一种调控番茄可溶性固形物含量的基因及应用

摘要

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种调控番茄可溶性固形物含量的基因及应用。本发明通过对500份番茄核心种质成熟果实进行可溶性固形物分析，鉴定了一批SSC含量显著差异的番茄材料，丰富了番茄品质种质资源库。GWAS结合BSA能更加有效的鉴定数量性状的遗传调控位点。因此，本发明克服现有材料和技术的缺点，通过对SSC变异丰富的自然群体进行GWAS分析与BSA分析，鉴定了SSC的主效调控基因SlSTP1。通过对SlSTP1基因的变异研究不仅有助于选择对可溶性固形物积累更高效的天然变异，还可以进一步认识植物可溶性固形物合成代谢的进化规律和调控机制，对研究高品质番茄选育和番茄的栽培环境改良具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种调控番茄可溶性固形物含量的基因及应用。

背景技术

番茄可溶性固形物主要由可溶性糖和有机酸等营养物质组成。番茄可溶性固形物是衡量番茄果实品质和产量的重要指标，可溶性固形物的高低直接影响番茄的风味品质，对于加工番茄而言，可溶性固形物每增加1％，就相当于总产量增加25％。同时可溶性固形物对于植物抗逆具有重要作用。番茄是自花授粉作物，经过长期选择驯化，番茄栽培种群的遗传背景变得越来越狭窄，利用现有的遗传育种资源和常规的育种手段很难在可溶性固形物性状研究上取得很大的进展。随着分子生物学和测序技术的飞快发展，对性状的获取已经由表型上升至基因型，利用与目标性状基因紧密连锁的分子标记对个体进行筛选，有助于快速提高对番茄可溶性固形物性状选择的育种效率，节约育种成本，提升番茄产业的经济效益。

STP家族具有庞大的数量，真正详细研究功能的基因则很少。植物STP转运蛋白家族在植物的生长发育、抗逆性和信号转导等方面发挥着重要作用。但STP转运蛋在参与可溶性固形物含量方面中还鲜有报道。

番茄是日常生活中一种重要的蔬果，可溶性固形物是衡量番茄营养品质的重要指标之一。同时在科学研究上作为研究果实的一种模式植物，与其它果实植物相比，它的基因组较小，生长周期较短，且具有成熟的遗传转化体系，因此番茄具有极高的实际应用价值及理论研究意义。随着生活水平的提高，人们对园艺作物的选育不光追求产量，也更加注重品质。目前，番茄品质的研究多集中在外观品质上，在分子水平上对番茄风味品质可溶性固形物的研究相对较少。

综上所述，现有技术存在的问题是：相对于拟南芥等模式植物而言，目前对园艺作物中可溶性固形物(SSC)的调控机制的认识和研究较少，主要原因在于目前园艺作物例如番茄中并没有系统的基因突变体库，SSC相关突变体的发掘和鉴定没有拟南芥等模式植物成熟。因此，材料的匮乏限制了园艺作物SSC相关功能基因的挖掘。在调控植物SSC含量方面中还鲜有报道。SSC作为一个初级代谢性状，属于微效多基因调控的复杂性状，对QTL精细定位存在一定的难度。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种调控番茄可溶性固形物含量的基因及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种调控番茄可溶性固形物含量的基因，其特征在于：所述基因为SlSTP1基因，其gDNA序列见SEQ ID NO.1所示；cDNA序列见SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述SlSTP1基因编码的蛋白质的编码区氨基酸序列见SEQ ID NO.3所示。

如上述的调控番茄可溶性固形物含量的基因在调控番茄可溶性固形物含量中的应用。

进一步地，所述调控的调控方法包括在番茄植株中超量表达SlSTP1基因来增加可溶性固形物含量。

如上述的调控番茄可溶性固形物含量的基因在调控番茄葡萄糖含量中的应用。

进一步地，所述调控的调控方法包括在番茄植株中超量表达SlSTP1基因来增加葡萄糖含量。

如上述的调控番茄可溶性固形物含量的基因在调控番茄果糖含量中的应用。

进一步地，所述调控的调控方法包括在番茄植株中超量表达SlSTP1基因来增加果糖含量。

本发明还提供了一种调控番茄果实可溶性固形物含量的SlSTP1基因表达相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列为TCCACTCCAGTCTCTAAATTT；所述分子标记位于SlSTP1高可溶性固形物单倍型结构ATG上游1055bp处。

本发明还提供了如上述的分子标记在检测或调控番茄SlSTP1基因表达中的应用。

本发明通过对500份番茄核心种质成熟果实进行可溶性固形物分析，鉴定了一批SSC含量显著差异的番茄材料，丰富了番茄品质种质资源库。GWAS结合BSA能更加有效的鉴定数量性状的遗传调控位点。因此，本发明克服现有材料和技术的缺点，通过对SSC变异丰富的自然群体进行GWAS分析与BSA分析，鉴定了SSC的主效调控基因SlSTP1。通过对SlSTP1基因的变异研究不仅有助于选择对可溶性固形物积累更高效的天然变异，还可以进一步认识植物可溶性固形物合成代谢的进化规律和调控机制，对于研究高品质番茄选育和番茄的栽培环境改良具有重要的意义。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

①本发明揭示了番茄自然群体中SSC含量变异丰富，为番茄品质育种提供了材料基础。

②本发明通过GWAS关联分析和BSA连锁分析快速有效的鉴定SSC的关键调控基因SlSTP1。

③根据对自然群体中目的基因SlSTP1的序列进行分析，结合分子生物学技术能有效的鉴定关键基因SlSTP1的功能突变位点。根据自然群体中鉴定的功能突变位点InDel_21能够开发出高效的分析标记辅助番茄品质育种。

④SlSTP1基因的鉴定丰富和完善了已有的SSC合成及调控网络，揭示了番茄在进化过程中SSC变化的分子机制。

附图说明

图1是自然群体种质资源番茄果实中可溶性固形物含量及频率分布图；其中，A：500份番茄自然群体核心种质资源可溶性固形物含量图；B：500份番茄自然群体核心种质资源可溶性固形物频率分布图；

图2是番茄可溶性固形物全基因组关联分析；A：可溶性固形物GWAS的曼哈顿图，水平线指示显著性差异阈值为-log

图3是TS23×M82 BSA群体两亲本、F

图4是TS23×M82 F

图5是SlSTP1启动子区的结构变异示意图；A：SlSTP1启动子测序结果。方框表示SURE元件；B：SlSTP1高可溶性固形物单倍型结构图。ATG上游1055bp处有21bp的插入；

图6是SlSTP1不同单倍型结构及进化分析；A：SlSTP1的6种单倍型。根据15个SNP对重测序材料进行基因分型，一共分为6种。图中橙色模块代表启动子和UTR区域，灰色细长模块代表内含子区域，绿色方框代表外显子区域；B：SlSTP1的6种单倍型对可溶性固形物含量的影响；C：可溶性固形物含量在PIM、CER、BIG等不同类型番茄中的分布，PIM表示醋栗番茄，CER表示樱桃番茄，BIG表示大果番茄；D：SlSTP1不同单倍型在PIM、CER、BIG等不同类型番茄中的分布，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ代表SlSTP1的6种单倍型；

图7是SlSTP1在可溶性固形物极端材料中的表达量；A：可溶性固形物极端材料SlSTP1相对表达量和可溶性固形物含量，黑色柱子表示高可溶性固形物极端材料，灰色柱子表示低可溶性固形物极端材料，红色折线表示可溶性含量(％)；B：可溶性固形物极端材料的SSC含量；C：可溶性固形物极端材料中SlSTP1的表达量；

图8是SlSTP1在番茄不同组织中的表达模式；SlSTP1在高可溶性固形物材料TS265和低可溶性固形物材料A57不同组织中的基因表达。Root：根，Stem：茎，Leaf：叶，Flower：花，Immature Green Fruit：未成熟果实，Mature Green Fruit：绿熟期果实，BreakerFruit：破色期果实，Red Ripe Fruit：红熟期果实；

图9是SSC高、低基因型中SlSTP1启动子驱动GUS活性；A：高SSC和低SSC的SlSTP1启动子结构图，SlSTP1Pro

图10是SlSTP1转基因功能验证；A：SlSTP1超量表达转基因植株与对照A57可溶性固形物含量；B：SlSTP1超量转基因植株与对照A57葡萄糖和果糖含量；C：SlSTP1 CRISPR/Cas9敲除植株与对照TS23可溶性固形物含量；D：SlSTP1 CRISPR/Cas9敲除植株与对照TS23葡萄糖和果糖含量。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明披露了一种调控番茄可溶性固形物含量的基因及应用，具体如下各实施例所示。

实施例1 SlSTP1基因的定位

本发明利用500份全球范围收集的番茄核心种质及高可溶性固形物材料TS-23与低可溶性固形物材料M82构建一个F2分离群体，采用GWAS结合BSA技术，从番茄中克隆获得了SlSTP1基因。该基因是一个调控番茄果实可溶性固形物积累的重要基因，其基因启动子中的一个关键的插入/缺失(片段命名为indel_21)片段是导致自然群体中可溶性固形物差异的主要原因。通过在番茄中超量表达SlSTP1能够提高番茄果实中葡萄糖和果糖的含量。并且本发明中的InDel_21可作为高可溶性固形物品种的分子标记。

本发明本实施例通过对500份番茄自然群体核心种质资源调查发现，可溶性固形物含量最高的为9.14，最低的为2.5，番茄自然群体的可溶性固形物含量的变异程度较大，相差三倍以上。野生番茄，尤其是醋栗番茄中可溶性固形物含量偏高，栽培番茄可溶性固形物含量偏低。自然群体可溶性固形物含量频率主要分布在中亲值附近，且呈现连续性分布，符合正态分布。这些结果表明可溶性固形物是典型的数量性状，且是有微效多基因控制(图1)。

本发明使用Lin等(2014)开发的5.5M高质量SNP(MAF>0.05)在500个番茄品种中对果实可溶性固形物进行关联分析。GWAS使用的是TASSEL 4.052软件中的压缩混合线性模型(cMLM)。GWAS中SNP的P-value阈值设为1.8×10

在本申请中，发明人以S.lycopersicum var.cerasiforme番茄TS23为母本，以低可溶性固形物材料M82为父本进行杂交，得到F

ΔSNP index出现一个显著的峰值说明了这个位点存在一个主效QTL调控番茄果实中可溶性固形物的积累。本发明对TS-23×M82群体的连锁作图进一步证实申请人通过GWAS得到的结果表明，在第2染色体上存在调控果实可溶性固形物含量自然变化的候选基因SlSTP1(图4)。

所述调控番茄果实可溶性固形物含量的SlSTP1基因gDNA序列见SEQ ID NO.1所示；cDNA序列见SEQ ID NO.2所示；SlSTP1基因编码的蛋白质的编码区氨基酸序列见SEQ IDNO.3所示。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述调控番茄果实可溶性固形物含量的SlSTP1基因插入/缺失获得的分子标记(图5)，SlSTP1高可溶性固形物单倍型结构ATG上游1055bp处有21bp的插入，所述分子标记的多态性位点为indel_21，核苷酸序列为：TCCACTCCAGTCTCTAAATTT，见SEQ ID NO.4所示。

实施例2目标基因相关性能验证

根据500份番茄种质资源SNP及InDel差异，将STP1分为6种单倍型。在单倍型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中主要为醋栗番茄，大多为高可溶性固形物材料；Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、中主要为樱桃番茄和大果番茄，大多为低可溶性固形物材料。从醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium)到樱桃番茄(Solanum lycopersicum var cerasiforme)再到大果番茄(Solanum lycopersicum)的驯化改良过程中，STP1是从单倍型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ到其他3种单倍型的演变，并伴随着可溶性固形物的减少(图6)。

果实可溶性固形物极端材料STP1表达量：本实施例从500份番茄种质材料中选取了10份可溶性固形物含量极端高材料和9份可溶性固形物含量极端低材料，提取红熟果实总RNA，反转录成cDNA后测定各个材料中SlSTP1的mRNA相对表达水平，qPCR反应体系如下：

内对照基因引物：β-actin-FW：ATGGCAGACGGAGAGGATATTCA见SEQ ID NO.5所示；β-actin-RV：GCCTTTGCAATCCACATCTGCTG见SEQ ID NO.6所示。qPCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性5s，58℃退火15s，72℃延伸20s，40个循环。由LightCycler 480实时定量PCR仪进行分析。SlSTP1的qPCR引物为:SlSTP1-qPCR-FWCATTTGGAGAGGACACGCTCGAGCTGTGATCAGCTCGGAAAAA，见SEQ ID NO.7所示；SlSTP1-qPCR-RVTCTCATTAAAGCAGGACTCTAGACCCAAACTAAAGTCATACAATTTTG见SEQ ID NO.8所示。结果表明SlSTP1在高可溶性固形物材料中的表达普遍高于低可溶性固形物材料中的表达(图7)。在可溶性固形物极端材料中可溶性固形物含量与SlSTP1的表达量相关系数为0.711，因此，番茄可溶性固形物含量与SlSTP1的表达成正相关。

本实施例测定了SlSTP1在番茄各组织的相对表达量。结果表明SlSTP1在番茄的根、茎、叶、花、果实中均能表达，在幼果和根中表达量较高，在茎、叶、花中表达量较低。在果实幼果后的各个发育时期SlSTP1的表达水平降低。在高可溶性固形物材料TS265和低可溶性固形物材料A57中都出现这种表达模式。在番茄果实发育的不同阶段和不同组织中，SlSTP1在高可溶性固形物材料中的表达量普遍高于在低可溶性固形物材料中的表达量(图8)。

本实施例根据启动子中有无21bp的插入将启动子分为SlSTP1 Pro

超量表达载体构建方法：用

将10μL同源重组产物加入25μL大肠杆菌感受态Trans T1，混合体系冰浴30min，42℃水浴锅中反应55S立即冰浴2min，然后加入500μL空白LB，放入37℃摇床复苏1h，均匀涂在100mg/L的Spec固体LB培养基上，37℃恒温箱培养18h，挑取单克隆于100mg/L的Spec液体LB培养基，放入37℃摇床培养8h，经过PCR检测，呈正确条带的菌液送公司测序(由武汉天一辉远生物科技有限公司完成)，通过MultAlin(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)网站将测序结果与参考序列进行比对分析。测序结果正确的菌液在37℃摇床培养，提取质粒，导入农杆菌。

通过农杆菌介导在烟草叶片中瞬时表达，随后烟草叶片在37℃下孵育染色，用70％(V/V)乙醇洗涤，qPCR定量分析GUS表达，发现GUS组织化学染色后显示和烟草瞬时表达分析中，SlSTP1Pro

为探究SlSTP1与可溶性固形物含量的关系，本实施例构建了SlSTP1敲除载体和35S启动子驱动的SlSTP1超表达载体。超量表达载体构建方法如上所述。

敲除载体构建方法如下：本发明中敲除载体为pTX，是一种把番茄U6启动子(Sequence ID:X51447.1)和2×35S zCas9的序列添加到pBin19载体(GenBank accessionnumber:U09365.1)上而得到的CRISPR/Cas9双元载体(Xing et al.,CRISPR/Cas9 toolkitfor multiplex genome editing in plants.2014)。根据CRISPR direct网站(http://crispr.dbcls.jp/)在SlSTP1的第二外显子上设计两个靶点，通过引物SlSTP1-CR-500bp-FW ATAATGCTGAGATAAGATTCTACGC见SEQ ID NO.9所示和SlSTP1-CR-500bp-RVATGCCACCAGAGAAGACACAA见SEQ ID NO.10所示扩增并回收目标片段。将目标片段和酶切过的PTX进行同源重组，来构建TAGL1基因的敲除载体。

遗传转化受体材料中，超量表达载体采用低可溶性固形物A57为受体材料，敲除载体转化采用高可溶性固形物TS23为受体材料。超量表达SlSTP1后，转基因植株果实中可溶性固形物相比于对照A57(TSS＝4.5)显著上升，上升至7.93，上升幅度为76.2％，而敲除后转基因番茄果实中可溶性固形物显著降低，由对照TS23的9.6下降至6.0，下降幅度为37.5％。番茄果实中可溶性固形物主要为葡萄糖和果糖。通过测定表明，超量表达SlSTP1后，转基因果实中葡萄糖含量由对照A57的409g/100gFW上升至1534g/100gFW，比对照增加2.75倍，而果糖含量由对照A57的438g/100gFW上升至1208g/100gFW，比对照增加1.75倍。在敲除转基因番茄果实中，葡萄糖含量由对照TS23的1204g/100gFW，下降至690g/100gFW，比对照降低了42.7％，果糖含量由对照的1046g/100gFW，下降至600g/100gFW，降低了42.6％。(图10)。

可溶性固形物测定方法：果实可溶性固形物含量的测定采用手持式糖酸仪(AtagoHand Refractometer)，用蒸馏水对手持式折光仪进行调零，随后取混匀的果实汁液若干置于手持测糖仪测定区，并进行读数，数值即为该株系果实的可溶性固形物含量，每个样品进行3次重复测量。每次测量完成后，都要用水清理手持测糖仪，并进行重新调零。

葡萄糖和果糖测定方法：取适量样品依次加入1M Tris-HCl pH 8.0溶液；50mMMgCl2；NADP+/ATP混合液；(测蔗糖先加转化酶溶液，并放置25-30℃放置至反应完全)。将溶液混匀，25-30℃放置至稳定后340nm下读数，记为A0。加入HK/G6P-DH溶液，混匀，25-30℃放置稳定340nm下读数，记为A1。加入PGI溶液，混匀，25-30℃放置稳定后340nm下读数，记为A2。根据已配制的葡萄糖和果糖溶液所测得的数据制作标准曲线，最后根据标准曲线换算出含糖量。

结果说明SlSTP1能正向调控葡萄糖和果糖，从而对果实可溶性固形物有显著影响，但由于果实可溶性固形是多基因控制的数量性状，且受环境影响，SlSTP1对果实可溶性固形物的影响可能受多种因素的制约。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种调控番茄可溶性固形物含量的基因及应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3555

<212> DNA

<213> tomato

<400> 1

cattatcaaa tttattttca aaaaatcata attttttcta cttaactttg ttctgtgatc 60

agctcggaaa aatggccggt ggtggtggta ttggtcccgg caacgggaaa gaatatcccg 120

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<210> 2

<211> 1572

<212> DNA

<213> tomato

<400> 2

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ctttatgtta ctatgacttg cattgttgct gccatgggtg gtctcatttt tggttatgat 120

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tgtgctggag ctttgattaa tggatttgct cagaatgttg ctatgctcat tattggtcgt 420

atttttcttg gttttggtat tggatttgcc aatcagtctg ttccactata cctatcagaa 480

atggcaccat acaaatacag aggagcactg aacataggtt ttcaactttc catcaccatt 540

ggtatacttg tagccaatgt gttaaactat ttctttgcca aaattcattg gggatggaga 600

ttgagtttag gaggtgctat ggtacctgca ttgatcatca caataggttc attattcctc 660

cctgaaaccc ctaattcgat gatcgaacgt ggtaaccacg acgaagccaa agctcgattg 720

aagagaatta ggggaattga agatgtagat gaagagttca atgatttggt tattgctagt 780

gaagcttcta ggaaaattga acatccctgg aggaacttgt tgcaaaagaa atatagacca 840

catcttacaa tggcaattat gatcccattt ttccaacaac ttactggaat caacgtgatt 900

atgttttatg cacctgtgtt gtttaaaacc attggttttg gtactgatgc ttcacttatg 960

tctgctgtga tcactggtgg aatcaatgtc attgccacta ttgtttctat ttactatgtt 1020

gataaattag gaagaagatt cttgtttctt gaaggtggaa ttcaaatgct cttttcccaa 1080

atagccgtgg caattttgat agcaataaag tttggagtaa atggaactcc aggggaatta 1140

ccaaaatggt atgcaatagt ggttgtgata ttcatttgtg tatatgttgc tggattcgct 1200

tggtcatggg gtcctcttgg atggctcgta cctagtgaaa ttttcccact ggaaattcga 1260

tcagctgcac aaagtatcaa tgtctcagtg aacatgatct tcacatttgc agtagcacaa 1320

gttttcttaa caatgttgtg tcatttgaag tttggattgt ttctgttttt cgccttcttt 1380

gtggtgatta tgactgtgtt catatacttc ttcttgcctg agacgaaaaa tattccgata 1440

gaagagatgg tgattgtgtg gaaagaacat tggttctggt ctaagttcat gactgaagtt 1500

gattatcctg gaactaggaa tggaactgct gttgaaatgg ctaaaggggg tgctggttac 1560

aaaattgtat ga 1572

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<211> 523

<212> PRT

<213> tomato

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Met Ala Gly Gly Gly Gly Ile Gly Pro Gly Asn Gly Lys Glu Tyr Pro

1 5 10 15

Gly Glu Leu Thr Leu Tyr Val Thr Met Thr Cys Ile Val Ala Ala Met

20 25 30

Gly Gly Leu Ile Phe Gly Tyr Asp Ile Gly Ile Ser Gly Gly Val Thr

35 40 45

Ser Met Asp Thr Phe Leu Asn Arg Phe Phe Pro Ser Val Tyr Arg Lys

50 55 60

Gln Lys Ala Asp Asn Ser Thr Asn Gln Tyr Cys Lys Phe Asp Ser Gln

65 70 75 80

Thr Leu Thr Met Phe Thr Ser Ser Leu Tyr Leu Ala Ala Leu Val Ser

85 90 95

Ser Leu Val Ala Ser Thr Val Thr Arg Lys Leu Gly Arg Arg Leu Ser

100 105 110

Met Leu Ser Gly Gly Ile Leu Phe Cys Ala Gly Ala Leu Ile Asn Gly

115 120 125

Phe Ala Gln Asn Val Ala Met Leu Ile Ile Gly Arg Ile Phe Leu Gly

130 135 140

Phe Gly Ile Gly Phe Ala Asn Gln Ser Val Pro Leu Tyr Leu Ser Glu

145 150 155 160

Met Ala Pro Tyr Lys Tyr Arg Gly Ala Leu Asn Ile Gly Phe Gln Leu

165 170 175

Ser Ile Thr Ile Gly Ile Leu Val Ala Asn Val Leu Asn Tyr Phe Phe

180 185 190

Ala Lys Ile His Trp Gly Trp Arg Leu Ser Leu Gly Gly Ala Met Val

195 200 205

Pro Ala Leu Ile Ile Thr Ile Gly Ser Leu Phe Leu Pro Glu Thr Pro

210 215 220

Asn Ser Met Ile Glu Arg Gly Asn His Asp Glu Ala Lys Ala Arg Leu

225 230 235 240

Lys Arg Ile Arg Gly Ile Glu Asp Val Asp Glu Glu Phe Asn Asp Leu

245 250 255

Val Ile Ala Ser Glu Ala Ser Arg Lys Ile Glu His Pro Trp Arg Asn

260 265 270

Leu Leu Gln Lys Lys Tyr Arg Pro His Leu Thr Met Ala Ile Met Ile

275 280 285

Pro Phe Phe Gln Gln Leu Thr Gly Ile Asn Val Ile Met Phe Tyr Ala

290 295 300

Pro Val Leu Phe Lys Thr Ile Gly Phe Gly Thr Asp Ala Ser Leu Met

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Ser Ala Val Ile Thr Gly Gly Ile Asn Val Ile Ala Thr Ile Val Ser

325 330 335

Ile Tyr Tyr Val Asp Lys Leu Gly Arg Arg Phe Leu Phe Leu Glu Gly

340 345 350

Gly Ile Gln Met Leu Phe Ser Gln Ile Ala Val Ala Ile Leu Ile Ala

355 360 365

Ile Lys Phe Gly Val Asn Gly Thr Pro Gly Glu Leu Pro Lys Trp Tyr

370 375 380

Ala Ile Val Val Val Ile Phe Ile Cys Val Tyr Val Ala Gly Phe Ala

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Trp Ser Trp Gly Pro Leu Gly Trp Leu Val Pro Ser Glu Ile Phe Pro

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Leu Glu Ile Arg Ser Ala Ala Gln Ser Ile Asn Val Ser Val Asn Met

420 425 430

Ile Phe Thr Phe Ala Val Ala Gln Val Phe Leu Thr Met Leu Cys His

435 440 445

Leu Lys Phe Gly Leu Phe Leu Phe Phe Ala Phe Phe Val Val Ile Met

450 455 460

Thr Val Phe Ile Tyr Phe Phe Leu Pro Glu Thr Lys Asn Ile Pro Ile

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Glu Glu Met Val Ile Val Trp Lys Glu His Trp Phe Trp Ser Lys Phe

485 490 495

Met Thr Glu Val Asp Tyr Pro Gly Thr Arg Asn Gly Thr Ala Val Glu

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Met Ala Lys Gly Gly Ala Gly Tyr Lys Ile Val

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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<400> 10

atgccaccag agaagacaca a 21