苯基)-1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，1.00mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-硝基苯磺酰氯(0.22g，1.00mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.18g，收率34.70％。

实施例28:(E)-3-(3-甲氧基-4-(丙-2-炔-1-基氧基)苯基)-1-(4-((4- (三氟甲基)苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E15)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(3-甲氧基-4-(丙-2-炔-1-基氧基) 苯基)-1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，1.00mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-三氟甲基苯磺酰氯(0.24g，1.00mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V) 为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.20g，收率37.56％。

实施例29:(E)-3-(3-甲氧基-4-(2-甲基苄基氧基)苯基)-1-(4-((4-硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-烯-1-酮(化合物编号为E16)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(3-甲氧基-4-(2-甲基苄基氧基) 苯基)-1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，1.00mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-硝基苯磺酰氯(0.18g，1.00mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.25g，收率52.16％。

实施例30:(E)-3-(3-甲氧基-4-((2-甲基苄基)氧基)苯基)-1-(4-((4- (三氟甲基)苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E17)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(3-甲氧基-4-(2-甲基苄基氧基) 苯基)-1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.82mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-三氟甲基苯磺酰氯(0.20g，0.82mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V) 为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.24g，收率50.07％。

实施例31:(E)-3-(4-(苄氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-((4-硝基苯基) 磺酰基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E18)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-(苄氧基)-3-甲氧基苯基)-1- (哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.85mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入4-硝基苯磺酰氯(0.18g，0.85mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到黄色固体0.24g，收率48.12％。

实施例32:(E)-3-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(4-(乙基磺酰基)哌嗪 -1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E19)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-乙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.85mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入乙基磺酰氯(0.13g，0.85mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.24g，收率49.13％。

实施例33:(E)-1-(4-(乙基磺酰基)哌嗪-1-基)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E20)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-异丙氧基-3-甲氧基苯基)-1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，1.00mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入乙基磺酰氯(0.13g，1.00mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到黄色固体0.23g，收率46.25％。

实施例34:(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基)-1-(4-(乙基磺酰基) 哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(化合物编号为E21)的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)～(5)同实施例1

(6)在50mL的圆底烧瓶中加入(E)-3-(4-(烯丙氧基)-3-甲氧基苯基) -1-(哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮(0.30g，0.99mmoL)和二氯甲烷溶液，常温搅拌，然后向体系中缓慢加入乙基磺酰氯(0.13g，0.99mmoL)。反应结束后，减压浓缩得粘稠物并经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯＝1:3(V/V)为洗脱液进行纯化，得到白色固体0.25g，收率48.32％。

以上实施例化合物的理化性质如表1所示，其核磁共振谱数据 如表2所示。

表1实施例化合物C1-C6，D1-D7,E1-E21的理化性质

表2实施例化合物C1-C6，D1-D7,E1-E21的核磁共振谱数据

试验例：实施例化合物C1-C6，D1-D7,E1-E21的抗植物病毒活性的测试实验方法：半叶枯斑法；

病毒：TMV，CMV，贵州大学精细化工研究开发中心；

烟草：芯叶烟(TMV枯斑寄主)，苋色藜(CMV枯斑寄主)；

对照药剂：宁南霉素，病毒唑；

磷酸缓冲液：pH 7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲液(PBS)；pH 7.0的0.01mol/L 的磷酸缓冲液(PBS)；pH 7.5的0.5mol/L的磷酸缓冲液(PBS)

试剂：乙二胺四乙酸(EDTA)：天津科密欧化学试剂有限公司；吐温80：成都金山化学试剂有限公司，分析纯；Triton X-100：阿拉丁，生化试剂级；巯基乙醇：阿拉丁，生物技术级

TMV的提纯

(a)选取已侵染过TMV三周以上的普通烟叶片，去叶脉后剪碎放至研钵中，并加入适量液氮进行研磨，保证组织被磨碎，以提高病毒提取率；

(b)加入两倍体积的预冷的pH 7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲液(PBS)(内含 0.1％的巯基乙醇)，匀浆数分钟，再加10％的氯仿：正丁醇(V:V＝1:1)，用双层尼龙纱布过滤；

(c)滤液倒入离心管(冰浴)中，8000rmp，4℃条件下离心20min；

(d)取上清液；然后往上清液中加入(V/W)6％的PEG-6000和NaCl，4℃搅拌4h，在8000rmp下离心20min。去上清后，用1/5粗提液的0.01mol/L PBS 将沉淀悬浮，转移至干净的锥形瓶中，搅拌2h。然后，转入离心管中，8000rmp， 4℃条件下离心20min；

(e)取上清液，称取上清液体积(V/W)6％的PEG-6000和NaCl，冰浴条件下搅拌4h，在8000rmp下离心20min。用pH＝7.0的0.01mol/L将沉淀悬浮，所得的上清液即为提纯的病毒原液；

(f)用缓冲液稀释后，测定260nm下的吸光度值，根据以下公式计算TMV 浓度(TMV的消光系数为3.1)

病毒母液浓度(mg/mL)＝A

CMV的提纯

(a)选取已侵染过CMV三周以上的普通烟叶片，去叶脉后剪碎放至研钵中，并加入适量液氮进行研磨，保证组织被磨碎，以提高病毒提取率；

(b)加入两倍体积的预冷的pH 7.5的0.5mol/L的磷酸缓冲液(PBS)(内含0.01mol/LEDTA，0.1％的巯基乙醇，2％Trition-x-100)，匀浆数分钟，再加 10％的氯仿：正丁醇(V:V＝1:1)，用双层尼龙纱布过滤；

(c)滤液倒入离心管(冰浴)中，8000rmp，4℃条件下离心20min；

(d)取上清液，所得的上清液即为粗提的病毒液，加入(V/W)6％PEG-6000 和NaCl，在4℃下，搅拌4h，然后8000rpm离心20min；

(e)保留沉淀，用pH＝7.0的0.01mol/L的PBS将沉淀悬浮，8000rmp，4℃条件下离心20min；

(f)移出上清，将沉淀悬浮，重复此过程两次，合并上清液即为提纯的病毒原液；

(g)用缓冲液稀释后，测定260nm下的吸光度值，根据以下公式计算CMV 浓度(CMV的消光系数为5.0)。

病毒母液浓度(mg/mL)＝A

化合物浓度的配制

准确称取2mg化合物于离心管中，并加入30μL有机溶剂DMSO，使其充分溶解，将含有1％Tween 80的二次水加至4mL，配成浓度为500μg/mL的药剂。

(1)测试方法

测试化合物C1-C6，D1-D7，E1-E21对TMV/CMV的抗病毒活性，具体操作步骤如下：

(a)离体作用

选长势一致的5～6叶期的芯叶烟，在每片叶子上均匀的撒上金刚砂，排笔蘸取以配好的病毒汁液，人工摩擦接种于全叶叶片上，病毒接种30min后，用清水冲洗。叶片干后，沿叶中脉对剪，左半叶浸于1％吐温水中，右半叶浸于药剂中，30min后取出，于适宜光照温度下保湿培养。2-3d后，叶片出现明显的枯斑，记录左右半叶的枯斑数目。每个化合物进行3次重复。

(b)药剂对TMV/CMV活体治疗作用

选长势一致的5～6叶期的芯叶烟或苋色藜，在每片叶子上均匀的撒上金刚砂，排笔蘸取以配好的病毒汁液，人工摩擦接种于全叶叶片上，病毒接种30min后，用清水冲洗。待叶片干后，毛笔蘸取药剂(500μg/mL)分别涂施在右半叶，左半叶涂施相同剂量的溶剂作为对照。晾干后移至小温室中保湿培养。2-3d后，叶片出现明显的枯斑，记录左右半叶的枯斑数目。每个化合物进行3次重复。

(c)药剂对TMV/CMV活体保护作用

选长势一致的5～6叶期的芯叶烟或苋色藜，毛笔蘸取药剂(500μg/mL)涂施在右半叶，左半叶涂施相同剂量的溶剂作为对照。晾干后移至小温室中，12-24 h后，在叶片上均匀撒上金刚砂，排笔蘸取提前配好的病毒汁液，摩擦接种于全叶叶片上，接种30min后用清水冲洗。待叶片干后，移至小温室中保湿培养。2 -3d后，叶片出现明显的枯斑，记录左右半叶的枯斑数目。每个化合物进行3 次重复。

(d)药剂对TMV/CMV活体钝化作用

选长势一致的5～6叶期的芯叶烟或苋色藜，将药剂与等体积的病毒液混合作用30分钟。用排笔蘸取混合液摩擦接种于芯叶烟或苋色藜右半叶，对应剂量的溶剂与病毒汁液的混合摩擦接种于左半叶，病毒接种30min后用清水冲洗。自然风干后，移至小温室中保湿培养。2-3d后，叶片出现明显的枯斑，记录左右半叶的枯斑数目。每个化合物进行3次重复，并计算其抑制率如下所示：

抑制率(％)＝[(空白对照枯斑数-药剂处理枯斑数)/空白对照枯斑数]×100

对部分目标化合物设置5个相应的浓度梯度，测定其对TMV和CMV的EC

按上述方法测定实施例C1-C6，D1-D7，E1-E21化合物的抗植物病毒活性及 EC

(2)抗植物病毒活性测试结果

表3实施例化合物C1-C6，D1-D7，E1-E21对TMV的抑制活性的测试数据

采用叶半枯斑法，以宁南霉素和病毒唑为阳性对照药剂，在供试浓度为500 μg/mL时，测试了实施例化合物C1-C6，D1-D7和E1-E21对TMV的抑制活性。如表3所示，大多数目标化合物表现出较好的离体治疗活性和活体治疗活性，其中，化合物D4、E2、E4、E6、E10和E16离体活性分别为60.8％、62.9％、 59.7％、58.1％、59.7％和59.8％，优于宁南霉素(52.3％)和病毒唑(38.2％)；化合物D4、E2、E4、E6、E8、E10和E16的活体治疗活性分别为59.8％、63.1％、 59.8％、56.7％、57.9％、60.3％和59.6％，高于对照药剂宁南霉素和病毒唑(52.3％和38.2％)，且与离体治疗活性表现出相同的趋势。在保护和钝化活性方面，化合物E2对TMV的保护活性和钝化活性分别为70.1％和89.9％，高于对照药剂宁南霉素(66.7％和88.6％)，其余化合物的活性均低于宁南霉素。化合物E2的抗 TMV治疗，保护和钝化活性的EC

表4实施例化合物C1-C6，D1-D7，E1-E21对CMV的抑制活性的测试数据

采用活体半叶枯斑法，在供试浓度为500μg/mL的条件下，以商品药剂宁南霉素和病毒唑作为阳性对照药剂，测定了含哌嗪的阿魏酸衍生物的抗CMV活性(见表4)。由表4可知，含哌嗪的阿魏酸衍生物具有一定的抗CMV活性，其中化合物D1、D2、E2、E3、E4、E6、E8、E12、E13、E16、E18和E20的治疗活性分别为47.7％、48.9％、56.9％、51.9％、52.8％、47.4％、55.5％、56.7％、 50.1％、50.3％、51.1％和49.7％，高于对照药剂宁南霉素和病毒唑(47.3％和39.2％)。在保护活性方面，化合物D6、E2、E12、E16和E18的保护活性分别为55.2％、 56.7％、55.7％、56.1％和55.7％，高于对照药剂宁南霉素(55.1％)，其余化合物均低于宁南霉素。在钝化活性方面，化合物E2对CMV的钝化活性为87.6％。其中，化合物E2对CMV的治疗和保护活性的EC

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。