热稳定性提高的玉米赤霉烯酮内酯水解酶的突变体S162P及其应用

摘要

本发明公开了热稳定性提高的玉米赤霉烯酮内酯水解酶的突变体S162P及其应用，属于酶工程技术领域。本发明将来源于微生物GliocladiumroseumMA918的玉米赤霉烯酮内酯水解酶酶作为亲本，利用基因突变技术，将162位的丝氨酸(S)突变为脯氨酸(P)，获得单点突变体S162P。与野生酶相比，在原始催化活力未发生明显变化的基础上，突变体酶的热稳定性显著提升：突变体酶在50℃保温2min后残余酶活提高为野生酶的1.52倍；在48℃分别保温10min和20min后，仍具有约80％和58％的残余酶活，在48℃的半衰期也提高为野生酶的3.6倍。为实现ZEN内酯水解酶的工业化应用打下了一定的基础。

说明书

技术领域

本发明涉及热稳定性提高的玉米赤霉烯酮内酯水解酶的突变体S162P及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是一种非甾体类雌激素的霉菌毒素，化学名称为6-(10-羟基-6氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯。1962年，ZEN首次在发霉的玉米中被发现，是一种镰刀菌属产生的有毒次级代谢产物，广泛存在于发霉的玉米、小麦、大麦以及其他的谷物和谷物副产物中，已经成为一种世界范围内的食品和饲料污染物。通常，不合适的储藏条件(10-30℃的温度和40-50％的环境相对湿度)是造成ZEN产生的主要原因。此外，ZEN还具有多种有毒的衍生物如：α/β-玉米赤霉烯醇(α/β-Zearalenol，α/β-ZOL)，α/β-玉米赤霉醇(α/β-Zearalanol，α/β-ZAL)，玉米烯酮(Zearalanone，ZAN)等。作为一种外源的雌激素类似物，ZEN及其衍生物可以竞争性的与雌激素受体结合，对人类和很多养殖动物造成生殖毒性，基因毒性，免疫毒性和致癌性，对人类和牲畜的健康造成极大的危害，也给粮食工业、食品工业、饲料工业和畜牧业造成巨大的经济损失。

近年来，ZEN在粮食，食品和饲料中的污染程度有增无减，生物毒素的有效脱毒也被科技部列为2019国家重点研发计划之一，因而探索有效且环保的ZEN脱除方法越来越受到人们的关注。目前ZEN脱除方法主要可分为物理脱除，化学分解和生物降解三种。其中物理脱除是利用加热，辐照或吸附等方法去除ZEN，但往往会破坏营养成分并且脱除效率较低；化学分解则是采用酸/碱水解，氨化或者臭氧化等方式对ZEN脱毒，脱除效率不高并且会造成二次污染，不利于环保和动植物健康。生物降解法是利用微生物菌体对ZEN的吸附作用或微生物产生的酶对ZEN的降解作用，具有专一性好，作用条件温和，脱毒效率高，不破坏营养物质和不产生二次污染等优势，是目前研究的热点方向。

目前，ZEN的降解酶主要包括漆酶(Laccase)，过氧化物酶(Peroxidase)和内酯水解酶(Lactonase)三种。其中，漆酶主要用于降解黄曲霉毒素，用于降解ZEN时需要氧化还原介质(丁酸甲酯)的存在；过氧化物酶降解ZEN的机制尚不明确；内酯水解酶是目前最受关注的ZEN降解酶。在酶学研究中内酯水解酶可以催化ZEN的内酯环打开，并自发脱羧，形成一个完全无毒的降解产物。

2002年Naoko首次在粉红粘帚菌Clonostachysrosea IFO 7063中发现了一种具有降解ZEN能力的内酯水解酶，并将其命名为ZHD101。随后多种不同来源的可降解ZEN的内酯水解酶，如：来自Gliocladiumroseum的ZEN-jjm，来的Gliocladiumroseum 31535的Zhly-6，来自Cladophialophorabatiana的Cbzhd，来自Rhinocladiellamackenziei CBS 650.93的Zhd518以及来自Neurospora crassa的ZENC相继被发现。其中，ZHD101已经在E.coli BL21，P.pastoris GS115以及S.cerevisiae等多种宿主里成功表达，是目前研究最深入的一种ZEN内酯水解酶。

目前，对ZEN内酯水解酶的研究集中在酶学性质鉴定以及底物特异性的改造。而作为一种饲用酶，不仅要有较高的活性和广泛的底物特异性，更需要具有高热稳定性以耐受造粒工艺的高温，来适应实际的工业生产。

发明内容

针对目前存在的问题，为了获得更适合工业应用的ZEN降解酶，本申请对来自于GliocladiumroseumMA918的内酯水解酶进行分子改造，以期提高其热稳定性获得更适合工业要求的ZEN降解酶。

本发明提供了一种玉米赤霉烯酮内酯水解酶突变体，所述突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的玉米赤霉烯酮内酯水解酶为亲本，对亲本第192位氨基酸突变。

在一种实施方式中，将亲本第192位氨基酸突变为脯氨酸，得到氨基酸序列如SEQID NO:3所示的突变体。

在一种实施方式中，所述玉米赤霉烯酮内酯水解酶来源于GliocladiumroseumMA918，编码所述玉米赤霉烯酮内酯水解酶的ZENG基因的GeneBank登录号为KR363960.1。

本发明提供了编码所述玉米赤霉烯酮内酯水解酶突变体的基因。

在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供了携带所述编码所述玉米赤霉烯酮内酯水解酶突变体的基因的重组质粒。

在一种实施方式中，所述重组质粒的包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K。

在一种实施方式中，优选为pET系列载体。

本发明提供了表达所述玉米赤霉烯酮内酯水解酶突变体，或携带所述重组质粒的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物包括但不限于大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，E.coli JM109(DE3)。

本发明提供了一种提高玉米赤霉烯酮内酯水解酶热稳定性的方法，所述方法是将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的玉米赤霉烯酮内酯水解酶第192位氨基酸突变为脯氨酸。

本发明提供了一种降解玉米赤霉烯酮的方法，所述方法是在含有玉米赤霉烯酮的体系中加入所述玉米赤霉烯酮内酯水解酶突变体，在28℃～58℃下反应。

在一种实施方式中，反应温度优选为38℃～58℃。

在一种实施方式中，反应体系中含有磷酸缓冲液。

本发明提供了所述玉米赤霉烯酮内酯水解酶突变体的制备方法，其具体步骤为：

(1)在GliocladiumroseumMA918的ZENG酶晶体结构的基础上确定突变位点；

(2)设计定点突变的突变引物，以携带ZENG酶基因的载体pET-22b(+)-Glro为模板进行定点突变构建突变质粒pET-22b(+)-S162P；

突变引物如下所示，下划线为突变点：

正向突变引物：5’-GTCTGGAGGC

反向突变引物：5’-CCACGCCTC

(3)将突变质粒pET-22b(+)-S162P转化进E.coli BL21(DE3)细胞，挑选验证后的阳性单克隆进行发酵培养；

(4)离心菌体，重悬后超声破碎，镍离子亲和层析纯化得到突变体酶S162P。

本发明提供了所述玉米赤霉烯酮内酯水解酶突变体在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

本发明提供了所述编码所述玉米赤霉烯酮内酯水解酶突变体的基因在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

本发明提供了所述重组质粒在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

本发明提供了所述微生物细胞在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的玉米赤霉烯酮内酯水解酶突变体酶S162P，与野生酶相比，所述的突变体酶S162P的最适催化条件没有发生改变，在原始催化活力未发生明显变化的基础上，突变体酶的热稳定性显著提升：突变体酶在50℃保温2min后残余酶活提高为野生酶的1.52倍。在48℃分别保温10min和20min后，仍具有约80％和58％的残余酶活，且突变体S162P酶在48℃的半衰期也提高为野生酶的3.6倍。Nano DSC结果显示突变体S162P酶的T

附图说明

图1为突变体S162P的最适温度。

图2为WT及S162P的热稳定性和半衰期；(A)为热稳定性研究，(B)为半衰期研究。

图3为WT及突变体S162P酶的Nano DSC拟合曲线。

图4为突变体酶S162P的动力学拟合曲线。

图5为WT及第162位突变体酶的热稳定性。

具体实施方式

下述实施例中，蛋白质浓度采用天根BCA蛋白质定量试剂盒(PA115)测定。

实施例1：突变体酶S162P的制备

pET-22b(+)-S162P质粒的构建：

含有野生型Glro的重组质粒pET22b-Glro的构建：根据编码GliocladiumroseumMA918的ZEN内酯水解酶的基因(GenBank：KR363960.1)，合成ZEN内酯水解酶的基因片段Glro，并连接至载体pET-22b(+)的酶切位点Nde I和Xho I之间，获得重组质粒pET22b(+)-Glro。

以pET-22b(+)-Glro质粒为模板，经PCR l及PCR 2，引入S162P定点突变，测序验证结果表明除了所需突变位点外，没有出现随机突变，表明突变体质粒pET-22b(+)-S162P构建成功。

突变引物如下所示：(下划线为突变体)

正向突变引物：5’-GTCTGGAGGC

反向突变引物：5’-CCACGCCTC

①PCR 1：反应体系的组成：

PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃解链30s，56℃退火30s，72℃延伸2.5min，32个循环，72℃延伸5min。将反应液纯化回收，用于PCR 2反应。

②PCR 2：反应体系的组成：

PCR反应条件：37℃保温消化1.5h-2h。

③将PCR 2中所得产物，转化至E.coli DH5α感受态细胞中，在含有50μg/mL氨节青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于50μg/mL氨节青霉素的LB液体培养基培养，后提取突变质粒pET-22b(+)-S162P，并将其转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，突变质粒经测序鉴定为正确的突变。

实施例2：突变体酶的表达纯化方法

将测序验证后的突变质粒pET-22b(+)-S162P转化至大E.coli BL21(DE3)细胞，挑取阳性转化子在LB培养基中37℃、200rpm摇培过夜，后接入LB培养基37℃培养3h-4h至OD值为0.6-0.8，降温至28℃，加入IPTG使得其终浓度为0.6mM，诱导6h。

发酵液于4℃、l0000 rpm离心20min，取菌体。加入20mL缓冲液(50mM Tris，200mMNaCl，HCl调节pH至8.5)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间l s，停止时间2s，共计18min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、10000rpm离心30min，得粗酶液。用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

准备镍离子亲和层析柱，首先，在室温下利用恒流泵，向柱子里泵入去离子水冲洗柱子(约6-12倍柱体积)，然后用缓冲液A(500mmol/L NaCl，50mM Tris-HCl，pH 8.0)平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的缓冲液A的pH值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用缓冲液B(500mmol/L NaCl，50mmol/L咪唑，50mM Tris-HCl，pH 8.0)冲洗杂蛋白至基线平衡，再用含有高浓度咪唑的洗脱液(500mmol/LNaCl，500mmol/L咪唑，50mM Tris-HCl，pH 8.0)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，并测定其酶活，获得目的蛋白。纯化后ZENG的突变体酶S162P达到电泳纯。

实施例3：突变体酶S162P的热稳定性测定

比较突变前后酶的热稳定性变化，其中野生酶是指GliocladiumroseumMA918来源的ZEN内酯水解酶(GenBank：ALI16790.1)，突变体酶是指实施例1和2制备得到的突变体酶S162P。

(1)ZEN内酯水解酶酶活测定：

标准反应体系：5μL ZEN的甲醇溶液(4mg/mL ZEN)，5μL酶(0.5mg/mL)和240μL磷酸缓冲液(50mM，pH 7.0)，在38℃条件下反应10min，加入50μL，1N盐酸和300μL甲醇终止反应。1U总酶活定义为在pH 7.0，38℃条件下反应，每分钟消耗1μg底物所需要的酶量。

使用HPLC检测ZEN的合成量，计算出突变体S162P的比酶活为320U/mg，WT的比酶活为315U/mg。

(2)最适温度的测定：

为了确定重组酶反应的最适温度，将酶(5μL，0.5mg/mL)与底物在不同的反应温度下进行反应，温度范围包括28-58℃(每5℃取一个温度点)。其中反应体系为标准反应体系(与(1)相同)，且将最适温度下的相对酶活力设为100％。

(3)重组酶的温度稳定性：

将纯酶液(5μL，0.5mg/mL)置于48、53和58℃下分别孵育2、5、7和10min后，立即取出冰浴，依次加入缓冲液和底物进行酶反应，反应体系及反应条件同(1)，且将未进行保温的酶初始酶活力设为100％。

结果如图1～3所示，与野生酶ZENG相比，所述的变体酶S162P的最适催化温度(38℃)没有发生改变(图1)；但突变体酶在48℃保温2min后残余酶活提高为野生酶的1.52倍(野生酶残余酶活为59％)，且其原始催化活力较WT酶未出现明显变化。在48℃分别保温10min和20min后，仍具有约80％和58％的残余酶活(图2A)，且突变体S162P酶在48℃的半衰期(6.72min)也提高为野生酶(24.24min)的3.6倍(图2B)。Nano DSC结果显示突变体S162P酶的T

(4)重组酶动力学参数的测定：

在酶反应体系中分别添加终浓度在8μg/mL-200μg/mL之间的ZEN作为底物(具体取点为：8、16、20、40、80、120、160μg/mL)，依据(3)测定重组酶的酶活。依据在线工具MyCurveFit Online Curve Fitting中的Nonlinear Michaelis-Menten方法模拟计算得到重组酶的动力学参数，其中K

表1野生型与突变体S162P的动力学参数比较

对比例1

将第162位的丝氨酸突变为其他的19种氨基酸(其中有3个突变体酶未成功纯化，分别为：S162Q，S162G和S162M)，结果显示，相对于野生酶，除S162P的热稳定性显示了较大的提升之外，其他各突变体酶的原始酶活及48℃保温10min后酶活有的未显示显著变化，有些甚至显示了较大幅度的下降(图5)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 热稳定性提高的玉米赤霉烯酮内酯水解酶的突变体S162P及其应用

<130> BAA210736A

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Arg Thr Arg Ser Thr Ile Ser Thr Pro Asn Gly Ile Thr Trp Tyr

1 5 10 15

Tyr Glu Gln Glu Gly Thr Gly Pro Asp Val Val Leu Val Pro Asp Gly

20 25 30

Leu Gly Glu Cys Gln Met Phe Asp Ser Ser Val Ser Gln Ile Ala Ala

35 40 45

Gln Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met Ser Arg Ser

50 55 60

Ala Lys Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Thr Glu Val Thr Ala Gln Lys Leu

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Val Ile Ser Ile Leu Asp Ala Leu Asp Ile Lys His Ala

85 90 95

Thr Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Ser Thr Val Val Ala Leu Leu

100 105 110

Leu Gly Tyr Pro Asp Arg Ile Arg Asn Ala Met Cys His Glu Leu Pro

115 120 125

Thr Lys Leu Leu Asp His Leu Ser Asn Thr Ala Val Leu Glu Asp Glu

130 135 140

Glu Ile Ser Lys Ile Leu Ala Asn Val Met Leu Asn Asp Val Ser Gly

145 150 155 160

Gly Ser Glu Ala Trp Gln Ala Met Gly Asp Glu Val His Ala Arg Leu

165 170 175

His Lys Asn Tyr Pro Val Trp Ala Arg Gly Tyr Pro Arg Thr Ile Pro

180 185 190

Pro Ser Ala Pro Val Lys Asp Leu Glu Ala Leu Arg Gly Lys Pro Leu

195 200 205

Asp Trp Thr Val Gly Ala Ala Thr Pro Thr Glu Ser Phe Phe Asp Asn

210 215 220

Ile Val Thr Ala Thr Lys Ala Gly Val Asn Ile Gly Leu Leu Pro Gly

225 230 235 240

Met His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Asp Val Phe Ala Lys Tyr Val

245 250 255

Val Glu Thr Thr Gln Lys His Leu

260

<210> 2

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgcgcactc gcagcacaat ctcgaccccg aatggcatca cctggtacta tgagcaggag 60

ggtactggac ccgacgttgt cctcgtcccc gatggcctcg gagaatgcca gatgtttgac 120

agctccgtgt cgcaaattgc tgcccaaggc tttcgggtca ccacgtttga catgcccgga 180

atgtcccggt ctgcgaaggc accacccgag acctacactg aggtcacggc ccagaagctg 240

gcttcctatg tcatctccat cctggatgct cttgacatca agcacgctac tgtctggggc 300

tgcagctcag gagcttccac cgtcgtggcg ctgttgctcg gttaccccga caggatacgc 360

aacgccatgt gccacgaact gccaacaaag ctactggacc acctttcaaa caccgctgtg 420

ctcgaagacg aggaaatctc aaagatcctg gccaatgtaa tgttgaacga cgtgtctgga 480

ggcccggagg cgtggcaagc catgggggac gaggtgcacg cgagactgca caagaactac 540

ccggtttggg ctcgaggata ccctcgcact attcctccct cagctccggt taaggatctg 600

gaggctctgc gtgggaagcc cctggactgg actgtcggcg ctgcgacacc aaccgagtct 660

ttctttgaca acattgttac cgctaccaag gctggtgtca acattgggtt gcttccaggg 720

atgcatttcc cttatgtttc ccacccggac gttttcgcta aatatgttgt ggaaactacg 780

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<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

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1 5 10 15

Tyr Glu Gln Glu Gly Thr Gly Pro Asp Val Val Leu Val Pro Asp Gly

20 25 30

Leu Gly Glu Cys Gln Met Phe Asp Ser Ser Val Ser Gln Ile Ala Ala

35 40 45

Gln Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met Ser Arg Ser

50 55 60

Ala Lys Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Thr Glu Val Thr Ala Gln Lys Leu

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Val Ile Ser Ile Leu Asp Ala Leu Asp Ile Lys His Ala

85 90 95

Thr Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Ser Thr Val Val Ala Leu Leu

100 105 110

Leu Gly Tyr Pro Asp Arg Ile Arg Asn Ala Met Cys His Glu Leu Pro

115 120 125

Thr Lys Leu Leu Asp His Leu Ser Asn Thr Ala Val Leu Glu Asp Glu

130 135 140

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