一种组织工程支架的制备方法及其组织工程支架

摘要

本发明公开一种组织工程支架的制备方法及其组织工程支架，包括以下步骤：利用牺牲材料，采用3D打印的方法打印出血管网络通道模型，3D打印过程中采用五轴3D打印设备，打印出料方向始终与血管网络通道的截面保持垂直，打印过程中不设置附加支撑结构；将打印好的所述血管网络通道模型放置在模框中，向所述模框内浇注聚合物溶液，待凝固后形成聚合物凝胶；取出所述聚合物凝胶，消除所述牺牲材料，得到具有血管网络通道的组织工程支架；本发明在3D打印过程中采用五轴3D打印设备，打印出料方向始终与血管网络通道的截面保持垂直，从而可以在打印过程中不设置附加支撑结构，能够提高打印效率，避免材料的浪费，保证打印结构的完整性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物增材制造技术领域，特别是涉及一种组织工程支架的制备方法及其组织工程支架。

背景技术

组织工程领域经过多年的快速发展取得了很多成果，但仍存在一些关键问题尚未解决，如何能制备出接近人体血管尺寸且复杂立体化的血管网络通道是该领域亟待解决的科研难题。众所周知，在天然组织中血管网络通道可以通过向细胞提供适当的氧气和营养物质，同时进行细胞与血管之间的营养物质输送以及清除代谢废物，因此制备出仿生人体血管网络通道的生物支架，实现对组织内细胞的营养供给、气体交换、生长因子和蛋白质的传递，将对维持组织功能有着极其重要的意义。

通常当组织厚度超过100μm时，氧气和营养物质很难扩散到组织的每个角落，因此，构建血管网络通道对组织工程中大块组织至关重要。目前，组织工程领域主要利用各类水凝胶材料灌注至具有凹槽或者微通道结构的可灌注体。然而，这些方法通常局限于制备二维平面结构的网络通道，难以实现空间立体的复杂结构血管网络通道制备。

目前，构建血管网络通道的方法主要有生物3D打印方法、层层组装方法和牺牲材料方法三种。其中，生物3D打印方法主要采用化学交联的方式构建中空的微血管结构，但这种方法通常只能构建单一的血管，无法构建立体的分叉血管网络；层层组装方法是按照所构建的具有内部血管通道的组织模型通过薄层叠加的形式制备，可以实现内部通道的互联及三维通道结构成形，但是层与层之间的结合强度差，力学性能不足；牺牲材料的方法是利用有温度或者其他可逆响应的牺牲材料作为血管网络通道的预填充物，通常需要先采用3D打印工艺成形血管化网络通道模型，然后采用浇注的方式，利用牺牲材料本身的特性将其去除，从而形成带有血管网络通道的组织支架，但是若采用传统的三轴3D打印方式会不可避免地产生支撑，不仅造成材料浪费、效率降低，还会在剥离支撑的过程中导致对模型的破坏。

在已公开的专利文献中，也有关于3D打印及3D打印生物材料的方案，例如，申请公布号为CN 106113512A的中国专利公开了一种五轴联动3D打印平台，包括平台机架等，平台机架的左侧设有第一导杆固定座和第二导杆固定座，第二导杆固定座位于第一导杆固定座的后方，第一Y轴导杆、第二Y轴导杆分别通过第一导杆固定座、第二导杆固定座固定且第一Y轴导杆与第二Y轴导杆平行，Y轴电机位于第一Y轴导杆和第二Y轴导杆之间且靠近平台支架的左侧，Y轴电机上设有Y轴皮带，支撑板位于第一Y轴导杆和第二Y轴导杆的上方，平台外壳位于支撑板的上方，该方案增加了3D打印机的打印灵活性，可以加工表面复杂的模型，能够使打印体做回转运动，但是，该方案中并没有给出如何打印三维立体网络结构的任何记载，也就是说，在该方案的基础上得不到血管化网络通道模型的具体方案。

申请公布号为CN 106963979 A的中国专利公开了一种多级结构仿生血管网络组织工程支架的制备方法，包括利用CAD软件构建立方体网状结构的模型，然后在3D打印机的加热腔内加满蔗糖粉末，通过3D打印得到糖模板；配制聚合物材料溶液，糖模板浸没在聚合物材料溶液中，浸渍后取出，干燥，得到含有聚合物涂层的糖模板；然后将含有聚合物涂层的糖模板通过相分离除去蔗糖，冷冻干燥，本方案能够制备组织工程支架，但是并没有给出具体的如何利用3D打印机打印立方体网状结构的模型，那么可以断定的是该方案采用的是现有技术中的3D打印方法，那么不可避免地会产生支撑，不仅造成材料浪费、效率降低，还会在剥离支撑的过程中导致对模型的破坏。

发明内容

本发明的目的是提供一种组织工程支架的制备方法及其组织工程支架，以解决上述现有技术存在的问题，在3D打印过程中采用五轴3D打印设备，打印出料方向始终与血管网络通道的截面保持垂直，从而可以在打印过程中不设置附加支撑结构，能够提高打印效率，避免材料的浪费，保证打印结构的完整性。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

利用牺牲材料，采用3D打印的方法打印出血管网络通道模型，3D打印过程中采用五轴3D打印设备，打印出料方向始终与血管网络通道的截面保持垂直，打印过程中不设置附加支撑结构；

将打印好的所述血管网络通道模型放置在模框中，向所述模框内浇注聚合物溶液，待凝固后形成聚合物凝胶；

取出所述聚合物凝胶，消除所述牺牲材料，得到具有血管网络通道的组织工程支架。

优选地，所述五轴3D打印设备具有X轴、Y轴、Z轴三个移动自由度以及绕X轴旋转的A轴和绕Z轴旋转的C轴两个自由度，当打印到悬空的位置时，转动A轴和C轴，使得打印出料方向始终与血管网络通道的截面保持垂直。

优选地，所述牺牲材料为蔗糖，纯度为99.99％。

优选地，将所述蔗糖放入180℃的马费炉中，15-20分钟后，得到琥珀色的焦糖，将所述焦糖冷却固化，得到固态的焦糖牺牲材料。

优选地，将质量比为70：30的左旋聚乳酸和聚已内酯在60℃的四氢呋喃下溶解，并磁力搅拌1-2小时，得到混合均匀的质量浓度为10％的所述聚合物溶液。

优选地，打印过程中，采用带螺杆机构的打印头将熔融态的蔗糖送至喷嘴处挤出。

优选地，打印头温度为130-140℃，喷嘴内径200μm，打印平台温度为0-5℃。

优选地，向所述模框内浇注聚合物溶液后，将整体放置于低于0℃的环境中4小时以上，形成所述聚合物凝胶。

优选地，将所述聚合物凝胶从所述模框中取出，再将其浸入0℃的冰水混合物中2-3天，直到完全消除蔗糖以及残留的溶剂，最后去除水，冷冻干燥，得到含血管网络通道的组织工程支架。

本发明还提供一种组织工程支架，应用前文记载的所述的制备方法制得，包括由聚合物溶液凝固形成的聚合物凝胶以及设置在所述聚合物凝胶内的血管网络通道。

本发明相对于现有技术取得了以下技术效果：

(1)本发明在3D打印过程中采用五轴3D打印设备，打印出料方向始终与血管网络通道的截面保持垂直，从而可以在打印过程中不设置附加支撑结构，能够提高打印效率，避免材料的浪费，保证打印结构的完整性；

(2)本发明采用牺牲材料打印制作血管网络通道模型，进行浇注后，去除牺牲材料得到组织工程支架的方式，避免了直接打印血管网络通道所导致的层与层之间结合强度差，力学性能不足的问题，提高血管网络通道的整体完整性；

(3)本发明利用蔗糖作为牺牲材料，蔗糖可以在0℃的环境中融化消除，因此，能够利用蔗糖的这一特性，将聚合物凝胶放置在0℃的环境中去除利用蔗糖打印的血管网络通道模型，能够避免高温对于聚合物凝胶的破坏，保证其完整性，提高成型精度；

(4)本发明利用带螺杆机构的打印头将熔融态的蔗糖送至喷嘴处挤出，能够克服蔗糖粘度较高不容易挤出的困难，顺利的将蔗糖打印成型，并利用蔗糖粘度较高的特点，保证打印成型的血管网络通道模型各打印层之间的结合强度，进而保证成品血管网络通道模型的结构强度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明血管网络通道模型的结构示意图；

图2为本发明五轴3D打印设备的结构示意图；

图3为本发明利用五轴3D打印设备的打印过程示意图；

图4为本发明的工艺流程图；

其中，1、Z轴驱动单元；2、X轴驱动单元；3、Y轴驱动单元；4、A轴驱动单元；5、C轴驱动单元；6、打印头；7、打印平台；10、血管网络通道模型。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的目的是提供一种组织工程支架的制备方法及其组织工程支架，以解决现有技术存在的问题，在3D打印过程中采用五轴3D打印设备，打印出料方向始终与血管网络通道的截面保持垂直，从而可以在打印过程中不设置附加支撑结构，能够提高打印效率，避免材料的浪费，保证打印结构的完整性。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

如图4所示，本发明提供一种组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

利用牺牲材料，采用3D打印的方法打印出血管网络通道模型10，其中，牺牲材料可以采用现有技术所制备的牺牲材料，所谓的牺牲材料指的是能够在成型后保持形状，在一定条件下又可以消除的材料，因此，可以利用牺牲材料的这一特性，使其作为浇注材料的模芯，浇注完成后再消除模芯，能够形成复杂网状的内部结构。血管网络通道模型10如图1所示，具有三维空间结构的枝杈，如果采用现有的3D打印技术，不可避免的需要添加辅助支撑结构以避免打印过程中的枝杈变形的问题。在本发明方案的3D打印过程中采用五轴3D打印设备，五轴3D打印设备具有除了X轴、Y轴、Z轴外的A轴和C轴，能够利用A轴和C轴的转动解决支撑结构的问题，具体的，此处所说的五轴3D打印设备可以参考图2所示，包括Z轴驱动单元1、X轴驱动单元2、Y轴驱动单元3、A轴驱动单元4和C轴驱动单元5，各驱动单元中的Z轴驱动单元1、X轴驱动单元2、Y轴驱动单元3可以包括驱动电机连接滚珠丝杠的结构来实现，A轴驱动单元4和C轴驱动单元5则可以直接连接电机的旋转轴实现转动；另外，Z轴驱动单元1包括打印头6，打印头6能够将被打印的物料挤出并随着打印头6的移动挤出到指定的位置，实现3D打印的目的，C轴驱动单元5包括有打印平台7，用于固定待打印的物品；如图3所示，为了避免支撑结构的设置，可以将打印头6的打印出料方向始终与被打印的血管网络通道模型10的血管网络通道(实际被打印成型的血管网络通道模型10为实心结构)的截面保持垂直，在调整过程中，可以利用C轴驱动单元5和A轴驱动单元4相互配合实现，从而可以在打印过程中不设置附加的支撑结构，能够提高打印效率，避免材料的浪费，保证打印结构的完整性。

关于血管网络通道虚拟模型的构建及其打印路径的规划，首先构建立体多级分叉复杂血管网络通道虚拟模型，将其导出为STL文件；编写python脚本中的程序，读取STL文件中的三角形切片，将其保存在计算机的缓存中；运用K-means聚类算法，将模型聚类成不同的区域；运用广度优先搜索算法生成序列，以此确定各个分支的打印顺序；将各个分支部分分别进行切片，得到每一部分的打印路径，再通过坐标变换，按照打印顺序将各部分打印路径进行整合，最终获得打印所需的G代码。

将打印好的血管网络通道模型10放置在模框中，其中，模框指的是容纳血管网络通道模型10及浇注的聚合物溶液的容器，可以为普通的圆柱型或长方体型等类型的结构；向模框内浇注聚合物溶液，待聚合物溶液凝固后形成聚合物凝胶。

取出聚合物凝胶，在取出时，可以将模框倒置，使得聚合物凝胶与模框分离，模框可以选用金属材料、玻璃材料或塑料材料等，优选玻璃材料，玻璃材料不会与聚合物凝胶粘连，从而能够便于聚合物凝胶脱离。取出聚合物凝胶后，再将脱离模框的聚合物凝胶(包含有血管网络通道模型10)消除牺牲材料，也就是消除聚合物凝胶中的血管网络通道模型10，从而得到具有血管网络通道的组织工程支架。在消除牺牲材料时，根据不同牺牲材料的可逆变化的特性选择相应的消除手段。

如图2所示，五轴3D打印设备具有X轴、Y轴、Z轴三个移动自由度以及绕X轴旋转的A轴和绕Z轴旋转的C轴两个自由度，当打印到枝杈悬空的位置时，转动A轴和C轴，可以使得打印出料方向始终与血管网络通道的截面保持垂直(如图3所示)，从而能够利用血管网络通道模型10的自身结构实现支撑，从而也就可以不再设置支撑结构，避免了设置支撑结构所造成的材料浪费、打印效率不高以及去除支撑结构时可能对血管网络通道模型10造成损坏等问题。

牺牲材料可以选用蔗糖，纯度为99.99％。

在利用蔗糖制备牺牲材料时，将蔗糖放入180℃的马费炉中，15-20分钟后，得到琥珀色的焦糖，再将焦糖冷却固化，得到固态的焦糖牺牲材料，然后将其破碎成小块颗粒，放入冰箱冷藏，冷藏的环境温度可以选择0℃。

在制备聚合物溶液时，将质量比为70：30的左旋聚乳酸和聚已内酯在60℃的四氢呋喃下溶解，并磁力搅拌1-2小时，得到混合均匀的质量浓度为10％的聚合物溶液。

打印过程中，由于蔗糖的粘度较高，如果直接挤出可能会阻力较大，挤出困难或不能顺利挤出，可以利用带螺杆机构的打印头6将熔融态的蔗糖送至喷嘴处挤出，能够克服蔗糖粘度较高的困难，顺利的将蔗糖打印成型，并利用蔗糖粘度较高的特点，保证打印成型的血管网络通道模型10各打印层之间的结合强度。

在挤出成型过程中，打印头6温度可以设定为130-140℃，选择喷嘴内径大小为200μm，打印平台7温度为0-5℃。

向模框内浇注聚合物溶液后，将凝固后的整体连通模框放置于低于0℃的环境中4小时以上，形成聚合物凝胶。

将聚合物凝胶从模框中取出后，再将其浸入0℃的冰水混合物中2-3天，直到完全消除蔗糖以及残留的溶剂，最后去除水，冷冻干燥，得到含血管网络通道的组织工程支架。

参考图4所示，本发明提供一具体的实施例如下：

a.制备牺牲材料

将60g的蔗糖(纯度≥99.99％)倒入金属模具中，将金属模具放入马费炉中，设定温度为180℃，18分钟后得到琥珀色焦糖；再用镊子将金属模具从马费炉中取出后置于5℃的环境中冷却，得到固态的焦糖；最后将其破碎成小块颗粒，放入冰箱中冷藏，冷藏温度选择0℃。

b.制备血管网络通道模型10

将放入0℃冷藏环境的冰箱中的牺牲材料取出，置于五轴3D打印设备的料斗中，当打印头6加热至135℃时牺牲材料融化，通过打印头6的螺杆机构旋转将其带至喷嘴处匀速挤出，沉积在打印平台7上，设定打印平台7的温度为0℃，采用的喷嘴直径为200μm，环境温度为18℃；根据路径规划所获得的G代码，驱动五轴3D打印设备运行，制备出带有分叉结构的血管网络通道模型10，并将其置于模框中备用。

c.配置聚合物溶液

将125ml四氢呋喃加热至60℃；称量8.75g左旋聚乳酸和3.75g聚已内酯，将其倒入四氢呋喃中溶解，并磁力搅拌2小时，得到混合均质的浓度为10％(w/v)的聚合物溶液。

d.制备聚合物凝胶

立即将步骤c配置好的聚合物溶液浇注到已放入血管网络通道模型10的模框中，再将其快速放置于-80℃的冰箱中4小时，形成聚合物凝胶。

e.制备组织工程支架

将步骤d获得的聚合物凝胶从-80℃的冰箱中取出，再将其浸入冰水混合物中3天，其中每隔24h换3次0℃的冰水混合物，3天后蔗糖以及残留的溶剂被完全去除，最后，去除水并冷冻干燥2天，得到含立体多级分叉复杂血管网络通道的组织工程支架。

需要说明的是，其中步骤c在配置聚合物溶液时，可以选择在步骤b制备血管网络通道模型10之前进行，也可以在之后进行，或同步进行，并不影响整个方案的实施。

本发明还提供一种组织工程支架，可以应用前文记载的制备方法制得，该组织工程支架包括由聚合物溶液凝固形成的聚合物凝胶以及设置在聚合物凝胶内的血管网络通道，其中血管网络通道是由血管网络通道模型10经消除后所形成的，血管网络通道模型10采用牺牲材料打印成型，并且在打印过程中采用了五轴3D打印设备进行；五轴3D打印设备的利用能够保证血管网络通道模型10的精确度，同时避免了采用支撑结构的形式，因此，不需要在打印完成血管网络通道模型10后再去除支撑结构，这样也就不会对血管网络通道模型10造成破坏，在浇注成型为聚合物凝胶后，能够保证最终形成的血管网络通道达到设计要求。

本发明中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。