一种氘代犬尿氨酸及其在多肽中氨基酸构型分析中的应用

摘要

本发明提供了一种氘代犬尿氨酸及其在多肽中氨基酸构型分析中的应用，包括氘代犬尿氨酸的合成过程、基于高分辨质谱和核磁技术的对氘代犬尿氨酸的结构确证、将其作为对照品通过液相色谱‑高分辨质谱确定达托霉素中犬尿氨酸的构型。本发明首次确定出氘代犬尿氨酸的氘代位点及氘代个数，同时可判断多肽中犬尿氨酸的构型，适用于多肽类药物的质量控制。

说明书

技术领域

本发明涉及药物化学和药物分析化学领域，尤其涉及一种氘代犬尿氨酸及其在多肽中氨基酸构型分析中的应用。

背景技术

达托霉素为环脂肽类抗生素，在体内外对耐药革兰氏阳性菌具有强力杀菌作用。达托霉素由10个氨基酸残基组成环肽部分、3个氨基酸组成线性肽部分、末端氨基酸连接癸酰基脂肪链，结构式I如下：

氨基酸构型的变化对达托霉素的抗菌活性影响很大(彭希希,王赛赛,付琛,胡昌华,廖国建.药学学报,2018,53(6):839-844)，必须建立合理的方法对达托霉素中的氨基酸及其构型进行监控以保证药品安全。

目前，对氨基酸构型的分析为多肽在盐酸中加热水解、再采用手性衍生法经液相色谱或液相色谱质谱法进行分析，但这种方法不能排除加热过程是否存在α-碳构型转化。选择氘代盐酸重水溶液作为水解试剂，如果α-碳发生构型转化，则α-碳上的氢可以转化为氘，并且洗脱时间发生变化，以此可以区分是否是加热过程发生了构型转化。

达托霉素中犬尿氨酸(Kynurenine，Kyn)为非蛋白质氨基酸，结构式II如下。目前尚无报道氘代犬尿氨酸制备方法、氘代位点及应用的文献(张佳宇,苑振宽,张宇,韩维娜.哈尔滨医科大学学报,2014,48(3):255-259；Murai Y,Wang L,Masuda K,Sakihama Y,Hashidoko Y,Hatanaka Y,Hashimoto M.2013,2013(23),5111-5116)。

在此基础上，对氘代犬尿氨酸的结构进行研究，并将氘代犬尿氨酸应用至达托霉素中的氨基酸构型分析中，是一个重要的研究方向。

发明内容

为实现上述技术目的，本发明提供了一种氘代犬尿氨酸及其在多肽中氨基酸构型分析中的应用，包括氘代犬尿氨酸的合成过程、基于高分辨质谱和核磁技术的对氘代犬尿氨酸的结构确证、将其作为对照品通过液相色谱-高分辨质谱确定达托霉素中犬尿氨酸的构型。

第一方面，本发明提供了一种氘代犬尿氨酸，其结构式(1)、(2)为

第二方面，本发明提供了一种上述氘代犬尿氨酸的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤S1、加热水解：将L-犬尿氨酸(3)溶解于氘代盐酸重水溶液中，浓度为0.5mg/mL-20mg/mL，充氮密封，加热后得到第一混合溶液；

步骤S2、所述第一混合溶液经液相色谱进行纯化，收集氘代犬尿氨酸馏分，冻干，得微黄色粉末状氘代犬尿氨酸；

所述液相色谱的具体操作条件为：采用十八烷基键合硅胶反相色谱柱，流动相A为0.01-1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈或甲醇，流动相A：流动相B＝40:60-10:90(v/v)，流速设定为0.5-2mL/min，柱温为25-40℃，进样量为10-100μL，吸收波长为190-280nm。

优选地，所述氘代盐酸重水溶液的摩尔浓度为4-10mol/L。

优选地，所述加热的温度为85℃-130℃，所述加热的时间为5h-24h。

第三方面，本发明提供一种达托霉素中犬尿氨酸构型的检测方法，具体包括以下步骤：

步骤A1、手性Marfey’s试剂衍生：

取达托霉素供试品溶液和对照品溶液，分别置于液相进样瓶中，采用手性Marfey’s试剂溶液对所述达托霉素供试品溶液和对照品溶液进行衍生化反应，得到衍生化后的对照品溶液和供试品溶液；

步骤A2：将所述衍生化后的对照品溶液和供试品溶液，经高效液相色谱-质谱分析；

所述供试品溶液包括L-犬尿氨酸溶液、D-犬尿氨酸溶液和L-氘代犬尿氨酸溶液，所述L-氘代犬尿氨酸溶液包括上述的L-氘代犬尿氨酸。

优选地，所述达托霉素的结构式(4)如下，其13位氨基酸为L-犬尿氨酸。

优选地，步骤A1中，还包括以下步骤：

步骤A11、所述达托霉素供试品溶液的制备方法：

将达托霉素溶解于氘代盐酸的重水溶液中，达托霉素的浓度为0.5-5mg/mL，充氮密封，加热水解，得到水解溶液，所述水解溶液放冷至室温，加4-8mol/L氢氧化钠溶液适量，中和至中性，得到达托霉素供试品溶液；

步骤A12、所述对照品溶液的制备方法：

所述对照品溶液的制备方法为：将D-犬尿氨酸、L-犬尿氨酸和所述氘代犬尿氨酸，分别溶解于氘代盐酸的重水溶液中，得到对照品溶液；所述对照品溶液的浓度为0.3-5mg/mL；

步骤A13、所述手性Marfey’s试剂溶液的制备方法：

将所述Marfey’s试剂溶于溶剂，得到所述手性Marfey’s试剂溶液，浓度为0.5-4mg/mL。

优选地，步骤A11中，所述温度100-140℃，所述时间为5-24h。

优选地，步骤A13中，所述的Marfey’s试剂为Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L/D-缬氨酰胺(L/D-FDVA)、Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L/D-丙氨酰胺(L/D-FDAA)、Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L/D-亮氨酰胺(L/D-FDLA)和Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L/D-苯丙氨酰(L/D-FDPA)中的一种。

优选地，步骤A13中，所述的Marfey’s试剂的溶剂为二甲亚砜、丙酮或乙醇。

优选地，步骤A2中，具体包括：分别量取达托霉素供试品溶液20-80μL、L-犬尿氨酸溶液、D-犬尿氨酸溶液、氘代犬尿氨酸溶液10-60μL，分别置液相进样瓶中，加手性Marfey’s试剂溶液20-80μL和0.01-0.1mol/L三乙胺溶液10-50μL，混匀，置30-80℃水浴中反应40-100min，取出，放冷至室温，加入0.02-0.08mol/L甲酸溶液10-50μL使成中性。

优选地，步骤A2中，所述的高效液相色谱中，色谱柱为C8或C18，流动相A为0.01-0.2％甲酸水溶液，流动相B为乙腈或甲醇，柱温25-50℃，流速1-2mL/min，采用梯度洗脱。

第四方面，本发明提供一种多肽中犬尿氨酸构型的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤A1、手性Marfey’s试剂衍生：

取多肽供试品溶液和对照品溶液，分别置于液相进样瓶中，采用手性Marfey’s试剂溶液对所述达托霉素供试品溶液和对照品溶液进行衍生化反应，得到衍生化后的对照品溶液和供试品溶液；

步骤A2：将所述衍生化后的对照品溶液和供试品溶液，经高效液相色谱-质谱分析；

所述供试品溶液包括L-犬尿氨酸溶液、D-犬尿氨酸溶液和L-氘代犬尿氨酸溶液，所述L-氘代犬尿氨酸溶液包括如权利要求1-4任一项所述的L-氘代犬尿氨酸。

相较于现有技术，本发明的技术效果在于：

本发明中首次确定出L-氘代犬尿氨酸的氘代位点、氘代个数，通过L-氘代犬尿氨酸在加热水解过程中不会发生α构型转化，可判断多肽中犬尿氨酸的构型，适用于多肽类药物的质量控制。

附图说明

图1为L-氘代犬尿氨酸的质谱图；

图2为L-氘代犬尿氨酸的核磁氢谱图；

图3为D-犬尿氨酸-D-FDVA衍生物(A)、L-犬尿氨酸-D-FDVA衍生物的质谱总离子流图；

图4为L-犬尿氨酸-D-FDVA衍生物的质谱图；

图5为L-氘代犬尿氨酸-D-FDVA衍生物的总离子流图；

图6为L-氘代犬尿氨酸-D-FDVA衍生物的质谱图；

图7为达托霉素经氘代盐酸水解成氨基酸、D-FDVA衍生后的总离子流图(A)，通过提取离子m/z 493.20得到的离子流图(B)；

图8为达托霉素水解的L-氘代犬尿氨酸-D-FDVA衍生物的质谱图。

具体实施方式

主要用到的试药为：L-犬尿氨酸(批号：CNU8L)，达托霉素(批号：933039)。

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

仪器与试药

本发明在研究过程中主要用到的仪器为：Agilent 1290型高效液相色谱仪-6550QTOF-MS(美国Agilent Technologies公司)。

实施例1

本实施例提供一种氘代犬尿氨酸的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤S1、加热水解：将L-犬尿氨酸溶解于6mol/L氘代盐酸重水溶液中，得到第一混合溶液，浓度为2mg/mL，加热温度为110℃，反应时间为7h；

步骤S2、经液相色谱进行纯化，收集氘代犬尿氨酸馏分，冻干，得微黄色粉末状氘代犬尿氨酸；

液相色谱具体操作条件为：采用十八烷基键合硅胶反相色谱柱，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相A：流动相B＝50:50(v/v)，流速设定为0.8mL/min，柱温为35℃，进样量为100μL，吸收波长为254nm。

方法一：

通过液相色谱质谱对实施例1中制备的氘代犬尿氨酸进行结构验证，具体操作如下：

将氘代犬尿氨酸溶解于10％乙腈溶液中，浓度为1mg/mL，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相A：流动相B＝50:50(v/v)，流速设定为0.8mL/min，柱温为35℃，进样量为10L，吸收波长为254nm，质谱扫描范围为m/z 100-800。

其质谱图见附图1所示，准分子离子峰的m/z为213.1234([M+H]+)，并可观察到m/z为212.1113([M+H]+)的离子峰，分别较犬尿氨酸(m/z 209.0848，[M+H]+)的理论分子量大4和3，说明分别有四个氢和三个氢被氘取代。

方法二：

通过核磁共振氢谱对实施例1中制备的氘代犬尿氨酸进行结构验证，具体操作如下：

称取5mg氘代犬尿氨酸溶解于氘代盐酸溶液，经核磁共振仪测定其氢谱，见附图2所示：1H-NMR(500MHz,DCl)，氢的化学位移为δ6.05(s,1H)、5.72(s,1H)、2.60(s,1H)、1.96(d,J＝5.1Hz,0.5H)。苯环上3位氢的化学位移为6.05，5位氢的化学位移为5.72，苯环上4及6位的H被氘代。7位上的H经积分显示有0.5H，说明7位亚甲基上的两个氢的氘代率为75％。进一步地说明，存在4个氢被氘代或3个氢被氘代的氘代犬尿氨酸。同时，8位上的H(化学位移为2.60)未被氘代。

根据以上信息，推导氘代犬尿氨酸的转化过程和化学结构如下：

实施例2

本实施例提供达托霉素中犬尿氨酸的构型的测定方法，具体包括以下步骤：

步骤A1、手性Marfey’s试剂衍生：

步骤A11、达托霉素供试品溶液的制备：将达托霉素溶解于氘代盐酸的重水溶液中，达托霉素的浓度为1mg/mL，充氮密封，加热水解，得到水解溶液，所述水解溶液放冷至室温，加4-8mol/L氢氧化钠溶液适量，中和至中性，得到达托霉素供试品溶液；

步骤A12、对照品溶液的制备方法：将D-犬尿氨酸、L-犬尿氨酸和实施例1中的氘代犬尿氨酸，分别溶解于氘代盐酸的重水溶液中，得到对照品溶液；所述对照品溶液的浓度为0.5mg/mL；

步骤A13、所述手性Marfey’s试剂溶液的制备方法：将所述D-FDVA试剂溶于溶剂，得到所述手性Marfey’s试剂溶液，浓度为2mg/mL；

分别量取达托霉素供试品溶液50μL、L-犬尿氨酸、D-犬尿氨酸及L-氘代犬尿氨酸溶液30μL，分别置液相进样瓶中，加D-FDVA溶液50μL和0.05mol/L三乙胺溶液30μL，混匀，置40℃水浴中反应60min，取出，放冷至室温，加入0.05mol/L甲酸溶液30μL使成中性；

步骤A2、高效液相色谱-高分辨质谱分析：

高效液相色谱操作参数：采用常规C18反相色谱柱，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，流动相的组成见表1，检测波长为340nm，柱温40℃，流速为1.5mL/min，进质谱检测前分流，分流比为2:1。

表1梯度洗脱过程中流动相的组成

D/L-犬尿氨酸-D-FDVA衍生物的总离子流图分别见附图3A和3B，其保留时间分别为25.4min和30.2min，准分子离子峰的质荷比相同，其中L-犬尿氨酸-D-FDVA衍生物的m/z为489.1746([M+H]+)，见图4。

L-氘代犬尿氨酸-D-FDVA衍生物的总离子流图见附图5，其保留时间分别为30.1min，与L-犬尿氨酸-D-FDVA衍生物的保留时间基本一致，说明在L-犬尿氨酸中不存在D-犬尿氨酸，L-犬尿氨酸也不会在加热过程中发生α-碳构型转化。

L-氘代犬尿氨酸-D-FDVA衍生物的准分子离子峰的m/z为492.1918和493.1984([M+H]+)，参见图6，分别代表L-氘代犬尿氨酸-D-FDVA衍生物含有三个氘和四个氘原子。另外，还可以观察到微量的离子峰m/z 491.1840，说明存在含有两个氘原子的L-氘代犬尿氨酸-D-FDVA衍生物，只是含量较低，未被核磁检测到。

达托霉素经氘代盐酸水解成氨基酸、D-FDVA衍生后的总离子流图见图7A，通过提取离子m/z 493.20得到的离子流图见图7B所示，发现只有在30.1min有峰，该峰与L-氘代犬尿氨酸-D-FDVA衍生物峰的洗脱时间一致，说明达托霉素中的犬尿氨酸的构型为L型。达托霉素水解后的氘代犬尿氨酸-D-FDVA衍生物的质谱图见图7，其准分子离子峰的m/z为493.1994，说明含有四个氘原子，离子峰m/z 492.1923说明含有三个氘原子，m/z 491.1849说明含有微量的两个氘原子。

综上所述，本发明提供了一种氘代犬尿氨酸及其在多肽中氨基酸构型分析中的应用，包括氘代犬尿氨酸的合成过程、基于高分辨质谱和核磁技术的结构确证、作为对照品通过液相色谱-高分辨质谱确定达托霉素中犬尿氨酸的构型。本发明首次确定出氘代犬尿氨酸的氘代位点及氘代个数，同时可判断多肽中犬尿氨酸的构型，适用于多肽类药物的质量控制。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。