一种抑制蓝莓果实内源基因表达的方法、系统与应用

摘要

本发明提供了一种抑制蓝莓果实内源基因表达的方法，包括：将经打孔的蓝莓果实浸入含有T‑DNA给体载体和TI辅助质粒的根癌农杆菌宿主菌和含有2‑(N‑吗啉)乙磺酸，氯化镁，乙酰丁香酮农杆菌侵染液组成的农杆菌侵染悬液，得混合物；将前述混合物放入压强为0.01‑0.085MPa发真空环境处理3‑15min。其中，T‑DNA给体载体中的RNAi表达盒含有具有表达元件的RNAi载体靶序列，具有表达元件的用于插入RNAi载体靶序列的位点，或者有具有表达元件的用于置换RNAi载体靶序列的DNA片段。前述方法能够有效地抑制蓝莓果实内源基因表达。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种抑制蓝莓果实内源基因表达的方法、系统与应用，特别涉及一种抑制内源蓝莓ACO1基因表达的方法、系统与应用。

背景技术

蓝莓(拉丁文：Vaccinium Spp，英文：Blueberry)，又名越桔，蓝浆果，属杜鹃花科(Ericaceae)越桔亚科(Vaccinioideae)越桔属(Vacciniodeae)植物。蓝莓营养丰富，不仅富含常规营养成分，而且还含有极为丰富的黄酮类与多糖类化合物。蓝莓果实含有防止脑神经衰老、增强心脏功能、明目及抗癌等功效物质。而通过抑制蓝莓成熟相关基因的表达，实现蓝莓的晚熟，从而避开蓝莓大批量成熟，对于蓝莓的贮存及采摘都有一系列产业价值。

果实成熟、衰老及品质形成是一个复杂的过程，是由遗传和环境等多种因素共同作用的结果，其中激素调节是调控果实成熟与品质的重要因素之一。乙烯作为植物五大激素之一，是具有复杂生物学功能的一种结构简单的有机分子，它影响着高等植物的生长和发育，包括促进果实成熟、花衰老、花瓣和叶片的脱落、抑制绝大多数双子叶植物茎的延长、刺激根的发生等等。同时乙烯在植物应答生物和非生物胁迫的响应中也起到重要的作用，包括病原体入侵、浸水、冷害和机械伤害等等。高等植物中乙烯的生物合成途径已经由Yarg和Hoffman得到证实，第一步由1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)催化s-腺苷甲硫氨酸(SAM)转变为ACC，接着ACC经ACC氧化酶(ACO)氧化形成乙烯，乙烯参与植物生长和发育，因此，ACO基因是乙烯合成的关键基因。

瞬时转染是将DNA导入真核细胞的方式之一。在瞬时转染中，重组DNA导入感染性强的细胞系以获得目的基因暂时且高水平的表达。目前果实中常用的瞬时表达方法为注射法，但该方法多适用于番茄、草莓等果肉较为柔软的果实中。

由于蓝莓果实细胞结合太过紧密，果实的结构、特性与以往研究的果实不同，用于普通果实的瞬时表达方法不适用于蓝莓果实，因此针头注射的方法不可行。

由于农杆菌只有在特定诱导因子存在时才能侵染植物组织伤口处的细胞，而这些研究中均直接使用注射方式进行侵染，侵染效率严重受限。后续的研究工作对在蓝莓果实中的瞬时转染效率有较高的要求，因此一种高效的蓝莓果实瞬时转染方法需求非常迫切。

发明内容

本发明具体涉及一种基于真空渗入的蓝莓果实瞬时表达以便抑制蓝莓果实内源基因的方法。该方法包括用含有RNAi表达原件的T-DNA给体载体的农杆菌侵染液悬浮活化后的农杆菌；将蓝莓果实用牙签头扎孔；将蓝莓果实置于农杆菌侵染液中，抽真空处理促进农杆菌对植物组织的渗入；将农杆菌侵染后的蓝莓果实暗培养的步骤。本发明结合果实预处理和真空处理实现农杆菌渗入蓝莓果实中从而实现农杆菌高效浸染蓝莓果实细胞，并且可以实现高效率的外源基因瞬时表达来抑制内源基因。

为了解决现有技术中农杆菌侵染蓝莓果实以便抑制蓝莓果实内源基因效率较低等问题，本发明第一方面提供了一种抑制蓝莓果实内源基因表达的方法，所述方法包括如下步骤：

S1：将蓝莓果实表面打孔，得到经打孔的蓝莓果实；

S2：将所述经打孔的蓝莓果实浸入农杆菌侵染悬液，得到蓝莓果实侵染悬液混合物；

所述农杆菌侵染悬液包括重组农杆菌和农杆菌侵染液；

所述重组农杆菌为含有T-DNA给体载体和TI辅助质粒的根癌农杆菌宿主菌；

所述T-DNA给体载体含有RNAi表达盒，所述RNAi表达盒中含有具有表达元件的RNAi载体靶序列，具有表达元件的用于插入RNAi载体靶序列的位点，或者有具有表达元件的用于置换RNAi载体靶序列的DNA片段；

所述农杆菌侵染液中含有2-(N-吗啉)乙磺酸，氯化镁，乙酰丁香酮；

S3：将所述蓝莓果实侵染悬液混合物放入真空环境，得到经真空处理的蓝莓果实，所述真空环境的压强为0.01-0.085MPa，处理时间为3-15min。

在一些实施方式中，所述RNAi表达盒为瞬时基因表达。

在一些实施方式中，在步骤S1中，所述蓝莓果实选自大绿期的蓝莓果实。

在一些实施方式中，在步骤S1中，打孔的深度为4-5mm。

在一些实施方式中，在步骤S1中，打孔的内径为1-2mm。

在一些实施方式中，在步骤S1中，一枚蓝莓果实打孔的个数为3-10。

在一些实施方式中，在步骤S1中，一枚蓝莓果实打孔的不同孔之间间距为5-15mm。

在一些实施方式中，在步骤S1中，使用无菌针状物或无菌杆状物进行所述打孔。

在一些实施方式中，在步骤S2中，将所述T-DNA给体载体和所述Ti辅助质粒同时或相继转化所述根癌农杆菌宿主菌，形成所述重组农杆菌。

在一些实施方式中，在步骤S2中，将所述T-DNA给体载体转化含有所述Ti辅助质粒的所述根癌农杆菌宿主菌，形成所述重组农杆菌。

在一些实施方式中，在步骤S2中，采用Gateway克隆方法，将所述RNAi载体靶序列重组到所述T-DNA给体载体。

在一些实施方式中，在步骤S2中，所述含有所述Ti辅助质粒的所述根癌农杆菌宿主菌为根癌农杆菌GV3101或根癌农杆菌EHA105。

在一些实施方式中，在步骤S2中，所述T-DNA给体载体中，所述RNAi载体靶序列的启动子为NOS启动子、MAS启动子或CaMV 35S启动子。

在一些实施方式中，在步骤S2中，所述T-DNA给体载体中，所述RNAi载体靶序列的终止子为NOS终止子。

在一些实施方式中，在步骤S2中，所述T-DNA给体载体为双元表达载体。

在一些实施方式中，在步骤S2中，所述T-DNA给体载体为双元表达载体pCAMBIA-1300或双元表达载体Gateway

在一些实施方式中，在步骤S2中，所述农杆菌侵染液的组成成分为：8-12mMMgCl

在一些实施方式中，在步骤S2中，所述农杆菌侵染液用孔径为0.02μm的滤头过滤除菌后使用。

在一些实施方式中，在步骤S2中，所述重组农杆菌的增殖培养基为含有抗生素的LB液体培养基。

在一些实施方式中，在步骤S2中，所述重组农杆菌的增殖培养基为含有30-80mg/l利福平和50-150mg/l卡那霉素的LB液体培养基。

在一些实施方式中，在步骤S2中，所述重组农杆菌的增殖培养到使用浓度为OD

在一些实施方式中，在步骤S2中，农杆菌侵染悬液的制备步骤为：

将所述重组农杆菌的培养物离心，去除上清，得到第一沉淀；

用所述农杆菌侵染液清洗第一沉淀，离心，去除上清，得到第二沉淀；

将所述第二沉淀用所述农杆菌侵染液重悬，得到所述农杆菌侵染悬液。

在一些实施方式中，在步骤S2中，每次离心的条件为：4000-8000rpm下离心3-10min。

在一些实施方式中，在步骤S2中，所述农杆菌侵染液经活化后使用，活化的步骤为：用LB液体培养基培养所述重组农杆菌至菌液OD

在一些实施方式中，在步骤S2中，所述RNAi载体靶序列针对蓝莓ACO1基因。

在一些实施方式中，所述蓝莓ACO1基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.6所示。

在一些实施方式中，所述蓝莓ACO1基因的编码序列如SEQ ID NO.5所示。

在一些实施方式中，针对所述蓝莓ACO1基因的如SEQ ID NO.7所示靶序列进行RNAi操作。

在一些实施方式中，在步骤S3中，所述真空环境的压强为0.016-0.08MPa。

在一些实施方式中，在步骤S3中，处理时间为5-10min。

在一些实施方式中，在步骤S3中，将经真空处理的蓝莓果实清洗干净。

在一些实施方式中，在步骤S3中，所述清洗的溶液的组分为：8-12mM MgCl

所述方法还包括如下步骤：

S4：将经真空处理的蓝莓果实放在黑暗环境中培养。

在一些实施方式中，在步骤S4中，培养温度为20-28℃。

在一些实施方式中，在步骤S4中，培养时间为1-10天。

在一些实施方式中，在步骤S4中，培养的湿度为65-80％。

在一些实施方式中，在步骤S4中，所述湿度是在如下组分的溶液环境中保持的：8-12mM MgCl

本发明第二方面提供了一种用于抑制蓝莓果实内源基因表达的系统，所述系统包括：

打孔装置，用于给蓝莓果实打孔；

可密封容器，用于容纳蓝莓果实；

抽真空装置，用于给所述可密封容器抽真空；

农杆菌侵染悬液，其中，所述农杆菌侵染悬液包括重组农杆菌和农杆菌侵染液；所述重组农杆菌为含有T-DNA给体载体和Ti辅助质粒的根癌农杆菌宿主菌；所述T-DNA给体载体含有RNAi表达盒，所述RNAi表达盒中含有具有表达元件的RNAi载体靶序列，具有表达元件的用于插入RNAi载体靶序列的位点，或者有具有表达元件的用于置换RNAi载体靶序列的DNA片段；所述农杆菌侵染液中含有2-(N-吗啉)乙磺酸。

在一些实施方式中，所述基因表达为瞬时基因表达。

在一些实施方式中，所述打孔装置为无菌针状物或无菌杆状物。

在一些实施方式中，所述无菌针状物粗处的直径为1-2mm。

在一些实施方式中，所述无菌杆状物的直径为1-2mm。

在一些实施方式中，将所述T-DNA给体载体转化含有所述Ti辅助质粒的所述根癌农杆菌宿主菌，形成所述重组农杆菌。

在一些实施方式中，采用Gateway克隆方法，将所述RNAi载体靶序列重组到所述T-DNA给体载体，得到含有所述RNAi载体靶序列的所述T-DNA给体载体。

在一些实施方式中，将所述T-DNA给体载体和所述Ti辅助质粒同时或相继转化所述根癌农杆菌宿主菌，形成所述重组农杆菌。

在一些实施方式中，含有所述Ti辅助质粒的所述根癌农杆菌宿主菌为根癌农杆菌GV3101或根癌农杆菌EHA105。

在一些实施方式中，所述T-DNA给体载体中，所述RNAi载体靶序列的启动子为NOS启动子、MAS启动子或CaMV 35S启动子。

在一些实施方式中，所述T-DNA给体载体中，所述RNAi载体靶序列的终止子为NOS终止子。

在一些实施方式中，所述T-DNA给体载体为双元表达载体。

在一些实施方式中，所述T-DNA给体载体为双元表达载体pCAMBIA-1303或双元表达载体Gateway

在一些实施方式中，所述农杆菌侵染液的组成成分为：8-12mM MgCl

在一些实施方式中，所述农杆菌侵染液用孔径为0.02μm的滤头过滤除菌后形成的。

在一些实施方式中，所述RNAi载体靶序列针对蓝莓ACO1基因。

在一些实施方式中，所述蓝莓ACO1基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.6所示。

在一些实施方式中，所述蓝莓ACO1基因的编码序列如SEQ ID NO.5所示。

在一些实施方式中，所述RNAi载体靶序列针对如SEQ ID NO.7所示靶序列。

在一些实施方式中，所述系统还包括：离心机。

本发明第三方面提供了本发明第一方面所述的方法或第二方面所述的系统在抑制蓝莓果实内源基因表达中的用途。

在一些实施方式中，所述RNAi表达盒为瞬时表达。

在一些实施方式中，所述蓝莓的品种选自JE、公爵、珠宝、莱格西、薄雾、早蓝、蓝金、蓝塔、陶柔。

本发明的有益效果是：提供了一种可以提高农杆菌侵染蓝莓果实的方法，结合果实时期选择和真空处理实现农杆菌渗入果实组织中从而实现农杆菌高效浸染蓝莓细胞；并且可以实现高效率的蓝莓果实中外源基因瞬时表达。

1)基因表达具有组织特异性，蓝莓果实中的遗传操作可以更好地研究果实中的基因表达情况，避免研究的成果在其他组织中有效，而在果实中无效。

直接用果实进行遗传学研究，更有利于促进改良果实的科学研究。

2)转基因植株的制造成本高，组织培养和繁殖植株时间长，而本发明可以快速研究。

3)一些遗传操作对植株是致死的，相应的操作无法发育得到完整转基因植株，因此，限定了相关基因转基因模型蓝莓的研究工作，而从果实中进行操作就能够避免前述缺陷，有利于更全面地研究蓝莓遗传学，为改进蓝莓果实品质提供新的模型。

将基因ACO1构建到植物表达载体上并导入蓝莓中表达，对获得的ACO1干涉转基因蓝莓进行果实成熟相关生理生化和分子生物学检测，确认ACO1可以改变蓝莓果实的成熟进程，为后期利用该基因改良蓝莓以及其他非呼吸跃变型果实成熟进程的能力奠定基础。

本发明分别分离克隆一个蓝莓果实成熟基因的完整cDNA片段和C-端特异性末端序列片段，利用农杆菌介导法使目的基因转入受体植物中并干涉表达，进而通过实验验证该基因在蓝莓果实成熟过程中所起的作用，为后期利用该基因改良蓝莓以及其他非呼吸跃变型果实成熟进程的能力奠定基础。

将ACO1基因在蓝莓中干涉表达，能够显著延缓果实成熟的进程，从而可以人为控制果实上市时间，并且不改变果实的口感特征，相比用人工激素处理果实更加绿色环保，效果也更加稳定，因而具有明显的优势和不可取代的重要性。它可以为非呼吸跃变型果实大规模生产提供方便，可以合理调控果实上市时间，大量减少因果实过熟腐烂造成的损失，可为农业生产节约成本且提高管理水平，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1为pCAMBIA-1300双元表达载体图谱示意图。

图2为EGFP的RNA表达量的相对值比较图。

图3为Gateway

图4为Gateway

图5重组Gateway

图6为蓝莓ACO1基因表达量对照示意图。

图7为可溶性糖含量对照对照示意图。

图8为花青素含量含量对照对照示意图。

图9为果实硬度对照对照示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。提及试剂盒的，按照试剂盒的说明书的步骤进行操作。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明可从商业途径得到。

定义：

RNAi基因靶序列：

通过RNAi手段被沉默或干扰的目标序列，RNAi通过一系列生化反应沉默或降解RNAi基因靶序列，比如，希望下调表达或沉默的蓝莓ACO1基因的转录本或其片段。

RNAi载体靶序列：

在载体中，能够表达出与前述RNAi基因靶序列同源性序列的序列，该RNAi载体靶序列在转录本中，充当用于降解或沉默RNAi基因靶序列的单链或双链RNA，比如，表达后能够降解或沉默蓝莓ACO1基因的载体上的同源序列片段。

RNAi表达盒：

具有启动子、终止子和前述RNAi载体靶序列的基因表达单位，比如，T-DNA给体载体上，能够通过农杆菌介导转入植物组织，且能够在前述植物组织中转录，以便表达能够借助T-DNA给体载体和/或宿主细胞的遗传机制而降解或沉默宿主的内源基因的基因表达单位。

实施例1：利用基于真空渗入的瞬时表达的方法将EGFP基因在蓝莓果实中表达

1.农杆菌培养

双元表达载体pCAMBIA-1300：序列信息：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/KX400856.1，可参考文献FaPAO5regulates Spm/Spd levels as a signalingduring strawberry fruit ripening[J].Plant Direct,2020,4(5)，北京农学院沈元月教授课题组馈赠，其图谱如图1所示。

根癌农杆菌GV3101购买自博迈德公司。

通过冻融转化方法，将双元表达载体pCAMBIA-1300转入得到的感受态根癌农杆菌GV3101，得到转化的农杆菌。

将含pCAMBIA-1300双元表达载体的根癌农杆菌GV3101菌种常规活化后，活化的步骤为：挑取单菌落于5-10ml LB液体培养基中，置于恒温摇床(200rpm/30℃)过夜，倒去菌液，添加新鲜5-10ml LB液体培养基，继续摇至菌液OD

在10ml LB液体培养基(含50mg/l Rif(利福平)+100mg/l Kan(卡那霉素))中30℃培养约12h，至OD

2.蓝莓果实的选择

根据蓝莓果实发育规律，将蓝莓果实发育阶段分为6个时期：①小绿期：坐果后约6天；②中绿期：坐果后约14天；③大绿期：果实整体呈浅绿色；④始紫期：果实表面开始部分转紫；⑤片紫期：果实表面大面积转紫；⑥全紫期：果实表面全部转紫。

选择发育时期一致、无虫眼、无畸形，大小均一的“珠宝”品种大绿期蓝莓果实。

3.果实预处理

将蓝莓果实从各个方向用灭菌后的牙签打6个深度一致的孔(深度：4-5mm)，孔与孔之间的间隔距离保持一致(间距：4mm)。预处理完成的果实需要立即进行后续实验。

4.农杆菌侵染

农杆菌侵染液配制：10mM MgCL

农杆菌侵染对照液配制：10mM MgCl

将10ml农杆菌菌液在6000rpm下离心5min，去除上清，用10ml配制的农杆菌侵染液洗1次，在6000rpm下离心5min，去除上清，再用10ml上述农杆菌侵染液重悬，得到悬液1。

同时再取另外1份10ml农杆菌菌液离心5min，去除上清，用10ml农杆菌侵染对照液重悬，得到悬液2。

实验组：将有孔的果实用镊子小心地转移至前述悬液1中，轻轻浸没于其中。将样品放置在真空干燥器(天津市津腾实验设备有限公司，型号为GM-0.33A)中抽真空，使压力维持在0.08MPa并保持5min。

同时做对照组1，与实验组的差别在于，抽真空处理，压力为0.016MPa，保持5min；对照组2，除不经过真空处理外其他实验条件与实验组完全一致；对照组3，与实验组的差别在于，0.08MPa保持10min；对照组4，与实验组的差别在于，将果实用悬液2侵染，真空压力0.08MPa保持5min。另用无针头的注射器吸取悬液1从蓝莓果实表面注入果实中，作为对照组5。

5.侵染后样品暗培养

将实验组与对照组1-4的各个果实取出，用30ml无农杆菌的前述农杆菌侵染液清洗2遍。同时，在玻璃平皿中铺一层滤纸，并加入5ml无菌前述农杆菌侵染液润湿。将清洗后的果实轻轻置于滤纸上，放置在黑暗环境中，24℃下培养。对于注射菌液的蓝莓果实，直接在黑暗中室温培养并注意保湿(湿度为90％)。

6.果实RNA提取

分别取暗培养九天后再放九天的各种果实0.5g左右，在液氮中磨碎，按照试剂盒说明书操作，利用植物总RNA提取试剂盒(购自天根公司)提取果实总RNA。

7.qPCR实验分析在蓝莓中的过表达的基因表达情况

以F1(SEQ ID NO.1)和R1(SEQ ID NO.2)为引物，对前述各个处理的蓝莓果实总RNA中潜在的EGFP的RNA进行定量PCR分析。

F1：5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG

R1：5’-TTACTTGTACAGCTCGTCCATGC

以对照组5中EGFP的RNA表达量为1，计算其他组EGFP的RNA表达量的相对值，平行测试三次，取平均值，qPCR(荧光染料法)实验分析结果见图2，A、B、C、D、E、F分别依次表示实验组、对照组1、对照组2、对照组3、对照组4、对照组5所处理的蓝莓果实中EGFP的RNA表达量，*代表差异显著。

由此可见，未用真空处理的对照组2和使用农杆菌侵染对照液处理的对照组4中EGFP的RNA表达量很低。

使用注射器注射的对照组5中EGFP的RNA表达量中等。

实验组，对照组1和对照组3中EGFP的RNA表达量较高。

由此可见，实验组，对照组1和对照组3中的方法，能够有效地在蓝莓果实中表达外源基因。

实施例2：ACO1基因的克隆

根据GenBank号：NM_127517的拟南芥ACO1基因，在www.vaccinium.org网站Blast到蓝莓对应的同源基因，利用Snapgene软件，设计用于扩增蓝莓ACO1基因的引物F2(SEQ IDNO.3)和R2(SEQ ID NO.4)，序列如下。

F2：5’-ATGGAGGTCCCTGTTATAGACTTTGA

R2：5’-TCAAACCGGAAGACTCTGGTGC

针对蓝莓(珠宝)果实，使用植物总RNA提取试剂盒，提取总RNA。

反转录：用天根的反转录试剂盒。

以cDNA为模板，使用F2与R2对蓝莓ACO1基因进行PCR扩增。

扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱，可见长度约900bp的条带。

对扩增产物进行测序，得到的蓝莓ACO1基因编码序列(SEQ ID NO.5)为：

5’-ATGGAGGTCCCTGTTATAGACTTTGATAAGCTTGATGGTGAGAAGAGAGGTGAAACCATGGCACTTCTCCACCAAGCTTGTGAAAAGGGGGGCTTCTTTCAGATTGAGAACCATGGAATTGACACAGAGTTGATGGACAAAGTCAAGTACTTGGTGAATCAGCATTATGAGGAGAATATGAAAAAAAGCTTCTACGAATCGGACATAGCCAAGGGATTGGAGGAGAAAAGGATTACCTCTGATACAGACTGGGAAAGCACCTTCTTCGTTTGGCATCGTCCGAATTCCAACATCAATGAGCTCACAAACCTCTCAGATGACCTCCGCATGACGATGGATGCGTATATCAATCAACTGATCAAGCTAGCAGAGAAACTGTCGGAGCTCATGTGCGAAAATCTTGGTTTAGAGAAAGATTACATAAAGGAAGCATTTTCAGGAAGCAAAGGTCCATCTGTAGGAACCAAAGTGGCTAAATACCCACAATGTCCTCACCCTGAACTTGTTAGAGGGCTTCGTGAGCATACGGATGCTGGTGGGATCATTCTCTTACTCCAAGACGATGAAGTCCCAGGTCTTCAATTCCATAAAGATGGAAAATGGGTAGAAATTCCACCTTCTAAGAATAACAGCATCTTTATCAACACAGGTGATCAAGTGGAAGTGGTAACTAATGGAAGGTACAAGAGTACTTTGCACCGTGTAATCGCAGATAAGAACGGAAGCAGAATCTCTATCGCCACCTTCTACAATCCCGCTGGAGATGCTGTCATTTCTCCAGCTCCCAAACTCTTATACCCCAACCACTTCCGTTTTCAAGATTATCTGAACCTTTATGGTTCAACTAAGTTTGAAGACAAGGGTCCCCGATTCGAATCCATGAAGAAAATGCCGAACGGGCACCAGAGTCTTCCGGTTTGA

对应的蓝莓ACO1基因蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)为：

MEVPVIDFDKLDGEKRGETMALLHQACEKGGFFQIENHGIDTELMDKVKYLVNQHYEENMKKSFYESDIAKGLEEKRITSDTDWESTFFVWHRPNSNINELTNLSDDLRMTMDAYINQLIKLAEKLSELMCENLGLEKDYIKEAFSGSKGPSVGTKVAKYPQCPHPELVRGLREHTDAGGIILLLQDDEVPGLQFHKDGKWVEIPPSKNNSIFINTGDQVEVVTNGRYKSTLHRVIADKNGSRISIATFYNPAGDAVISPAPKLLYPNHFRFQDYLNLYGSTKFEDKGPRFESMKKMPNGHQSLPV

实施例3：针对ACO1基因RNAi载体的构建

本实施例采用Gateway克隆技术，步骤(二)、(三)、(四)中所用载体均购自ThermoFisher Scientific公司，按照载体说明书操作。

(一)引物设计

对应的蓝莓ACO1基因的RNAi基因靶序列(ACO1-RNAi，SEQ ID NO.7)为：

AUGGAGGUCCCUGUUAUAGACUUUGAUAAGCUUGAUGGUGAGAAGAGAGGUGAAACCAUGGCACUUCUCCACCAAGCUUGUGAAAAGGGGGGCUUCUUUCAGAUUGAGAACCAUGGAAUUGACACAGAGUUGAUGGACAAAGUCAAGUACUUGGUGAAUCAGCAUUAUGAGGAGAAUAUGAAAAAAAGCUUCUACGAAUCGGACAUAGCCAAGGGAUUGGAGGAGAAAAGGAUUACCUCUGAUACAGACUGGGAAAGCACCUUCUUCGUUUGGCAUCGUCCGAAUUCCAACAUCAAUGAGCUCACAAACCUCUCAGAUGACCUCCGCAUGACGAUGGAUGCGUAUAUCAAUCAACUGAUCAAGCUAGCAGAGAAACUGUCGGAG

利用Snapgene软件，根据ACO1基因的RNAi基因靶序列(SEQ ID NO.7)设计用于给蓝莓ACO1基因的RNAi基因靶序列加attB接头的引物F3(SEQ ID NO.8)和R3(SEQ ID NO.9)，序列如下。

F3:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGAGGTCCCTGTTATAGA

R3:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTCCGACAGTTTCTCTGCTAGCTT

以F3和R3为引物，与实施例2相同的材料和方法做PCR扩增，扩增产物称作attB-ACO1产物。

(二)BP反应

材料：

1.取1.5ml离心管，在室温下加入以下成分并混匀：

attB-ACO1产物(≥10ng/μl；终含量15-150ng)，1-7μl 221vector(150ng/μl)1μl(即，供体载体Gateway

TE buffer,pH 8.0，添加到终体积8μl。

2.将BP Clonase

3.在第1步样品混合物中加入2μl BP Clonase

4.将未使用的BP Clonase

5.25℃条件下孵育步骤3所得混合物1h。

6.加1μl Proteinase K solution终止反应。在37℃条件下孵育10min，得到BP反应产物。

(三)转化

取1μl前述BP反应产物(代号：221-ACO1-RNAi)加入到50μl Trans1-T1大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰上孵育30min，42℃热激60s，加入500μl LB培养基，37℃，180rpm震荡培养1h。取20μl和100μl分别涂布在LB(50mg/l卡那霉素)固体平板上，之后阳性鉴定、测序(保存测序菌落)、提质粒，得到重组供体载体，备用。

(四)LR反应

试剂：Gateway

1.取1.5ml离心管，在室温下加入以下成分并混匀：

1–7μL 221-ACO1-RNAi(50–150ng)；

1μL 277vector(150ng/μL)(即，目标载体Gateway

TE buffer,pH 8.0,添加到终体积8μL。

2.将LR Clonase

3.在第1步样品混合物中加入2μl LR Clonase

4.将未使用的LR Clonase

5.25℃条件下孵育步骤3所得混合物1h。

6.加1μl Proteinase K solution终止反应，涡旋。在37℃条件下孵育10min，得到LR反应产物。

(五)转化

取1μl LR反应产物(277-ACO1-RNAi)到50μl Trans 1-T1大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰上孵育30min，42℃热激60s，加入500μl LB培养基，37℃，180rpm震荡培养1h。取20μl和100μl分别涂布在LB(100μg/ml大观霉素)固体平板上，之后菌P、保存菌落、提重组293质粒。以实施例1步骤1相同的方法，转入得到的感受态根癌农杆菌GV3101，得到转化的农杆菌。

以下文所述F4和R4为引物做普通PCR，经琼脂糖凝胶电泳验证，重组成功，如图5所示。

实施例4：果实的感染

1.蓝莓果实的选择

与实施例1步骤2相同，选择“珠宝”品种大绿期蓝莓果实。

2.果实预处理

与实施例1步骤3相同。

3.农杆菌侵染

采用实施例3所制备的转化的农杆菌侵染经预处理的蓝莓果实，操作方法与实施例1步骤4中实验组相同。

得到的重组农杆菌侵染的蓝莓果实。

4.侵染后样品暗培养

与实施例1中实验组相同。暗培养2天。

实施例5：ACO1表达量测定

将经实施例4中暗培养的重组农杆菌侵染的蓝莓果实，野生型蓝莓果实(两组蓝莓果实为同一批次的果实)分别进行蓝莓果实中ACO1-RNA含量测定。

(1)提取蓝莓果实的总RNA

用天根植物总RNA提取试剂盒，提取每组蓝莓果实3枚中的总RNA。

(2)qPCR

以F4(SEQ ID NO.10)和R4(SEQ ID NO.11)为引物，对前述各个蓝莓果实总RNA中潜在的ACO1基因表达量进行定量PCR(荧光染料法)分析。

F4：5’-AAAGGTCCATCTGTAGG

R4：5’-GTAAGAGAATGATCCCA

(3)结果

干扰ACO1基因表达，果实ACO1基因表达量明显降低(基因表达量对照参见图6)。实验数据使用SPSS进行差异显著性分析。实验设置三次重复，取三次的平均值进行数据分析。

实施例6：可溶性糖含量测定

将经实施例4中暗培养的重组农杆菌侵染的蓝莓果实，野生型蓝莓果实(两组蓝莓果实为同一批次的果实)分别进行蓝莓可溶性糖含量测定。

(1)测定方法

使用数显测糖仪(上海仪电物理光学仪器有限公司，型号WYA-3S)进行果实可溶性糖的测定。按照仪器说明书的方法，将蓝莓果实汁液分别涂抹在测糖仪上，读取读数，单位：％。

(2)测定结果

实验数据使用SPSS进行差异显著性分析。实验设置三次重复，取三次的平均值进行数据分析(可溶性糖含量对照参见图7)。

干扰ACO1基因表达，果实可溶性糖含量明显降低。

由此可见，相对于野生型蓝莓，干扰ACO1基因表达，则抑制果实成熟。

实施例7：花青素含量测定

将经实施例4中暗培养的重组农杆菌侵染的蓝莓果实，野生型蓝莓果实(两组蓝莓果实为同一批次的果实)分别进行花青素含量测定。

(1)测定方法

(i)花青素提取液的配制

蓝莓中的主要花青素为天竺葵素-3葡萄糖苷，花青素提取液主要以提取天竺葵素-3葡萄糖苷为主。提取液按照丙酮：甲醇：水：冰醋酸＝60mL：60mL：30mL：15mL配比配制，共165mL花青素提取液。

(ii)花青素的提取

称取冷冻的蓝莓果实3.0g左右，用液氮冷冻、研磨后，全部加入到50mL的离心管中，准确地加入配好的花青素提取液20mL，在40℃下水浴4h，冷却至室温后，15000Xg，4℃，离心20min(Eppendorf5804R)以除去细胞碎片等杂质，用移液枪小心地吸取适量的上清液于新的离心管中，加入配好的缓冲液，稀释相应的倍数。

(iii)用pH示差法测定花青素的总含量

取制备的样品(上清液)1mL，加入pH＝4.5的0.4M的醋酸钠(NaAc)缓冲液或pH＝1.0的0.025M的氯化钾(KCl)缓冲液4mL，充分混合均匀后，于室温下静置20min，转入光路长1cm的比色皿中，用UV-2102C型紫外可见分光光度计，分别以495nm和700nm为吸收波长测定其吸光度,用双蒸水(ddH

花青素的浓度计算公式如下：

花青素的浓度(mg·g

A＝(A495nm,Ph＝1.0-A700nm,pH＝1.0)-(A495nm,PH＝4.5-A700nm,pH＝4.5)(即，Ph＝1.0条件下，495nm与700nm吸光值之差，减去Ph＝4.5条件下，495nm与700nm吸光值之差)，MW为摩尔质量(433.2g/mol)，DF为稀释倍数，ε为吸光系数(15600)。

蓝莓主要以花青素天竺葵-3-葡萄糖苷(pelargonidin-3-glucoside)的摩尔吸收系数(15600)计算。最终以1g试样含有花青素的含量(mg)来表示。

(2)测定结果

实验数据使用SPSS进行差异显著性分析。实验设置三次重复，取三次的平均值进行数据分析(花青素含量对照参见图8)。

干扰ACO1基因表达，果实花青素含量显著降低。

由此可见，相对于野生型蓝莓，干扰ACO1基因表达，则抑制果实成熟。

实施例8：果实硬度测定

将经实施例4中暗培养的重组农杆菌侵染的蓝莓果实，野生型蓝莓果实(三组蓝莓果实为同一批次的果实)分别进行果实硬度测定。

(1)测定方法

用GY-4果实硬度计(莱恩德，GY-4)垂直于果实表面进行硬度测定，硬度单位选取为kg/cm

(2)测定结果

实验数据使用SPSS进行差异显著性分析。实验设置三次重复，取三次的平均值进行数据分析(果实硬度对照参见图9)。

干扰ACO1基因表达，果实硬度明显提升。

由此可见，相对于野生型蓝莓，干扰ACO1基因表达，则抑制果实成熟。

由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

序列表

<110> 山东大丰园农业有限公司

<120> 一种抑制蓝莓果实内源基因表达的方法、系统与应用

<130> C1CNCN210180

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtgagca agggcgagga g 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttacttgtac agctcgtcca tgc 23

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggaggtcc ctgttataga ctttga 26

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaaaccgga agactctggt gc 22

<210> 5

<211> 921

<212> DNA

<213> 蓝莓(vaccinium spp)

<400> 5

atggaggtcc ctgttataga ctttgataag cttgatggtg agaagagagg tgaaaccatg 60

gcacttctcc accaagcttg tgaaaagggg ggcttctttc agattgagaa ccatggaatt 120

gacacagagt tgatggacaa agtcaagtac ttggtgaatc agcattatga ggagaatatg 180

aaaaaaagct tctacgaatc ggacatagcc aagggattgg aggagaaaag gattacctct 240

gatacagact gggaaagcac cttcttcgtt tggcatcgtc cgaattccaa catcaatgag 300

ctcacaaacc tctcagatga cctccgcatg acgatggatg cgtatatcaa tcaactgatc 360

aagctagcag agaaactgtc ggagctcatg tgcgaaaatc ttggtttaga gaaagattac 420

ataaaggaag cattttcagg aagcaaaggt ccatctgtag gaaccaaagt ggctaaatac 480

ccacaatgtc ctcaccctga acttgttaga gggcttcgtg agcatacgga tgctggtggg 540

atcattctct tactccaaga cgatgaagtc ccaggtcttc aattccataa agatggaaaa 600

tgggtagaaa ttccaccttc taagaataac agcatcttta tcaacacagg tgatcaagtg 660

gaagtggtaa ctaatggaag gtacaagagt actttgcacc gtgtaatcgc agataagaac 720

ggaagcagaa tctctatcgc caccttctac aatcccgctg gagatgctgt catttctcca 780

gctcccaaac tcttataccc caaccacttc cgttttcaag attatctgaa cctttatggt 840

tcaactaagt ttgaagacaa gggtccccga ttcgaatcca tgaagaaaat gccgaacggg 900

caccagagtc ttccggtttg a 921

<210> 6

<211> 306

<212> PRT

<213> 蓝莓(vaccinium spp)

<400> 6

Met Glu Val Pro Val Ile Asp Phe Asp Lys Leu Asp Gly Glu Lys Arg

1 5 10 15

Gly Glu Thr Met Ala Leu Leu His Gln Ala Cys Glu Lys Gly Gly Phe

20 25 30

Phe Gln Ile Glu Asn His Gly Ile Asp Thr Glu Leu Met Asp Lys Val

35 40 45

Lys Tyr Leu Val Asn Gln His Tyr Glu Glu Asn Met Lys Lys Ser Phe

50 55 60

Tyr Glu Ser Asp Ile Ala Lys Gly Leu Glu Glu Lys Arg Ile Thr Ser

65 70 75 80

Asp Thr Asp Trp Glu Ser Thr Phe Phe Val Trp His Arg Pro Asn Ser

85 90 95

Asn Ile Asn Glu Leu Thr Asn Leu Ser Asp Asp Leu Arg Met Thr Met

100 105 110

Asp Ala Tyr Ile Asn Gln Leu Ile Lys Leu Ala Glu Lys Leu Ser Glu

115 120 125

Leu Met Cys Glu Asn Leu Gly Leu Glu Lys Asp Tyr Ile Lys Glu Ala

130 135 140

Phe Ser Gly Ser Lys Gly Pro Ser Val Gly Thr Lys Val Ala Lys Tyr

145 150 155 160

Pro Gln Cys Pro His Pro Glu Leu Val Arg Gly Leu Arg Glu His Thr

165 170 175

Asp Ala Gly Gly Ile Ile Leu Leu Leu Gln Asp Asp Glu Val Pro Gly

180 185 190

Leu Gln Phe His Lys Asp Gly Lys Trp Val Glu Ile Pro Pro Ser Lys

195 200 205

Asn Asn Ser Ile Phe Ile Asn Thr Gly Asp Gln Val Glu Val Val Thr

210 215 220

Asn Gly Arg Tyr Lys Ser Thr Leu His Arg Val Ile Ala Asp Lys Asn

225 230 235 240

Gly Ser Arg Ile Ser Ile Ala Thr Phe Tyr Asn Pro Ala Gly Asp Ala

245 250 255

Val Ile Ser Pro Ala Pro Lys Leu Leu Tyr Pro Asn His Phe Arg Phe

260 265 270

Gln Asp Tyr Leu Asn Leu Tyr Gly Ser Thr Lys Phe Glu Asp Lys Gly

275 280 285

Pro Arg Phe Glu Ser Met Lys Lys Met Pro Asn Gly His Gln Ser Leu

290 295 300

Pro Val

305

<210> 7

<211> 384

<212> RNA

<213> 蓝莓(vaccinium spp)

<400> 7

auggaggucc cuguuauaga cuuugauaag cuugauggug agaagagagg ugaaaccaug 60

gcacuucucc accaagcuug ugaaaagggg ggcuucuuuc agauugagaa ccauggaauu 120

gacacagagu ugauggacaa agucaaguac uuggugaauc agcauuauga ggagaauaug 180

aaaaaaagcu ucuacgaauc ggacauagcc aagggauugg aggagaaaag gauuaccucu 240

gauacagacu gggaaagcac cuucuucguu uggcaucguc cgaauuccaa caucaaugag 300

cucacaaacc ucucagauga ccuccgcaug acgauggaug cguauaucaa ucaacugauc 360

aagcuagcag agaaacuguc ggag 384

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catggaggtc cctgttatag a 51

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctccgacagt ttctctgcta gctt 54

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaaggtccat ctgtagg 17

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtaagagaat gatccca 17