妥布霉素原料及相关制剂杂质谱的分析方法

摘要

本发明公开了一种妥布霉素原料及相关制剂杂质谱的分析方法，采用柱后衍生化‑高效液相色谱荧光检测法。本发明的分析方法采用柱后衍生化‑高效液相色谱荧光检测(HPLC‑FLD)法，具有反应速度快、衍生化试剂不干扰测定等优点，并且经色谱条件的筛选和优化，可有效分离工艺杂质和降解杂质，同时灵敏度较高；对基质复杂的样品，如混悬型滴眼液、眼膏等分析，结果证实方法专属性良好，可推广性强。

说明书

技术领域

本发明涉及药物分析领域，尤其涉及一种妥布霉素原料及相关制剂杂质谱的分析方法。

背景技术

妥布霉素(Tobramycin)是黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)ATCC 17920发酵获得的一个具有广谱抗菌活性的氨基糖苷类抗生素。临床主要用于敏感细菌引起的严重感染，如革兰阳性菌特别是绿脓杆菌、大肠杆菌及肺炎杆菌等引起的烧伤感染、败血症、呼吸系统感染、泌尿系统感染、胆囊胆道感染及软组织严重感染等。肌肉注射后吸收迅速而完全，在体内不代谢，经肾小球滤过排出。24h内排出给药量的85％～93％。其主要不良反应为耳毒性和肾毒性。临床常见剂型为硫酸妥布霉素注射液、滴眼剂和眼膏剂等。

妥布霉素直接来源于发酵，工艺上需要采用离子交换树脂分离、重结晶等纯化工艺，但依然会存在含量不等的其他氨基糖苷组分，如氨甲酰妥布霉素、卡那霉素B、新霉胺、暗霉胺等。为了控制妥布霉素及其制剂的质量，目前，《英国药典》和《欧洲药典》采用高效液相色谱-脉冲安培电化学检测法(HPLC-PAD)、《美国药典》采用柱前衍生化-高效液相色谱紫外检测法(HPLC-UV)，《日本药局方》采用薄层色谱法(TLC)，《中国药典》采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)控制产品中的杂质。经文献查阅，对于妥布霉素及其相关制剂杂质谱的分析以柱前衍生化-HPLC-UV为主。

结合试验操作，现有妥布霉素及其制剂检测方法具有如下缺点：

1)HPLC-PAD法对试剂纯度及人员操作的熟练程度要求较高，并且电化学检测器成本是其他检测器的几倍，方法的稳定性和可普及性需要持续验证；

2)柱前衍生化法存在衍生化副产物多且衍生化试剂等易干扰杂质的检测等问题，不适合用于妥布霉素杂质谱的分析；

3)HPLC-ELSD法方法的重复性及重现性不佳，该问题有ELSD仪器本身的原因，也有仪器操作人员对标准了解的偏差，如低温型ELSD仪的参数和高温型ELSD仪参数的换算问题。

因此，建立一种高灵敏、强专属性、分离高效的分析方法，对于考查、评价妥布霉素原料的杂质谱，进而指导其相关制剂工艺的优化非常必要。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提出一种妥布霉素原料及相关制剂杂质谱的分析方法，采用柱后衍生化-高效液相色谱荧光检测(HPLC-FLD)法，在线衍生化后荧光检测，具有反应速度快、衍生化试剂不干扰测定等优点，并且经色谱条件的筛选和优化，可有效分离工艺杂质和降解杂质，同时灵敏度较高，可达0.01μg/ml(进样量5μl)，是控制妥布霉素及其相关制剂中杂质谱的可推广的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明是提供了一种妥布霉素原料及相关制剂杂质谱的分析方法，采用柱后衍生化-高效液相色谱荧光检测法，包括如下步骤：

步骤一：分别配制混合对照品溶液、妥布霉素碱降解溶液、妥布霉素原料粗品溶液和妥布霉素相关制剂溶液；

步骤二：采用由有机溶剂、含离子对试剂的缓冲盐水溶液组成的流动相A和流动相B，对所述混合对照品溶液、妥布霉素碱降解溶液、妥布霉素原料粗品溶液和妥布霉素相关制剂溶液进行线性梯度洗脱，洗脱条件为：0-30min，100-10％A、0-90％B；30-31min，100％B；31-40min，100％B；41-50min，100％A；

步骤三：采用在线衍生化装置对洗脱液进行衍生化，采用检测器测定有关物质；

其中，所述有关物质包括妥布霉素、卡那霉素B、新霉胺、氨甲酰妥布霉素、暗霉胺、妥布霉素A、2-脱氧链霉胺中的至少一种。

进一步地，所述有机溶剂为甲醇、乙腈或甲醇/乙腈混合溶剂；所述含离子对试剂为烷基磺酸的钠盐、钾盐、铵盐中的至少一种；所述缓冲盐水溶液中的缓冲盐为硫酸的钠盐、钾盐、铵盐中的至少一种；所述缓冲盐水溶液采用磷酸、冰醋酸或甲酸中的一种调节pH值为3.0～4.0。

进一步优选地，所述有机溶剂为甲醇；所述含离子对试剂为庚烷磺酸钠；所述缓冲盐水溶液中的缓冲盐为无水硫酸钠；所述缓冲盐水溶液采用冰醋酸调节pH值为3.0～3.7。

进一步地，所述流动相A中所述有机溶剂的体积比为0-5％，所述流动相B中所述有机溶剂的体积比为30-40％；所述含离子对试剂的缓冲盐水溶液中含离子对试剂的浓度为5～25mmol·L

进一步优选地，所述流动相A中所述有机溶剂的体积比为5％，所述流动相B中所述有机溶剂的体积比为40％；所述含离子对试剂的缓冲盐水溶液中含离子对试剂的浓度为10～20mmol·L

进一步地，所述衍生化为：衍生化溶液中的衍生化试剂在一定流速下和柱后洗脱液在一定温度下发生衍生化反应，所述衍生化溶液的流速为0.1～0.5ml/min，所述衍生化反应的温度为25～55℃；所述衍生化溶液为含邻苯二甲醛、巯基试剂的硼酸-氢氧化钠缓冲液，其中所述邻苯二甲醛的浓度为0.4～2g/L、所述巯基试剂为巯基醇类试剂或巯基酸类试剂。

进一步优选地，所述衍生化溶液的流速为0.1～0.3ml/min，所述衍生化反应的温度为40～50℃。

进一步优选地，所述衍生化溶液中邻苯二甲醛的浓度为0.7～1.5g/L；所述巯基试剂为巯基乙醇。

进一步地，所述检测器为荧光检测器，其激发波长为320～360nm，发射波长为410～460nm。

进一步优选地，所述荧光检测器的激发波长为330～350nm，发射波长为425～450nm。

进一步地，步骤二中，采用色谱柱的填料活性基团为十八烷基硅烷键合硅胶，其柱温为25～45℃，进样体积为1～20μL，流速为0.5～2.0mL·min

进一步优选地，所述色谱柱的柱温为30～40℃，进样体积为5μL，流速为1.1mL·min

进一步地，所述妥布霉素的检测限为0.01-0.02μg·mL

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明的妥布霉素原料及相关制剂杂质谱的分析方法，采用柱后衍生化-高效液相色谱荧光检测(HPLC-FLD)法，具有反应速度快、衍生化试剂不干扰测定等优点，并且经色谱条件的筛选和优化，可有效分离工艺杂质和降解杂质，同时灵敏度较高；对基质复杂的样品，如混悬型滴眼液、眼膏等分析，结果证实方法专属性良好，可推广性强。

附图说明

图1是实施例1中妥布霉素及其杂质的混合对照品溶液的典型色谱图，其中的色谱峰为：1-妥布霉素A、2-新霉胺、3-暗霉胺、4-卡那霉素B、5-妥布霉素；

图2是实施例1中妥布霉素对照品的碱降解溶液的典型色谱图，其中的色谱峰为：1-2-脱氧链霉胺、2-妥布霉素A、3-暗霉胺、4-妥布霉素；

图3是实施例1中来源为A的妥布霉素原料粗品溶液的典型色谱图，其中的色谱峰为：1-妥布霉素A、2-新霉胺、3-暗霉胺、4-氨甲酰妥布霉素、5-卡那霉素B、6-妥布霉素；

图4是实施例2中来源为B的硫酸妥布霉素注射液的典型色谱图，其中的色谱峰为：1-2-脱氧链霉胺、2-妥布霉素A、3-新霉胺、4-暗霉胺、5-氨甲酰妥布霉素、6-卡那霉素B、7-妥布霉素、其余为未知杂质；

图5是实施例2中来源为C的硫酸妥布霉素注射液的典型色谱图，其中的色谱峰为：1-2-脱氧链霉胺、2-妥布霉素A、3-新霉胺、4-暗霉胺、5-氨甲酰妥布霉素、6-卡那霉素B、7-妥布霉素、其余为未知杂质；

图6是实施例3中来源为D的妥布霉素地塞米松滴眼液的典型色谱图，其中的色谱峰为：1-2-脱氧链霉胺、2-妥布霉素A、3-暗霉胺、4-氨甲酰妥布霉素、5-卡那霉素B、6-妥布霉素、其余为未知杂质；

图7是实施例3中来源为E的氯替泼诺妥布霉素滴眼液的典型色谱图，其中的色谱峰为：1-2-脱氧链霉胺、2-妥布霉素A、3-新霉胺、4-暗霉胺、5-氨甲酰妥布霉素、6-卡那霉素B、7-妥布霉素、其余为未知杂质；

图8是实施例4中来源为F的妥布霉素眼膏的典型色谱图，其中的色谱峰为：1-妥布霉素A、2-新霉胺、3-暗霉胺、4-氨甲酰妥布霉素、5-卡那霉素B、6-妥布霉素、其余为未知杂质。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

本发明涉及妥布霉素原料及相关制剂杂质谱的分析方法，采用柱后衍生化-高效液相色谱荧光检测法，包括如下步骤：

步骤一：分别配制混合对照品溶液、妥布霉素碱降解溶液、妥布霉素原料粗品溶液和妥布霉素相关制剂溶液；

步骤二：采用由有机溶剂、含离子对试剂的缓冲盐水溶液组成的流动相A和流动相B，对上述混合对照品溶液、妥布霉素碱降解溶液、妥布霉素原料粗品溶液和妥布霉素相关制剂溶液进行线性梯度洗脱，洗脱条件为：0-30min，100-10％A、0-90％B；30-31min，100％B；31-40min，100％B；41-50min，100％A；

步骤三：采用在线衍生化装置对洗脱液进行衍生化，采用检测器测定有关物质；

其中，所述有关物质包括妥布霉素、卡那霉素B、新霉胺、氨甲酰妥布霉素、暗霉胺、妥布霉素A、2-脱氧链霉胺中的至少一种。

以下对妥布霉素有关物质进行说明，如表1所示：

表1妥布霉素及各已有关物质的结构和来源

本发明的实施例中采用的仪器为：Agilent高效液相色谱仪，配备荧光检测器、四元梯度泵、自动进样器；柱后衍生化装置一套；电子天平(MSE125P-100-DU，德国Sartorius公司)。

其中，使用的色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse(4.6mm×100mm，3.5μm)；流速：1.1mL·min

样品来源：来源A，北京某研究院；来源B，爱尔兰某制药公司；来源C，上海某制药公司；来源D，上海某制药公司；来源E，美国某制药公司；来源F，比利时某制药公司。

在本发明中，线性梯度洗脱采用由有机溶剂、含离子对试剂的缓冲盐水溶液组成的流动相A和流动相B；上述有机溶剂为甲醇；上述含离子对试剂为烷基磺酸的钠盐、钾盐、铵盐中的至少一种，优选为庚烷磺酸钠；上述缓冲盐水溶液中的缓冲盐为硫酸的钠盐、钾盐、铵盐中的至少一种，优选为无水硫酸钠；上述缓冲盐水溶液采用磷酸、冰醋酸或甲酸中的一种调节pH值为3.0～4.0，优选为采用冰醋酸调节pH值为3.0～3.7。

上述流动相A中有机溶剂的体积比为0-5％，优选为5％，流动相B中有机溶剂的体积比为30-40％，优选为40％；

上述含离子对试剂的缓冲盐水溶液中含离子对试剂的浓度为5～25mmol·L

在本发明中，衍生化具体过程为：衍生化溶液中的衍生化试剂在一定流速下和柱后洗脱液在一定温度下发生衍生化反应。上述衍生化溶液的流速为0.1～0.5ml/min，优选为0.1～0.3ml/min；衍生化反应的温度为25～55℃，优选为40～50℃；上述衍生化溶液为含邻苯二甲醛、巯基试剂的硼酸-氢氧化钠缓冲液，其中邻苯二甲醛的浓度为0.4～2g/L，优选为0.7～1.5g/L、巯基试剂为巯基醇类试剂或巯基酸类试剂，优选为巯基乙醇。

实施例1

溶液配制：

1.含离子对试剂的缓冲盐水溶液

取无水硫酸钠16g，庚烷磺酸钠4.4g，加水1000ml使溶解，用冰醋酸调节pH值至3.4。

2.流动相A

甲醇与上述含离子对试剂的缓冲盐水溶液按5:95的体积比混合。

3.流动相B

甲醇与上述含离子对试剂的缓冲盐水溶液按40:60的体积比混合。

4.混合对照品溶液

精确称取妥布霉素A、新霉胺、暗霉胺、卡那霉素B和妥布霉素对照品，加水溶解并稀释至上述每种对照品的浓度为0.1mg/ml。

5.碱降解溶液

精确称取妥布霉素对照品，加水溶解并稀释至浓度为0.5mg/ml，取上述溶液1ml，加5mol/L的氢氧化钠溶液0.5ml，混匀，80℃加热0.5h，取出，放置至室温，加25％硫酸溶液中和。

6.来源为A的妥布霉素原料粗品溶液

精确称取妥布霉素原料粗品(来源为A)，加水溶解并稀释至浓度为0.25mg/ml。

将上述混合对照品溶液、碱降解溶液和来源为A的妥布霉素原料粗品溶液，分别进行柱后衍生化-高效液相色谱荧光检测；

其中，梯度洗脱条件为：0-30min，100-10％A、0-90％B；30-31min，100％B；31-40min，100％B；41-50min，100％A；荧光检测器的激发波长为340nm、发射波长为440nm。结果如图1-3所示。

实施例2

精确称取硫酸妥布霉素注射液(来源为B，规格40mg/ml)，加水溶解并稀释至浓度为0.24mg/ml。

精确称取硫酸妥布霉素注射液(来源为C，规格40mg/ml)，加水溶解并稀释至浓度为0.24mg/ml。

采用与实施1相同的仪器和检测条件，进样分析，结果如图4-5所示。

实施例3

精确称取妥布霉素地塞米松滴眼液(来源为D，含妥布霉素3mg/ml)，加水溶解并稀释至浓度为0.24mg/ml。

精确称取氯替泼诺妥布霉素滴眼液(来源为E，含妥布霉素3mg/ml)，加水溶解并稀释至浓度为0.24mg/ml。

采用与实施1相同的仪器和检测条件，进样分析，结果如图6-7所示。

实施例4

精密称取妥布霉素眼膏(来源为F，规格0.3％)4g，置60ml分液漏斗，加乙醚20ml，振摇使眼膏分散均匀，加水10ml，提取5次，取水层置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，得妥布霉素眼膏溶液。

采用与实施1相同的仪器和检测条件，进样分析，结果如图8所示。

本发明建立的柱后衍生化高效液相色谱-荧光检测法色谱分离系统，采用在线衍生化后荧光检测的方式，反应速度快。避免了柱前衍生化复杂的操作，且衍生化试剂等不干扰测定，且采用的色谱条件可有效分离工艺杂质和降解杂质，同时灵敏度较高，并且经过对基质复杂样品如混悬型滴眼液、眼膏等分析，证实方法专属性良好，是控制妥布霉素及其相关制剂中杂质谱的可推广的方法。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。