一种茎瘤芥BjuA036398基因在调控植物侧根发育中的应用

摘要

本发明公开了一种茎瘤芥BjuA036398基因在调控植物侧根发育中的应用，所述BjuA036398基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，利用转基因技术调控BjuA036398的cDNA序列在拟南芥中过量表达，相比于野生型植株，获得了侧根数目明显增加的转基因植物，表明茎瘤芥BjuA036398基因具有调控植物侧根发育的重要生物学功能。通过提高BjuA036398基因的表达量，能增加植物侧根数目，提高植物从土壤中吸收养分的能力。BjuA036398基因新功能的发现为植物侧根发育调控提供了新的基因靶点和资源，茎瘤芥BjuA036398基因可广泛应用于植物遗传育种、种质资源改良和培育，对改进和改良茎瘤芥等作物的种质资源具有重要作用。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别的涉及一种茎瘤芥BjuA036398基因在调控植物侧根发育中的应用。

背景技术

植物根系在植物水分和氮素的吸收，碳的存贮以及支撑地上部分等生理活动中起着重要作用；同时，植物根系也是植物应对生物和非生物胁迫的重要功能器官。茎瘤芥根系是典型的直根系，包括主根和侧根。侧根的发育对于根系的功能有着重要的作用。侧根数增加，可使根表面积增加，进一步促进整个植株的发育，最终达到提高茎瘤芥产量和质量的目的。尤其在土地干旱或贫瘠条件下，根系的发育起着至关重要的作用。因此，增加侧根数，以及增大根表面积，不仅能扩大茎瘤芥的可种植面积，使其适应在干旱和贫瘠的土地上生长，而且对提高茎瘤芥的产量和品质具有重要意义。

生长素是一种十分重要的植物激素，对植物的生长发育具有广泛的调控作用，如胚胎及果实发育、组织分化、根的向地性以及植物对生物逆境和非生物逆境胁迫的响应等。生长素对植物生长发育的调控作用主要通过一系列分子信号传递过程来实现，经典的生长素信号转导通路主要包括三类基因家族成员：TIR1/AFB(transport inhibitor response1/auxin signaling f-box protein)家族基因、IAA家族基因和ARF(auxin responsefactor)家族基因。在低浓度生长素条件下，IAA蛋白可以与ARF蛋白结合形成异源二聚体并抑制ARF的转录活性。当生长素在植物细胞中大量积累时，生长素分子可与TIR1/AFB蛋白结合，激活的TIR1/AFB蛋白可与IAA蛋白结合并通过26S泛素蛋白酶体途径将IAA蛋白降解，从而释放ARF蛋白的转录活性，ARF蛋白可通过转录激活或转录抑制的方式调控生长素响应基因的表达，从而实现生长素的作用效果。TIR1蛋白是第一个被鉴定出的生长素受体，该蛋白氨基端编码一个F-BOX结构域，羧基端编码多个亮氨酸重复(Leucine-rich repeat，LRR)结构域。TIR1蛋白主要作为SCF型泛素复合体中的底物受体发挥功能，该蛋白可通过26S蛋白酶复合体系统特异地降解IAA蛋白。拟南芥TIR1基因缺失突变体表现为多方面的生理异常表型，如胚轴伸长和侧根发生均受到抑制。在拟南芥中过表达AtTIR1基因后，转基因植株可表现为主根变短、根向地性缺失以及侧根数目增多等表型。在大豆中，基因沉默GmTIR1基因可导致根瘤发生数目减少。TIR1基因除在植物生长发育发面发挥功能外，还参与植物响应非生物和生物逆境胁迫过程。如在拟南芥中，抑制AtTIR1基因的表达会导致植株对生长素信号不敏感，同时缓解非生物逆境对植物的胁迫作用。同样，拟南芥AtTIR1基因的转录水平受细菌致病鞭毛蛋白flg22的抑制，导致植株内生长素信号通路减弱，从而限制细菌在植物体内的生长。但有关茎瘤芥生长素受体调控植物生长发育的研究报道未见报道，其生物学功能及转录调控机制还远未阐明。

发明内容

针对现有技术存在的空白，本发明的目的在于提供一种茎瘤芥BjuA036398基因在调控植物侧根发育中的应用，为作物根系发生发育改良提供了新的基因靶点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种茎瘤芥BjuA036398蛋白或相关生物材料在调控植物侧根发育中的应用，所述相关生物材料为能够编码所述BjuA036398蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；所述BjuA036398蛋白为如下任一种氨基酸序列：(1)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质；(3)与(1)-(2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

进一步，所述编码BjuA036398蛋白的核酸分子具有如下任一种核苷酸序列：(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；(2)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个碱基的替换、插入或缺失得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列；(3)与(1)-(2)中任一所限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列。

进一步，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；优选为茎瘤芥、拟南芥、白菜、萝卜或油菜。

进一步，所述侧根发育为增加侧根数量。

本发明的另一个目的在于，还提供了一种调控植物侧根发育的方法，包括：调控植物中BjuA036398蛋白的表达量和/或活性；所述BjuA036398蛋白具有如下任一种氨基酸序列：(1)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；(2)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；(3)与(1)-(2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

本发明的另一个目的在于，还提供了一种培育植物侧根数量增多的方法，包括：提高植物中BjuA036398蛋白的表达量和/或活性；所述BjuA036398蛋白具有如下任一种氨基酸序列：(1)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；(2)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；(3)与(1)-(2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

进一步，所述植物为双子叶植物或单子叶植物，优选为茎瘤芥、拟南芥、白菜、萝卜或油菜。

进一步，所述方法具体包括以下步骤：将制备的或提供的含有所述的编码BjuA036398蛋白的核酸分子的表达载体转化农杆菌，得到农杆菌工程菌，再将所述农杆菌工程菌浸染植物，使BjuA036398基因过表达，即得到侧根数目增加的转基因植物。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明首次利用转基因技术调控BjuA036398的cDNA序列在拟南芥中过量表达，相比于野生型植株，获得了侧根数目明显增加的转基因模式植物，表明茎瘤芥BjuA036398基因具有调控草本植物侧根发育的重要生物学功能。通过提高BjuA036398基因的表达量，能增加植物侧根数目，提高植物从土壤中吸收养分的能力。BjuA036398基因新功能的发现为植物侧根发育调控提供了新的基因靶点和资源，茎瘤芥BjuA036398基因可广泛应用于植物遗传育种、种质资源改良和培育，对改进和改良茎瘤芥等作物的种质资源具有重要作用。

附图说明

图1为茎瘤芥BjuA036398基因扩增过程的电泳图；A为茎瘤芥中提取的总RNA，B为BjuA036398基因扩增，C为BjuA036398连接Blunt-T载体并转化大肠杆菌后菌落PCR。

图2为构建表达载体的图谱示意图；A为构建重组表达载体BjuA036398-pTFGFP图谱示意图，B为pTFGFP载体图谱示意图。

图3为构建BjuA036398-pTFGFP表达载体过程的电泳图；A为BjuA036398-Blunt-T载体的酶切产物，B为BjuA036398连接pTFGFP载体并转化大肠杆菌后菌落PCR，C为BjuA036398-pTFGFP载体酶切产物。

图4为茎瘤芥BjuA036398转录因子的亚细胞定位分析；从左到右依次分别为激发光下暗场图、白光下明场图和组合图。

图5为在含有除草剂的培养基上筛选出的转基因拟南芥幼苗。

图6为茎瘤芥BjuA036398基因在过表达转基因株系中的半定量表达分析图；M为Marker，Col-0为野生型拟南芥植株，BjuA036398-OE-1和BjuA036398-OE-3分别是转基因拟南芥株系。

图7为过表达BjuA036398的转基因拟南芥植株表型图；A为侧根数目表型；B为侧根数目统计分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。实施例中所述原料如无特殊说明，即为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。

实施例1克隆茎瘤芥BjuA036398基因序列

取现茎瘤芥叶片组织为材料，采用TRIzol

取约2.0μg茎瘤芥总RNA，按照PrimeScript II first-strand cDNA synthesiskit(6210A,Takara)说明书步骤合成第一链cDNA。

PCR扩增体系：2Taq DNA聚合酶0.25μL，10x2Taq Buffer 2.5μL，正向引物(BjuTIR1B-F,10μM)0.5μL，反向引物(BjuTIR1B-R,10μM)0.5μL，模板(DNA)1μL，dNTP(2.5mM)2μL，无菌ddH

正向引物和反向引物的序列如下所示：

BjuTIR1B-F：CCCCCGGGATGTATAAGCGAGTGGCCTTATC

BjuTIR1B-R：CGGGATCCTAACCCGTTAGTAGTAATGATTTGC

PCR反应程序为：预变性95℃，5min；95℃，30s；60℃，40s；72℃，2min，38个循环；72℃，10min。

获得PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，如图1B所示，在紫外光照射下，在2kb左右可以观察到一条特异性的扩增条带。按照胶回收试剂盒(9672，Takara)纯化后备用。

利用平末端加A试剂将纯化的DNA片段加A，通过TA克隆将其与pEASY-BluntSimple Cloning Kit(Blunt-T)(全式金公司)相连，连接产物转化大肠杆菌DH5a，并将转化后培养40分钟的菌液涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，并在37℃培养箱中倒置培养16小时以筛选具有抗性的单菌落(图1C)，从含有氨苄霉素(100mg/L)的LB培养板上挑取2-3个阳性克隆测序进行测序分析，结果表明，茎瘤芥BjuA036398基因CDS序列如SEQ ID NO.1所示，含有1785bp的开放阅读框(含终止密码)。

实施例2重组表达载体BjuA036398-pTFGFP构建及亚细胞定位分析

(1)构建BjuA036398-pTFGFP表达载体

提取实施例1中含有BjuA036398基因片段的BjuA036398-Blunt-T载体质粒和目的载体pTFGFP质粒(图2B)，使用Thermo公司的限制性内切酶Sma I和BamH I分别对这两个质粒进行双酶切。

酶切体系为：vector 5μL；Sma I 0.5μL；BamHI 0.5μL；Buffer 2μL；无菌ddH

酶切结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测并回收酶切后的BjuA036398基因片段(图3A)，用T4DNA连接酶将酶切后的BjuA036398基因片段连接酶切后的pTFGFP载体。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并将转化后培养40分钟的菌液涂布在含有100μg/mL壮观霉素的LB固体培养基上，并在37℃培养箱中倒置培养16小时以筛选具有抗性的单菌落，以培养基上长出的单菌落为模板对单菌落中的BjuA036398基因进行菌落PCR扩增。

PCR反应体系：2Taq DNA聚合酶0.5μL，10x2Taq Buffer 5μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，dNTP(2.5mM)4μL，无菌ddH

PCR反应条件：预变性95℃，5min；95℃，30s；60℃，40s；72℃，2min，38个循环；72℃,7min。

通过1％琼脂糖凝胶电泳检测含有BjuA036398基因片段的阳性克隆(图3B)。使用100μg/mL壮观霉素的LB液体培养基对PCR扩增呈阳性的单菌落进行扩增培养并提取质粒，使用限制性内切酶Sma I和BamH I对提取的质粒进行双酶切以鉴定载体是否构建成功。采用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测，能够酶切下目的片段的载体即为构建成功的BjuA036398-pTFGFP表达载体(图3C)。重组表达载体中报告基因GFP与目的基因BjuA036398的5’端融合后，位于组成型启动子P35S下游，形成融合表达；BjuA036398的3’端组装有NOS终止子，可以有效终止融合基因的转录。报告基因GFP经过蓝光激发，无需辅助因子和底物就能发出绿色荧光，作为报告基因可以检测目的基因表达情况(图2A)。

(2)茎瘤芥BjuA036398的亚细胞定位分析

1)农杆菌介导的烟草瞬时转化

通过常规冻融法将构建的重组表达载体BjuA036398-pTFGFP转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101中，通过PCR筛选阳性克隆。按照霍琳等(农杆菌介导的烟草瞬时表达试验条件优化,分子植物育种,2016,14(1):80-85)方法制备根癌农杆菌注射缓冲液。选择光照培养箱中正常生长具有8-10片叶子完全展开的烟草进行注射，用去除针头的注射器将注射缓冲液缓慢推入叶片背面。然后，把转化后的植株重新放回培养箱中，培养36h-48h后进行观察。

2)GFP报告基因在烟草表皮细胞中的表达与观察

用剪刀小心剪下转化后的烟草叶片放在载玻片上，加1滴蒸馏水，制成装片；然后放在荧光显微镜上，在激发光波长488-507nm的蓝光下，进行荧光观察。结果如图4所示，仅烟草叶片细胞核中可以检测到绿色荧光信号表达，说明茎瘤芥BjuA036398蛋白已成功在烟草中表达并在细胞核中发挥功能，是1个核定位的转录因子蛋白。

实施例3拟南芥遗传转化

采用蘸花转化法将含有BjuA036398-pTFGFP载体的GV3101农杆菌侵染拟南芥花顶端分生组织。将BjuA036398导入到拟南芥基因组中并使其表达。利用pTFGFP载体上的抗除草剂基因(BAR)对转基因操作后的拟南芥种子进行阳性株系的筛选。将转基因后收取的种子放入硅胶中干燥2周使其休眠，取休眠后的种子经5％次氯酸钠消毒后播种于含有basta的0.8％的MS固体培养上(每100mL培养基加入5μL 10％的basta)，光下培养1周后选择存活的阳性转基因幼苗移入装有蛭石和营养土(3：1)的花盆中放在光照培养室中继续培养(图5)。单株收获不同株系转基因拟南芥植株种子，继续种植并使其自交，直至筛选出纯合的转基因拟南芥植株。通过纯合转基因拟南芥株系的筛选，得到2个纯合株系，分别为BjuA036398-OE-1和BjuA036398-OE-3。

进一步，通过半定量RT-PCR鉴定得到表现型良好的过表达BjuA036398的转基因株系BjuA036398-OE-1和BjuA036398-OE-3，采用Trizol试剂(Invitrogen

检测AtACTIN8基因引物为：

RT-AtACTIN8-F:TCAGCACTTTCCAGCAGATG

RT-AtACTIN8-R:ATGCCTGGACCTGCTTCAT

检测BjuA036398-F目的基因引物为：

RT-BjuA036398-F：TGTATAAGCGAGTGGCCTTA

RT-BjuA036398-R：ACTTGCAGACAAGGGACACA

结果如图6所示，在2个代表转基因株系(BjuA036398-OE-1和BjuA036398-OE-3)中目的基因BjuA036398均上调表达，并且BjuA036398-OE-3表达水平为最高，而在野生型植株(Col-0)中检测不到BjuA036398的表达，表明BjuA036398已经导入拟南芥基因组并成功转录超表达。

实施例4转基因拟南芥的表型观察与分析

将拟南芥野生型植株种子与2个BjuA036398基因超表达植株BjuA036398-OE-1和BjuA036398-OE-3种子同时播种于MS培养基中，待1周后将种子萌发并生长至4叶期的幼苗贴苗至新的含有0.03μM的MS固体培养基的方形培养皿中光下竖直培养1周，对不同植株侧根数目进行观察及统计发现，结果如图7所示。结果显示，与野生型拟南芥植株相比，转基因植株BjuA036398-OE-1和BjuA036398-OE-3的侧根数目显著增加，表明BjuA036398基因的表达可增加植物侧根数目，是一个培育发达根系优质作物品种的优质候选基因。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 长江师范学院；

<120> 一种茎瘤芥BjuA036398基因在调控植物侧根发育中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1785

<212> DNA

<213> 茎瘤芥(Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee)

<400> 1

atgtataagc gagtggcctt atcgttcccc gaggaagtcc tcgagcacgt gttctccttc 60

atccacgtgg acaaggacag gaactctgtg tcccttgtct gcaagtcgtg gtacgagatc 120

gagcggtggt gcaggaggag agtcttcatc gggaactgct acgccgtgag ccccgcggcg 180

gtgatacgga ggttccctaa agcgagatcc gtggagctga aggggaagcc gcacttcgcg 240

gacttcaatc tggtgcccga ggggtgggga gggtacgtgt acccgtggat agaggcgatg 300

tcggcgtcgt acacgtggct ggaggagata aggctgaaga ggatggtggt gagcgacgag 360

tgcttggagc ttatagccaa gtcgtttaag aattttaaag tgctcgtgct ttcctcgtgc 420

gatggattct ccacggatgg gctcgctgct atcgcttcga gctgcaggaa tctgaaagag 480

cttgatttgc gtgagagtga tgttgacgac gttagcggac actggcttag ccatttccct 540

gatacgtaca cttctttggt ttcgctcaat atctcatgct tagtctccga ggtcagtttc 600

tctgctctgg agcggctggt gtgtaggtct cccaacctca aatcactgaa gcttaaccga 660

gctgttcctc ttgagaagtt ggctgcttta cttcaaagag cgcctcagct ggaggaattt 720

ggcaccggtg tgtacagtgc tgaagtgcgt ccggatgtgc tctctggttt gtctgtagct 780

atctctgggt gcaagaaatt gaagtggtta tctgggtttt gggatgctct tcctgcgtat 840

cttcctgcag tttattcggt ttgcagtgga cttacaactt tgaacttgag ttatgcaaca 900

gtccagagct atgatcttgt caagcttctt agtcaatgtc ctaaattgca gcgcctctgg 960

gtgttggact acatcgagga tgatggtctt gaaatgcttg ctttgacctg caaggacctt 1020

cgagagctaa gggtgtttcc gtccgagcct tttgtgatgg agccaaacgt agcgttgaca 1080

gaacaagggc ttgtctccgt ctccgcaggc tgtccaaaac tcgagtcggt tctctacttc 1140

tgccgtcaaa tgaccaatgc tgcgctggta accattgcta ggaaccgtcc caacatgacc 1200

cgcttccgtt tgtgcatcat tgagccgaaa gcccctgacc atctgactct agagccactg 1260

gatgtgggat ttggagccat agtggagcac tgcaaagatc ttcggcgact ctccctgtca 1320

gggctgttga ccgacaaggt cttcgaatac attgggacgt atgcaaagaa gatggagatg 1380

ctgtcagtgg cgtttgcagg agacagtgac ttggggatgc atcatgttct gtcagggtgc 1440

gagagcttga ggaagctaga gataagggac tgcccctttg gagacaaggc gcttttggca 1500

aatgcttcga agctggagac aatgcgatct ctttggatgt cttcgtgttc cgtgagtttt 1560

ggagcctgca agttgttagg acagaagatg ccaaagctca atgtggaagt gatcgatgaa 1620

aggggtccgc ctgactctag acccgagagc tgccctgttg aaagagtgtt catataccga 1680

acagtggctg gtcctcggtt tgacatgcct ggtttcgtct ggaacatgga tcaacaacac 1740

tcagcaatga ggttttccag gcaaatcatt actactaacg ggtta 1785

<210> 2

<211> 595

<212> PRT

<213> 茎瘤芥(Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee)

<400> 2

Met Tyr Lys Arg Val Ala Leu Ser Phe Pro Glu Glu Val Leu Glu His

1 5 10 15

Val Phe Ser Phe Ile His Val Asp Lys Asp Arg Asn Ser Val Ser Leu

20 25 30

Val Cys Lys Ser Trp Tyr Glu Ile Glu Arg Trp Cys Arg Arg Arg Val

35 40 45

Phe Ile Gly Asn Cys Tyr Ala Val Ser Pro Ala Ala Val Ile Arg Arg

50 55 60

Phe Pro Lys Ala Arg Ser Val Glu Leu Lys Gly Lys Pro His Phe Ala

65 70 75 80

Asp Phe Asn Leu Val Pro Glu Gly Trp Gly Gly Tyr Val Tyr Pro Trp

85 90 95

Ile Glu Ala Met Ser Ala Ser Tyr Thr Trp Leu Glu Glu Ile Arg Leu

100 105 110

Lys Arg Met Val Val Ser Asp Glu Cys Leu Glu Leu Ile Ala Lys Ser

115 120 125

Phe Lys Asn Phe Lys Val Leu Val Leu Ser Ser Cys Asp Gly Phe Ser

130 135 140

Thr Asp Gly Leu Ala Ala Ile Ala Ser Ser Cys Arg Asn Leu Lys Glu

145 150 155 160

Leu Asp Leu Arg Glu Ser Asp Val Asp Asp Val Ser Gly His Trp Leu

165 170 175

Ser His Phe Pro Asp Thr Tyr Thr Ser Leu Val Ser Leu Asn Ile Ser

180 185 190

Cys Leu Val Ser Glu Val Ser Phe Ser Ala Leu Glu Arg Leu Val Cys

195 200 205

Arg Ser Pro Asn Leu Lys Ser Leu Lys Leu Asn Arg Ala Val Pro Leu

210 215 220

Glu Lys Leu Ala Ala Leu Leu Gln Arg Ala Pro Gln Leu Glu Glu Phe

225 230 235 240

Gly Thr Gly Val Tyr Ser Ala Glu Val Arg Pro Asp Val Leu Ser Gly

245 250 255

Leu Ser Val Ala Ile Ser Gly Cys Lys Lys Leu Lys Trp Leu Ser Gly

260 265 270

Phe Trp Asp Ala Leu Pro Ala Tyr Leu Pro Ala Val Tyr Ser Val Cys

275 280 285

Ser Gly Leu Thr Thr Leu Asn Leu Ser Tyr Ala Thr Val Gln Ser Tyr

290 295 300

Asp Leu Val Lys Leu Leu Ser Gln Cys Pro Lys Leu Gln Arg Leu Trp

305 310 315 320

Val Leu Asp Tyr Ile Glu Asp Asp Gly Leu Glu Met Leu Ala Leu Thr

325 330 335

Cys Lys Asp Leu Arg Glu Leu Arg Val Phe Pro Ser Glu Pro Phe Val

340 345 350

Met Glu Pro Asn Val Ala Leu Thr Glu Gln Gly Leu Val Ser Val Ser

355 360 365

Ala Gly Cys Pro Lys Leu Glu Ser Val Leu Tyr Phe Cys Arg Gln Met

370 375 380

Thr Asn Ala Ala Leu Val Thr Ile Ala Arg Asn Arg Pro Asn Met Thr

385 390 395 400

Arg Phe Arg Leu Cys Ile Ile Glu Pro Lys Ala Pro Asp His Leu Thr

405 410 415

Leu Glu Pro Leu Asp Val Gly Phe Gly Ala Ile Val Glu His Cys Lys

420 425 430

Asp Leu Arg Arg Leu Ser Leu Ser Gly Leu Leu Thr Asp Lys Val Phe

435 440 445

Glu Tyr Ile Gly Thr Tyr Ala Lys Lys Met Glu Met Leu Ser Val Ala

450 455 460

Phe Ala Gly Asp Ser Asp Leu Gly Met His His Val Leu Ser Gly Cys

465 470 475 480

Glu Ser Leu Arg Lys Leu Glu Ile Arg Asp Cys Pro Phe Gly Asp Lys

485 490 495

Ala Leu Leu Ala Asn Ala Ser Lys Leu Glu Thr Met Arg Ser Leu Trp

500 505 510

Met Ser Ser Cys Ser Val Ser Phe Gly Ala Cys Lys Leu Leu Gly Gln

515 520 525

Lys Met Pro Lys Leu Asn Val Glu Val Ile Asp Glu Arg Gly Pro Pro

530 535 540

Asp Ser Arg Pro Glu Ser Cys Pro Val Glu Arg Val Phe Ile Tyr Arg

545 550 555 560

Thr Val Ala Gly Pro Arg Phe Asp Met Pro Gly Phe Val Trp Asn Met

565 570 575

Asp Gln Gln His Ser Ala Met Arg Phe Ser Arg Gln Ile Ile Thr Thr

580 585 590

Asn Gly Leu

595

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cccccgggat gtataagcga gtggccttat c 31

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

cgggatccta acccgttagt agtaatgatt tgc 33

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tcagcacttt ccagcagatg 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

atgcctggac ctgcttcat 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

tgtataagcg agtggcctta 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

acttgcagac aagggacaca 20