百合spl15基因和miR156a及其应用

摘要

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及百合spl15基因和miR156a及其应用。本发明克隆了百合SPL15蛋白的编码基因以及调控其表达的miR156a，并发现百合SPL15蛋白和miR156a具有调控植物开花和莲座叶数目的功能，通过提高百合SPL15蛋白的表达量能够促进植物开花提前、减少植物莲座叶数目，降低百合SPL15蛋白的表达量能够延迟植物开花、增加植物莲座叶数目；通过提高百合miR156a的表达量能够延迟植物开花、增加植物莲座叶数目。百合SPL15蛋白和miR156a及其调控开花和莲座叶数目功能的发现为缩短百合商品球育成年限，降低百合种球繁育成本提供了新的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及百合spl15基因和miR156a及其应用。

背景技术

百合(Lilium)属于百合科百合属，是可重复开花的多年生草本球根植物，因其大而直观的花朵、美丽的花型、丰富多样的色彩，以及美好的寓意而广受人们欢迎。此外，百合实用价值高，除可用于鲜切花、家用盆栽和公园绿化带外，部分百合品种也可用做药材和食用，有很高的营养价值。百合种质资源丰富，种类繁多，广泛分于亚洲、北美洲、欧洲等地区，根据不同的分类标准，百合的分类方法也多种多样，其中根据亲本来源不同可将百合分为：亚洲、东方、麝香、喇叭和新铁炮百合，分别表示为A(Asiatic)、O(Oriental)、L(Longiflorum)、T(Trumpet)和F(Formolongi)，以及杂交类百合：LA杂种百合、OT杂种百合、OA杂种百合和LO杂种百合，共9类。

自然条件下，百合小仔球第一年只长1片叶，同化物积累速度缓慢，种球膨大速度慢；1-2年才能进入成年期，长出主茎，而后长出多片叶子，有机物积累加快，种球膨大加速。培养成商品种球需要3年及以上时间，大大增加了百合种球繁育成本。目前对于百合的研究多集中在切花保鲜方面，对于缩短其商品球育成年限、调控其开花时间的研究还相对较少。

发明内容

本发明的目的是提供百合spl15基因和靶向调控spl15基因的miR156a，本发明的另一目的是提供百合spl15基因和miR156a在调控植物开花时间、莲座叶数目、营养期相变等方面的应用。

申请人前期研究发现百合小仔球经过15℃短时间冷藏，即可发生营养期相变，小仔球在第一年就能长出主茎，茎上7-8片叶，种球膨大速度明显快于自然条件，培养成商品球时间大大缩短，成本降低。为了探索百合小仔球营养期相变的分子机制，本发明对百合鳞片进行扦插，以常规培养为对照组，常规培养并经短时间的低温处理为处理组。取小仔球鳞茎盘进行转录组和小RNA测序，分析与仔球相变相关的基因信息，发现了响应低温处理、与百合营养期相变调控相关的SPL15蛋白和miR156a，并克隆了SPL15蛋白和miR156a的编码基因序列，进一步通过转基因功能验证，确定了百合SPL15蛋白和miR156a具有调控植物开花和莲座叶数目的新功能。

基于上述发现，本发明具体提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供百合SPL15蛋白，其具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选为95％。

第二方面，本发明提供编码所述百合SPL15蛋白的基因。

考虑到密码子的简并性，所有编码所述SPL15蛋白的核苷酸序列均在本发明的保护范围内。

优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或3所示。

第三方面，本发明提供含有百合SPL15蛋白的编码基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

第四方面，本发明提供百合SPL15蛋白、其编码基因或含有其编码基因的生物材料的如下任一种应用：

(1)在调控植物开花时间中的应用；

(2)在调控植物莲座叶数目中的应用；

(3)在调控植物营养期相变中的应用；

(4)在植物开花时间或莲座叶数目性状的遗传育种中的应用。

上述应用中，通过提高百合SPL15蛋白的表达量能够促进植物开花提前，降低百合SPL15蛋白的表达量能够延迟植物开花。

上述应用中，通过提高百合SPL15蛋白的表达量能够减少植物莲座叶数目，降低百合SPL15蛋白的表达量能够增加植物莲座叶数目。

本发明发现，百合spl15基因(编码SPL15蛋白)是miR156a的调控靶标，miR156a能够抑制百合spl15基因的表达。本发明通过小RNA测序获得了百合miR156a的序列，并发现miR156a同样能够调控植物的开花时间和莲座叶数目。

第五方面，本发明提供百合miR156a，所述miR156a的编码基因具有如下任一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.4或5所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO.4或5所示的核苷酸序列经一个或多个碱基的替换、插入或缺失得到的具有相同功能miRNA的基因的核苷酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.4或5所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选为95％。

第六方面，本发明提供含有所述百合miR156a的编码基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

第七方面，本发明提供百合miR156a、其编码基因或含有其编码基因的生物材料在调控植物开花时间或莲座叶数目中的应用。

上述应用中，通过提高百合miR156a的表达量能够延迟植物开花。

上述应用中，通过提高百合miR156a的表达量能够增加植物莲座叶数目。

第八方面，本发明提供百合miR156a、其编码基因或含有其编码基因的生物材料在调控植物营养期相变中的应用。

第九方面，本发明提供百合miR156a、其编码基因或含有其编码基因的生物材料在植物开花时间或莲座叶数目性状的遗传育种中的应用。

本发明中，所述的生物材料可为表达盒、载体、宿主细胞、重组菌或转基因植物细胞。

第十方面，本发明提供一种调控植物开花时间的方法，该方法包括：调控所述植物中百合SPL15蛋白或miR156a的表达量，使得所述植物的开花时间发生改变；

所述百合SPL15蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选为95％；

所述miR156a的编码基因具有如下任一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.4或5所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO.4或5所示的核苷酸序列经一个或多个碱基的替换、插入或缺失得到的具有相同功能miRNA的基因的核苷酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.4或5所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选为95％。

以上所述的方法中，通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，调控所述植物中百合SPL15蛋白或miR156a的表达量。

本发明中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，优选为拟南芥或百合。

本发明的有益效果在于：

本发明克隆了百合SPL15蛋白的编码基因以及能够抑制其表达的百合miR156a，并发现百合SPL15蛋白以及能够抑制其表达的百合miR156a具有调控植物开花和莲座叶数目的功能，通过提高百合SPL15蛋白的表达量能够促进植物开花提前、减少植物莲座叶数目，降低百合SPL15蛋白的表达量能够延迟植物开花、增加植物莲座叶数目；通过提高百合miR156a的表达量能够延迟植物开花、增加植物莲座叶数目。

百合SPL15蛋白和miR156a在百合开花过程中均发挥重要作用，百合SPL15蛋白和miR156a及其调控开花和莲座叶数目功能的发现为调控百合开花时间、缩短百合商品球育成年限，降低百合种球繁育成本提供了新的方法。

附图说明

图1为本发明实施例1中SPL15(左)和pre-miR156a(右)分别加酶切位点后PCR扩增结果电泳图。

图2为本发明实施例1中pCAMBIA1301-SPL15(左)和pCAMBIA1301-pre-miR156a(右)重组质粒双酶切验证。

图3为本发明实施例2中分别以转入pCAMBIA1301-SPL15(左)和pCAMBIA1301-pre-miR156a(右)的农杆菌为模板的PCR电泳图。

图4为本发明实施例2中以T1代植株DNA为模板扩增目的片段SPL15(左)和pre-miR156a(右)的电泳图。

图5为本发明实施例3中T2代转基因植株中SPL15表达模式及表型观察，其中，A.相对表达量；B.莲座叶数目；C.植株表型，WT代表野生型植株，OE-LbrSPL15代表SPL15转基因植株。

图6为本发明实施例3中T2代转基因植株中miR156a表达模式及表型观察，其中，A.相对表达量；B.莲座叶数目；C.植株表型，WT代表野生型植株，OE-Lbr-miR156a代表miR156a转基因植株。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中所使用的植物材料和主要试剂如下：

1、植物材料

以下实施例所用材料为百合OT(Oriental×Trumpet)杂交系品种‘Robina’。选取大小一致、饱满、无病虫害、无机械损伤的种球剥离外鳞片，以细草炭为基质，选用规格相同的纸箱套袋进行扦插，鳞片均匀摊平，每个纸箱叠插4层，置于恒温气候培养箱中定期浇水养护。以25℃常规培养16周为对照组，25℃常规培养12周、15℃处理4周为处理组。分别选取重量相似且饱满的小仔球，去除磷片和磷茎盘取其芽芯，立即用去离子水冲洗干净后用锡箔纸包裹置于液氮，－80℃冰箱保存备用。

2、主要试剂

1.0％的琼脂糖凝胶：准确称取1g琼脂糖粉末，溶于100mL 1×TAE缓冲液(由北京艾德莱生物科技有限公司提供的50×TAE溶液稀释得到)，加热至沸腾溶解，自然冷却至60℃后加入10μL核酸染料，倒入插好梳子的胶板中冷却即可。

LB固体/液体培养基(100mL)：准确称取各1g的胰蛋白胨和NaCl、0.5g酵母提取物、1.5g琼脂于锥形瓶中，加入100mL去离子水，玻璃棒搅拌均匀后放入高压蒸汽灭菌器中，121℃、101kPa灭菌30min，在超净工作台上平均倒在6个直径9cm的一次性塑料培养皿中，避免产生气泡，冷却后加盖、封口膜封口，于4℃冰箱中保存。LB液体培养基除不加琼脂外与固体培养基相同，灭菌完毕取出冷却后直接于4℃冰箱保存。

LB(含Amp/Kan)固体/液体培养基(100mL)：LB固体培养基灭菌后，于超净工作台中自然冷却至60℃加入100μL Amp(100mg/mL或100μL Kan(50mg/mL))，混匀后分装倒平板，封口膜封好培养皿后4℃保存。LB(含Amp/Kan)液体培养基则在不含琼脂的培养基灭菌后冷却保存，随用随加Amp/Kan(每100mL培养基加100μL抗生素)。

30mg/mL利福平(Rif)：准确称量300mg利福平粉末溶于10mL DMSO溶剂中。

YEB(含三抗)固体/液体培养基(100mL)：准确称取1.65g YEB固体，1.2g琼脂于锥形瓶中，加去100mL离子水，玻璃棒搅拌均匀后放入高压蒸汽灭菌器中，101kPa、121℃灭菌30min，灭菌后于超净工作台中自然冷却至60℃加入100μL Amp(100mg/mL)、100μL Kan(50mg/mL)和100μL Rif(30mg/mL)，混匀后分装倒平板，封口膜封好4℃保存。YEB液体培养基不加琼脂，灭菌冷却4℃保存，三抗随用随加。YEB固体培养基粉末购自北京华越洋生物科技有限公司。

1/2MS培养基(用于拟南芥培养)(100mL)：准确称取0.247g 1/2MS固体粉末、2g蔗糖、0.6g琼脂于锥形瓶中，加入100mL去离子水，玻璃棒搅拌均匀后，调节pH至5.8，放入高压蒸汽灭菌器中，101kPa、121℃灭菌30min，在超净工作台上平均倒在6个直径9cm的一次性塑料培养皿中，避免产生气泡，冷却后加盖、封口膜封口，于4℃冰箱中保存。1/2MS培养基和琼脂均购自百奥百乐生物科技有限公司。

实施例1百合SPL15基因和pre-miR156a超表达载体的构建

为了分析百合小仔球营养期相变的分子机制，本发明对百合鳞片进行扦插，以25℃常规培养16周为对照组，25℃常规培养12周、15℃处理4周为处理组。取小仔球鳞茎盘进行转录组和小RNA测序，分析与仔球相变相关的基因信息，发现了响应低温处理、与百合营养期相变调控相关的SPL15蛋白和miR156a。根据转录组测序和小RNA测序结果，本发明克隆了SPL15蛋白和miR156a的编码基因序列，具体如下：SPL15蛋白的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，基因组全长序列如SEQ ID NO.3所示，SPL15蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；前体miR156a(pre-miR156a)的编码基因序列如SEQ ID NO.4所示，成熟miR156a的编码基因序列如SEQ ID NO.5所示。

1、百合SPL15加酶切位点后的全长克隆

(1)百合小仔球芽芯RNA的提取

取适量保存备用的磷茎盘，提取其总RNA。RNA提取采用购自艾德莱生物科技有限公司的多糖多酚RNA快速提取试剂盒(RN53)。根据1％琼脂糖凝胶电泳结果显示，百合芽芯RNA提取质量良好，条带位置正确、明亮，浓度合适，可用于后续试验。

(2)cDNA第一链的合成

选用全式金生物科技有限公司TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成：

①Microtube管中配制表1所示的混合液20μL。

表1反转录反应体系

②用枪头将上述溶液混匀后，低速离心10s。

③在PCR仪中，42℃孵育30min，85℃加热5s。

④-20℃保存备用。

(3)酶切引物设计

以百合SPL15全长序列(SEQ ID NO.3)为基础，设计具有酶切位点的全长引物，引入KpnⅠ和SalⅠ酶切位点。引物序列如下(其中加粗表示酶切位点，其前为保护碱基)：

SPL15-FK：

SPL15-RS：

(4)PCR扩增反应

在冰上配制表2所示的混合液。

表2PCR扩增反应体系

PCR反应条件：94℃5min；94℃40s，60℃30s，72℃1min，31个循环；72℃10min，4℃保温，-20℃保存。

(5)切胶回收

采用TaKaRa公司的MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒按照以下步骤对PCR产物进行切胶回收：

取制好的50μL孔径的1％琼脂糖凝胶，电压120V、电流120A条件跑胶20分钟后拍照成像，切取位置正确的条带。

称量干净的离心管的重量并记录，戴好护目镜在在紫外灯照射下迅速切取目的条带，装好胶块再次称量并记录。计算胶块的体积(1mg＝1μL)，向其中加入3倍凝胶体积的Buffer GM，使胶块与溶液充分接触。

37℃溶解胶块10分钟，期间可颠倒1-2次，促进胶块溶解，确保溶解完全后再继续。

将吸附柱安置于收集管上，将步骤4的溶液全部转入，12000rpm离心1min，弃滤液。

按试剂盒中的说明书进行后续步骤(确保膜上无残留)。

将吸附柱放在1.5mL离心管上，加入30μL提前预热好的洗脱液(60℃)，室温静置1min后，12000rpm离心1min，4℃保存回收的DNA。

(6)pTOPO-T载体与目的片段连接及转化大肠杆菌

①室温(20℃-30℃)下按表3所示体系操作配置连接液。

表3连接体系

②用移液枪轻轻吹打混匀，短暂离心后于PCR仪中25℃连接5min。

③取100μL大肠杆菌感受态细胞DH5α置于冰上融化，完全解冻后轻弹几次管壁使细胞均匀悬浮。

④加入上述连接液，混匀后于室温条件下静置5min。

⑤加入500μL LB液体培养基，在恒温振荡培养箱中37℃200rpm震荡培养半小时后，5000rpm离心30s，吸走200μL上清后重悬菌液。

⑥取200μL菌液于超净工作台上均匀涂布至含Amp的LB固体培养基上，37℃倒置过夜。

(7)转化子鉴定

用10μL枪头挑取合理大小的阳性单菌落，接于含有10μL dd H2O的2mL离心管中，吹打混匀，取1μL进行菌落PCR鉴定，体系如表4所示。

表4菌落PCR鉴定反应体系

PCR反应程序为：94℃5min；94℃40s，55℃30s，72℃1min，32个循环；72℃10min；4℃保温，－20℃保存。

在剩余9μL菌液的离心管中加入1.5mL LB液体培养基，1.5μL Amp，37℃、180rpm震荡培养4-6h。

将菌落PCR产物跑胶后成像，选取条带位置正确的对应菌液吸取500μL进行测序。DNA序列的测定由北京博迈德基因技术有限公司完成。

2、百合pre-miR156a加酶切位点后的片段克隆

(1)百合小仔球芽芯DNA提取

DNA提取采用购自北京艾德莱生物科技有限公司的CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒，具体操作步骤按试剂盒中的说明书进行。根据1％琼脂糖凝胶电泳结果显示，百合芽芯DNA提取质量良好，条带位置正确、明亮，浓度合适，可用于后续试验。

(2)酶切引物设计

以前述转录组预测的百合miR156a前体基因(SEQ ID NO.4)序列为基础，设计具有酶切位点的引物，引入KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点。引物序列如下(其中加粗表示酶切位点，其前为保护碱基)：

miR156a-FK：

miR156a-RX：

(3)PCR扩增反应

在冰上按下表在Microtube管中配制表5所示的混合液。

表5PCR扩增反应体系

PCR反应条件：94℃5min；94℃40s，56℃30s，72℃1min，31个循环；72℃10min，保温4℃，-20℃保存。

(4)切胶回收

参考上述1中的(5)。

(5)pTOPO-T载体与目的片段连接及转化大肠杆菌

参考上述1中的(6)。

(6)转化子鉴定

参考上述1中的(7)，PCR鉴定体系中将LaTaq Mix换为rTaq Mix。

3、超表达载体的构建

(1)提取质粒

选择测序结果正确的对应留存1mL菌液，加入至含有7mL(含Amp)LB液体培养基的10mL离心管中，37℃180rpm过夜培养后用于提取质粒，质粒提取试剂盒购自全式金生物技术有限公司，具体操作按照试剂盒中说明书进行，洗脱好的质粒于写好标签于-20℃冰箱保存。

(2)双酶切反应

采用购自宝日医生物技术有限公司的快切酶分别对上述质粒和pCAMBIA1301质粒进行双酶切，其中含SPL15质粒采用Takara QuickCut

①双酶切体系如表6所示。

表6双酶切体系

②轻轻混匀后瞬时离心。

③PCR仪中37℃保温，前者20min，后者10min。

(3)切胶回收

琼脂糖凝胶电泳检测双酶切产物后对目的条带进行切胶回收，步骤参考上述1中的(5)。

(4)连接

①将回收产物按表7在Microtube管中配制连接体系(插入片段与载体的摩尔比为3∶1到10∶1)。

表7连接反应体系

(2)PCR仪中25℃连接2h。

(5)转化

①取100μL大肠杆菌感受态细胞DH5α(100mL)，于冰上完全融化后悬浮菌液。

②加入上述连接液，枪头轻晃混匀。冰浴30min后，热激42s，再放回冰浴2min。

③加入500μL LB液体培养基，37℃180rpm培养1h。

④取200μL菌液于超净工作台上均匀涂布在LB固体培养基(含Kan)上，37℃倒置过夜。

(6)转化子鉴定

参考上述1中的步骤(7)。将试验中所需的Amp替换为Kan，体系中SPL15采用LaTaqMix，miR156a采用rTaq Mix。

(7)双酶切验证

参照上述3中的步骤(1)提取测序结果正确菌液的质粒，按照上述3中的步骤(2)中的反应体系加样进行双酶切验证，然后进行1％的琼脂糖凝胶电泳，根据条带位置判断载体构建是否成功。

4、百合SPL15和pre-miR156a加酶切位点后的片段克隆结果和超表达载体构建结果

通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，发现SPL15的PCR扩增产物在3000bp和5000bp之间靠近3000bp的地方有一条清晰条带(图1)，pre-miR156a的PCR扩增产物在300bp附近有一条清晰条带(图1)，分别切胶回收后连接转化到TA克隆载体上进行测序，使用DNAMAN软件进行序列比对，发现结果分别与实施例1中百合转录组数据库预测的3216bp的SPL15基因片段和300bp的pre-miR156a片段序列一致，同时后加上去的酶切位点位置正确、序列完整，表明SPL15基因和pre-miR156a加酶切位点后的片段克隆成功。

分别利用快切酶KpnⅠ和SalⅠ与快切酶KpnⅠ和XbaⅠ对测序结果正确的重组质粒进行双酶切验证(图2)，目的条带位置正确，说明pCAMBIA1301-SPL15和pCAMBIA1301-pre-miR156a超表达载体构建成功。

实施例2转基因拟南芥的构建

1、野生型拟南芥的种植和养护

滤纸浸湿铺于培养皿中，取保存于4℃冰箱的干燥野生型拟南芥种子适量，均匀洒在滤纸上，盖好盖子用橡皮筋绑好固定，放置在4℃冰箱中春化3天。

按照细草炭∶蛭石＝3∶1的比例配制适量基质，高压蒸汽灭菌器灭菌后，冷却备用。

加水将搅拌基质至攥紧后不散团，将基质装至8个直径12cm的花盆，抚平表面备用。

用1mL微量移液器将春化后的拟南芥种子均匀点播在基质中，每盆播4粒，于托盘中盖罩保湿培养。

种植条件：湿度60％，23℃光照培养16h，20℃黑暗培养8h。

长出5片真叶后撤去透明罩。定时浇水松土(浇水时可直接浇在托盘中，松土时注意不伤根)，保持空气湿润，开花后可插入细木条固定，防止植株倒伏。

2、电击法转化农杆菌

(1)重组质粒转化到农杆菌感受态细胞

①用75％的酒精清洗浸泡电极杯后，置于超净工作台中吹干，-20℃冰箱中预冷20min。

②-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞于冰上解冻。

③加1.5μL测序以及双酶切验证正确的重组质粒到100μL农杆菌感受态细胞中，用枪头轻轻混匀后，立即转入预冷的电极杯中。在2500v高压下电击5.5ms(保证电极杯外壁干燥)。

④电击完毕后往电极杯中加入1mL预冷的YEB培养基，迅速盖紧盖子上下混匀。将菌液转至1.5mL离心管中，28℃180rpm振荡培养1h。

⑤吸取200μL菌液均匀涂布于含三抗(Kan、Rif、Gen)的YEB固体培养基上，28℃倒置培养2天(期间随时观察平板长菌情况，防止菌落生长过大)。

(2)转化子鉴定及保存

①参考上述1中的步骤(7)进行转化子鉴定，向剩余9μL菌液中加入1.5mL含有三抗的液体YEB培养基，28℃180rpm振荡培养1-2天。

②PCR结果用1％琼脂糖凝胶电泳检测条带位置是否正确。

③吸取200μL 60％的无菌甘油溶液于1.5mL灭菌冻融管中，加入600μL菌液，混匀后于-80℃冰箱保存备用。

利用电击法分别将pCAMBIA1301-SPL15和pCAMBIA1301-pre-miR156a转入农杆菌GV3101，进行菌液PCR，扩增目的片段，电泳检测结果显示条带单一明亮，位置准确(图3)，说明两个重组质粒均成功转入农杆菌，可以进行后续试验。

3、花序侵染法转化模式植物拟南芥

(1)侵染前一天晚上，将拟南芥浇透水，若有果荚则需全部剪去；在-80℃冰箱取出两管保存的菌液于冰上溶解后，转移至200mL含有三抗的YEB液体培养基中，28℃200rpm震荡培养1-2d至菌液浑浊，OD

(2)将200mL菌液平均转移至4个50mL灭菌离心管中。5000rpm离心10min，去上清。

(3)每管用20mL灭菌后的5％的蔗糖溶液重悬菌体，5000rpm离心10min，弃上清，重复三次。最后一次离心弃上清后每管中加入25mL 5％的蔗糖溶液，重悬菌体。将菌液全部倒进灭菌的烧杯中，加5％的蔗糖溶液至200mL，加入40μL表面活性剂Silwet-77，混匀即为侵染液。

(4)将拟南芥花序全部浸入至侵染液中，计时1min，将所有侵染后的植株置于暗处培养24h，然后继续正常养护。

(5)隔一周和两周进行第二次和第三次侵染。

(6)种子成熟后及时收取T0代种子，防止种子自然脱落。

4、转基因拟南芥纯合株系筛选

(1)转基因拟南芥植株栽植与养护

①取适量转基因拟南芥种子置于1.5mL离心管中。加1mL无菌水洗涤2min，去水后加1mL 75％的乙醇晃动消毒5min，去乙醇后加1mL 15％的次氯酸钠晃动消毒10min，之后用无菌水洗涤5次，每次2min，尽量去除乙醇和次氯酸钠残留。

②在离心管中加入无菌水吹打混匀种子，吸取适量种子使其均匀分布在含有潮霉素(37.5mg/100mL)的1/2MS培养基中，并吸去多余水分，用封口膜封好口，置于4℃冰箱中春化3天。

③春化后的培养基在智能光照培养箱中培养，条件为23℃光照16h，19℃黑暗8h。直至种子发芽长出两片真叶。

④用镊子小心夹取长出两片真叶并且长势健壮的支柱，用去离子水轻轻冲洗干净根系，栽植在灭菌的基质中，每盆4株进行常规养护，4-5周后可适当浇灌营养液。

(2)转基因纯合株系筛选

①将收到的T0代种子按上述步骤种植，筛选出阳性植株(T1代)，开花结实后按单株收集种子并标记清楚。

②将单株收集的T1代种子按上述方式播种于1/2MS培养基中，根据孟德尔分离定律判断死亡植株∶成活植株＝1∶3，筛选长出真叶的成活幼苗(T2代)，选取部分健壮植株栽植，一段时间后取叶片进行转基因植株鉴定。成熟后按单株收取T2代种子并标记。

③将单株T2代种子用同样的方式栽植养护，成熟后按单株收取种子(T3代)。选取单株T3代种子100粒，按上述方式播种，并观察发芽率，100％成活的培养皿所对应的植株即为转基因纯合株系。挑取健康植株移栽，一段时间后取叶片进行转基因表达模式验证。

④每一代栽种都需要同时栽植野生型植株作对照。

5、转基因植株鉴定

①T1代拟南芥叶片DNA提取

参考实施例1的2中的步骤(1)，但是直接取拟南芥叶片到1.5mL离心管中，加液氮用微量研磨器研磨至细粉，然后进行后续步骤。

②PCR扩增

以pre-miR156a和SPL15自身上游引物，以重组载体上35S片段设计下游引物，以提取的拟南芥DNA为模板，进行PCR扩增，反应体系同实施例1的1中的步骤(4)与实施例1的2中的步骤(3)。电泳检测PCR产物条带的正确性，从而鉴定转基因成功。体系所用引物序列如下：

SPL15-FK：CGGGGTACCGTCGTCTCCCGTAATTCTCGA；

miR156a-FK：CGGGGTACCTGAAAGCTTACTCTACATG；

35S-R：TGTCGGCAGAGGCATCTTCAACG。

同时提取T1代转基因拟南芥与野生型拟南芥DNA，分别以SPL15和pre-miR156a自身上游引物，以重组质粒上35S片段设计下游引物，进行PCR扩增，电泳结果中对照组以野生型拟南芥DNA为模板未扩增出条带，而以T1代转基因拟南芥DNA为模板扩增的目的条带(SPL15转基因植株记为S1-S5，miR156a转基因植株记为m1-m5)单一且明亮、位置正确(图4，SPL15对应长度为3831bp，pre-miR156a对应长度为905bp)，说明pCAMBIA1301-SPL15和pCAMBIA1301-pre-miR156a均被成功转至模式植物拟南芥中。

实施例3转基因植株表达模式验证和表型分析

1、RNA提取

参照实施例1的1的步骤(1)。

2、荧光定量cDNA第一链的合成

SPL15荧光定量cDNA第一链合成方法如下：

利用购自北京全式金生物科技有限公司的反转录试剂盒进行荧光定量cDNA的合成：

(1)Microtube管中配制表8所示的混合液21μL(尽量让混合液中对照组和处理组的RNA摩尔含量相同)：

表8cDNA合成反应体系

(2)用枪头混匀混合物，低速离心10s。

(3)使用PCR仪，调节程序为42℃15min，85℃5s。

(4)将反转录产物置于-20℃冰箱保存备用。

miR156a荧光定量cDNA第一链合成方法如下：

利用全式金生物科技有限公司的TransScript miRNA First-Strand cDNASynthesis Super Mix进行miRNA荧光定量cDNA第一链的合成：

(1)在PCR管中按照表9加入反转录体系组分：

表9 cDNA合成反应体系

(2)用枪头轻轻混匀，37℃孵育1小时。

(3)85℃加热5s，失活RT Enzyme Mix。

(4)将反转录产物置于-20℃冰箱保存备用。

3、荧光定量引物设计

(1)对SPL15设计荧光引物如下：

SPL15YG-F：ACTTCTGATGCACAGGACCG；

SPL15YG-R：GGACTGCTGGAGAGCCAATT。

内参引物为18S，序列如下：

18S-F：CCTGAGAAACGGCTACCACAT；

18S-R：CACCAGACTTGCCCTCCA。

(2)直接取miR156a成熟序列为荧光引物：TGACAGAAGAGAGTGAGCACA；荧光下游引物为Universal miRNAqPCR Primer(10μM)。

内参引物为U4，序列如下：

U4-F：GCAATGACGCAGCTTATGAGG；

U4-R：CAAAGGGAGCCCTTCCAGAA。

4、荧光定量PCR扩增

以20μL体系在八联排PCR管中配置反应液，野生型与转基因型各取5个技术重复。SPL15荧光定量PCR扩增按照以下方法进行：

(1)在不透光的PCR管中加反应液，各进行5个技术重复。按表10配置混合液(注意在冰上操作，加荧光酶时在暗处进行)：

表10荧光定量PCR扩增反应体系

(2)将混合物混匀并离心。

(3)反应程序：94℃30s；94℃5s，60℃30s，40个循环。

miR156a的荧光定量PCR扩增按照以下方法进行：

(1)以20μL体系在八联排PCR管中配置反应液，处理与对照各取5个技术重复。按表11配置混合液(注意在冰上操作，加荧光酶时在暗处进行)：

表11荧光定量PCR扩增反应体系

(2)将混合物混匀并离心。

(3)反应程序：94℃30s；94℃5s，60℃30s，40个循环。

5、分别对植株进行拍照，分析转基因拟南芥和野生型拟南芥在表型上的差异。

6、T2代SPL15转基因植株表达模式验证结果及表型观察

提取T2代转基因拟南芥与野生型拟南芥RNA，设计SPL15荧光引物进行转基因植株表达模式验证，发现与野生型相比SPL15在转基因植株中超表达，且相对表达量是野生型的78倍(图5的A)，证明转基因成功；同时发现SPL15转基因植株比野生型提前4至6天开花(图5的C)，叶片比野生型大，并且莲座叶数目减少(图5的B)，说明过表达LbrSPL15促进拟南芥植株提前开花。

提取T2代转基因拟南芥与野生型拟南芥RNA，反转录后进行转基因植株表达模式验证，发现与野生型相比miR156a在转基因植株中超表达，且相对表达量是野生型的10倍(图6的A)；同时发现miR156a转基因植株比野生型延后3至5天开花(图6的C)，莲座叶数目增多(图6的B)，说明过表达Lbr-miR156a有延后拟南芥开花的功能。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京农学院

<120> 百合spl15基因和miR156a及其应用

<130> KHP211110297.4

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1035

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Arg Asp Ala Gly Ala Gln Val Ala Ser Pro Ala Phe Phe Leu

1 5 10 15

His Pro Gly Arg Phe His Asp Ser Thr Leu Ser Gly Lys Lys Arg Glu

20 25 30

Pro Pro Trp Gln Asn Pro Ser Phe Arg Arg Pro Thr Pro Gln Ile Ser

35 40 45

Ser Pro Val Ile Pro Thr Pro Ser Arg Asn Trp Asn Pro Asp Gln Trp

50 55 60

Asp Trp Asp Ser Arg Gly Phe Ala Ala Lys Pro Ala Lys Leu Asp Gly

65 70 75 80

Glu Asn Leu Ser Leu Lys Pro Gly Gly Gly Ala Phe Ala Ser Val Glu

85 90 95

Glu Pro Val Leu Val Pro Val Pro Val Ala Ala Ala Arg Pro Asn Lys

100 105 110

Arg Val Arg Ser Gly Ser Pro Gly Ser Gly Gly Gly Tyr Pro Met Cys

115 120 125

Gln Val Asp Asp Cys Arg Ala Asp Leu Ser Gly Ala Glu Asp Tyr His

130 135 140

Arg Arg His Lys Val Cys Glu Gly His Ser Lys Met Thr Asn Ala Leu

145 150 155 160

Val Gly Lys Val Met Gln Arg Phe Cys Gln Gln Cys Ser Arg Phe His

165 170 175

Pro Leu Ser Glu Phe Asp Glu Gly Lys Arg Ser Cys Arg Arg Arg Leu

180 185 190

Ala Gly His Asn Arg Arg Arg Arg Lys Ser Gln His Asp Asp Val Ser

195 200 205

Ser Arg Leu Ala Ala Pro Gly Asn Gln Glu Asn Val Ser Asn Gly Asn

210 215 220

Leu Asp Val Thr Asn Leu Leu Ala Leu Leu Ala Arg Leu Gln Gly Lys

225 230 235 240

Asn Val Glu Lys Leu Ala Thr Ile Pro Asp Lys Asp His Leu Ile Gln

245 250 255

Ile Leu Ser Lys Ile His Pro Leu Pro Ser Ala Asn Ser Ser Ser Arg

260 265 270

Ser Pro Val Ser Ser Gly Ile Asp Leu Asn Val Ser Gln Ala Ser Gln

275 280 285

Gln Val Tyr Ser Glu Gln Pro Ser Lys Thr Asn Gly Ser Pro Thr Ala

290 295 300

Pro Ser Thr Met Asp Leu Leu Gly Val Leu Ser Thr Ala Leu Val Thr

305 310 315 320

Thr Arg Pro Asn Thr Ser Pro Thr Asn Asp Gly Ser Asn Gly Gly Ser

325 330 335

Lys Ser Met Phe Thr Thr Thr Lys Ala Ala Ser Asp Val Ser Ser His

340 345 350

Ile Gln Pro Pro Ser Leu Gly Val Gly Gly Ser Ser Cys Ile Asn Gln

355 360 365

Thr Thr Ser Glu Glu Arg Leu Ala Gln Glu Ala His Val Arg Leu Gln

370 375 380

Leu Gln Leu Phe Gly Ser Val Glu Asp Asp Ser Pro Pro Lys Phe Gly

385 390 395 400

Ser Ser Val Lys Tyr Leu Ser Ser Glu Ser Ser Asn Pro Met Glu Asp

405 410 415

Arg Ser Pro Pro Ser Ser Pro Pro Val Pro Gln Glu Leu Phe Pro Val

420 425 430

His Pro Val Thr Glu Arg Arg His Glu Arg Met Ser Ile Cys Arg Glu

435 440 445

Asp Asn Gln Ala Ala Glu Ala Ser Thr Asn Cys Arg Trp Ser Thr Arg

450 455 460

Met Glu Val Phe Lys Asp Pro Glu Arg Gln Pro Gly Asn Asn Ile Val

465 470 475 480

Leu Thr Asn Arg Ser Gln Ala Gly Tyr Ala Ser Ser Ser Gly Ser Asp

485 490 495

His Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ser Asp Ala Gln Asp Arg Thr Gly Arg

500 505 510

Ile Ile Phe Lys Leu Phe Gly Lys Asp Pro Ser Asn Leu Pro Glu Ser

515 520 525

Leu Arg Ser Gln Ile Leu Asn Trp Leu Ser Ser Ser Pro Ser Glu Met

530 535 540

Glu Ser Tyr Ile Arg Pro Gly Cys Val Val Leu Ser Val Tyr Val Ala

545 550 555 560

Met Ser Ser Ile Ser Trp Asp Glu Leu Glu Glu Asn Leu Leu Gln Arg

565 570 575

Val Asn Ser Leu Val Gln Gly Thr Asp Ser Asn Phe Trp Arg Ser Gly

580 585 590

Arg Phe Leu Ala Cys Thr Ser Lys Gln Leu Val Ser His Lys Asp Gly

595 600 605

Lys Ile Arg Met Cys Lys Ser Trp Arg Thr Trp Ser Ala Pro Glu Leu

610 615 620

Thr Ser Val Ser Pro Val Ala Val Val Ser Gly Lys Glu Thr Ser Ile

625 630 635 640

Ile Leu Arg Gly Arg Asn Leu Thr Val Pro Gly Thr Lys Ile His Cys

645 650 655

Thr Tyr Met Gly Gly Tyr Thr Ser Lys Glu Val Leu Cys Ser Thr Tyr

660 665 670

Pro Gly Thr Ile Tyr Asp Asp Ser Ser Thr Glu Val Phe Asn Phe Pro

675 680 685

Gly Gly Pro Pro Asn Met Phe Gly Arg Cys Phe Ile Glu Val Glu Asn

690 695 700

Gly Phe Lys Gly Asn Ser Phe Pro Ile Ile Ile Ala Asn Ala Thr Ile

705 710 715 720

Cys Gln Glu Leu Arg Val Leu Glu Ser Ser Phe Glu Asp Leu Gly Thr

725 730 735

Ala Asp Val Asn Ser Glu Asn Arg Val Gln Gln Asn Glu Gln Pro Arg

740 745 750

Ser Lys Glu Asp Val Leu His Phe Leu Asn Glu Leu Ser Trp Leu Phe

755 760 765

Gln Lys Lys Gly Thr Pro Ser Ser Leu Ile Thr Met Asp Phe Ser Asn

770 775 780

Ala Arg Phe Lys Phe Leu Ile Thr Phe Ser Val Glu Arg Asp Trp Ser

785 790 795 800

Ala Leu Val Lys Leu Ile Leu Asp Ile Leu Val Glu Arg Ser Ile Arg

805 810 815

Ser Asp Val Leu Ala Gln Glu Ala Leu Glu Met Leu Ser Glu Val Gln

820 825 830

Leu Leu Ser Arg Ala Val Lys Arg Lys Cys Arg Gln Met Val Asp Met

835 840 845

Leu Leu His Tyr Ser Val Arg Arg Gly Pro Asp Thr Ser Lys Leu Tyr

850 855 860

Leu Phe Pro Pro Asn Val Ser Gly Pro Gly Gly Leu Thr Pro Leu His

865 870 875 880

Leu Ala Ala Ser Thr Gln Glu Ser Ala Asp Met Val Asp Val Leu Thr

885 890 895

Asn Asp Pro Gln Glu Val Gly Leu Gln Cys Trp Asp Ser Val Lys Asp

900 905 910

Asn Asn Gly His Thr Pro Tyr Met Tyr Ala Ser Met Arg Asn Asn Asn

915 920 925

Ala Tyr Asn Thr Leu Val Asp Arg Lys Leu Ile Asp Val Gln Ser Gly

930 935 940

Gln Ile Ser Ile Asp Val Ser Leu Lys Pro Gly Thr Gly Asp Glu Ser

945 950 955 960

Asp Lys Arg Pro Leu Gln Ala Gly Leu Cys Val Arg Cys Ala Val Met

965 970 975

Asp Thr Arg Arg Gly Arg Arg Val Val Arg Thr Gln Gly Phe Leu Gln

980 985 990

Arg Pro Tyr Val His Ser Leu Leu Ala Ile Ala Ala Val Cys Val Cys

995 1000 1005

Val Cys Leu Phe Leu Arg Gly Met Pro Arg Val Gly Cys Gly Ser Pro

1010 1015 1020

Phe Lys Trp Glu Asn Leu Asp Phe Gly Pro Ser

1025 1030 1035

<210> 2

<211> 3108

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggaacgcg atgccggcgc ccaggtcgcc tcccccgcct ttttcctcca ccccggccgc 60

ttccacgact ccaccctctc cggcaagaag cgggagccgc catggcaaaa ccctagcttc 120

cgccgcccga cgccgcagat ttcatccccc gtgattccca ctccgagtcg caattggaac 180

ccggatcagt gggactggga cagccgcggc tttgccgcca aaccagcaaa gctggatggg 240

gagaatctgt cactgaagcc tggaggggga gcttttgctt cggtggagga gccggtgctg 300

gtgccggtgc cggtggcggc ggcgaggccg aacaagcgtg tccggtccgg gtcgcctggg 360

agtggcggcg gctacccgat gtgtcaggtg gacgactgcc gggcggattt atcgggggcg 420

gaggactatc accggcggca caaggtgtgt gaggggcata gcaagatgac taacgctctg 480

gtggggaagg tgatgcagag gttctgccag cagtgtagca gatttcatcc tctctccgaa 540

ttcgatgaag ggaagaggag ctgcaggcgt aggttggccg gtcacaatcg gcgaaggcgg 600

aagagccagc atgatgatgt ttcgtcgcgg ttggcagccc caggaaacca agaaaatgtc 660

tccaacggaa acttggatgt cactaatttg ttagcccttt tggcgcgctt gcaaggtaaa 720

aatgtcgaga aactggctac tatacctgat aaagatcatc tcatccaaat tctcagtaaa 780

atacacccct tgccgtctgc taattcttcg tcgaggtccc ctgtatcaag tggcattgat 840

ctgaatgttt ctcaagcttc ccaacaagta tattctgaac aaccatctaa aacgaatgga 900

agcccaactg ctccatcaac gatggacttg cttggagttc tctctacagc tctcgtgaca 960

actcgaccta atacatctcc tacgaacgat ggtagtaatg gtggcagcaa atcaatgttt 1020

acaacaacga aagctgcatc ggatgtcagt tcacatatcc agcctccctc acttggagtt 1080

gggggaagca gttgtatcaa tcaaacaacg tcagaggagc gacttgctca agaagcccat 1140

gtaagattgc agctacagtt gtttggctcc gttgaggatg atagcccgcc gaaattcgga 1200

tcctccgtta aatatttatc ctctgagagc agcaacccca tggaagatag atcccctcca 1260

tcgtcaccac ctgtcccaca ggaacttttc cctgtgcatc cggtcacaga gaggagacat 1320

gagaggatgt ccatttgcag ggaagataat caggccgctg aagcaagcac gaactgtcgg 1380

tggagtacaa ggatggaggt tttcaaagat ccagaaagac agcctggaaa caatatagtc 1440

ctaaccaacc gatctcaagc aggttatgca tcgtcctcag gctcagacca ttcaccttct 1500

agttcgactt ctgatgcaca ggaccggact gggcgaatta tttttaagct ttttggcaaa 1560

gatccaagca atctccccga gagcctccgc agccagatct taaattggct ctccagcagt 1620

ccatcggaaa tggagagcta cattcgtcct ggctgtgtgg tcttatcggt ttatgtagcg 1680

atgtcatcta tttcttggga tgaacttgaa gaaaatcttc ttcaacgagt caattcccta 1740

gttcagggta ctgattcaaa tttttggaga agtgggagat ttttggcttg cacaagcaag 1800

caactggtat cacataaaga tgggaaaata cgcatgtgta aatcttggag gacgtggagt 1860

gctcctgaat tgacctctgt gtctccggtt gctgtcgtga gcgggaagga gacttcgatc 1920

attctcagag gccggaattt gactgttcca ggaaccaaaa ttcattgcac ttacatgggg 1980

gggtacacat caaaggaagt tctatgctca acttatccag gcactatata tgacgattcc 2040

agcacggagg tttttaattt tcctggaggg cctcctaata tgtttggtcg ctgtttcatc 2100

gaggtggaga atggttttaa agggaacagc tttcccatta ttatcgcaaa tgctaccatt 2160

tgtcaagagc tgagagttct tgaatctgag tttgaagatt taggaactgc tgatgtcaat 2220

tctgagaacc gagttcagca aaatgagcaa ccaagatcga aggaggatgt actgcacttc 2280

ctaaacgagc tcagttggtt gtttcagaag aagggcactc cttcgagtct cataaccatg 2340

gatttctcaa atgctcggtt caaatttctg attacatttt cagttgaacg tgattggtcg 2400

gctctcgtaa aattaattct agatatactt gtcgagagga gcatccgaag tgacgtccta 2460

gcccaagaag ctctggaaat gctctcagaa gttcaattgc tgagcagagc tgtgaagagg 2520

aagtgtaggc agatggttga catgcttctc cattattccg taaggagggg acctgatact 2580

tcaaagctgt acctttttcc tccgaacgtc tcaggcccag gtggattgac tcccttgcat 2640

ctcgctgcat ctacacagga atcggcggac atggttgatg tgctgacaaa cgacccacaa 2700

gaggttggat tgcaatgctg ggattccgta aaggacaaca atggccatac tccatacatg 2760

tatgcatcga tgagaaataa caatgcatac aatacactgg tggatagaaa gctcattgat 2820

gtgcaaagcg gccaaatctc catagacgtc tctttaaaac caggcacagg ggatgagtca 2880

gataagcgac cgttgcaagc tgggctttgt gtacggtgtg cggttatgga cacaaggcgt 2940

ggtaggcgag ttgtacgcac acaggggttc ctccagcggc catatgtcca ttcattgctt 3000

gctattgctg cggtttgtgt ttgtgtctgc ctgtttctcc gaggcatgcc gagggtgggg 3060

tgcgggtcac ccttcaaatg ggagaattta gatttcggcc ctagttaa 3108

<210> 3

<211> 3216

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtcgtctccc gtaattctcg aatcccccgc cgtctcctta ctcgaatttc agatttcatt 60

cagctgcagt cggacacggc catggaacgc gatgccggcg cccaggtcgc ctcccccgcc 120

tttttcctcc accccggccg cttccacgac tccaccctct ccggcaagaa gcgggagccg 180

ccatggcaaa accctagctt ccgccgcccg acgccgcaga tttcatcccc cgtgattccc 240

actccgagtc gcaattggaa cccggatcag tgggactggg acagccgcgg ctttgccgcc 300

aaaccagcaa agctggatgg ggagaatctg tcactgaagc ctggaggggg agcttttgct 360

tcggtggagg agccggtgct ggtgccggtg ccggtggcgg cggcgaggcc gaacaagcgt 420

gtccggtccg ggtcgcctgg gagtggcggc ggctacccga tgtgtcaggt ggacgactgc 480

cgggcggatt tatcgggggc ggaggactat caccggcggc acaaggtgtg tgaggggcat 540

agcaagatga ctaacgctct ggtggggaag gtgatgcaga ggttctgcca gcagtgtagc 600

agatttcatc ctctctccga attcgatgaa gggaagagga gctgcaggcg taggttggcc 660

ggtcacaatc ggcgaaggcg gaagagccag catgatgatg tttcgtcgcg gttggcagcc 720

ccaggaaacc aagaaaatgt ctccaacgga aacttggatg tcactaattt gttagccctt 780

ttggcgcgct tgcaaggtaa aaatgtcgag aaactggcta ctatacctga taaagatcat 840

ctcatccaaa ttctcagtaa aatacacccc ttgccgtctg ctaattcttc gtcgaggtcc 900

cctgtatcaa gtggcattga tctgaatgtt tctcaagctt cccaacaagt atattctgaa 960

caaccatcta aaacgaatgg aagcccaact gctccatcaa cgatggactt gcttggagtt 1020

ctctctacag ctctcgtgac aactcgacct aatacatctc ctacgaacga tggtagtaat 1080

ggtggcagca aatcaatgtt tacaacaacg aaagctgcat cggatgtcag ttcacatatc 1140

cagcctccct cacttggagt tgggggaagc agttgtatca atcaaacaac gtcagaggag 1200

cgacttgctc aagaagccca tgtaagattg cagctacagt tgtttggctc cgttgaggat 1260

gatagcccgc cgaaattcgg atcctccgtt aaatatttat cctctgagag cagcaacccc 1320

atggaagata gatcccctcc atcgtcacca cctgtcccac aggaactttt ccctgtgcat 1380

ccggtcacag agaggagaca tgagaggatg tccatttgca gggaagataa tcaggccgct 1440

gaagcaagca cgaactgtcg gtggagtaca aggatggagg ttttcaaaga tccagaaaga 1500

cagcctggaa acaatatagt cctaaccaac cgatctcaag caggttatgc atcgtcctca 1560

ggctcagacc attcaccttc tagttcgact tctgatgcac aggaccggac tgggcgaatt 1620

atttttaagc tttttggcaa agatccaagc aatctccccg agagcctccg cagccagatc 1680

ttaaattggc tctccagcag tccatcggaa atggagagct acattcgtcc tggctgtgtg 1740

gtcttatcgg tttatgtagc gatgtcatct atttcttggg atgaacttga agaaaatctt 1800

cttcaacgag tcaattccct agttcagggt actgattcaa atttttggag aagtgggaga 1860

tttttggctt gcacaagcaa gcaactggta tcacataaag atgggaaaat acgcatgtgt 1920

aaatcttgga ggacgtggag tgctcctgaa ttgacctctg tgtctccggt tgctgtcgtg 1980

agcgggaagg agacttcgat cattctcaga ggccggaatt tgactgttcc aggaaccaaa 2040

attcattgca cttacatggg ggggtacaca tcaaaggaag ttctatgctc aacttatcca 2100

ggcactatat atgacgattc cagcacggag gtttttaatt ttcctggagg gcctcctaat 2160

atgtttggtc gctgtttcat cgaggtggag aatggtttta aagggaacag ctttcccatt 2220

attatcgcaa atgctaccat ttgtcaagag ctgagagttc ttgaatctga gtttgaagat 2280

ttaggaactg ctgatgtcaa ttctgagaac cgagttcagc aaaatgagca accaagatcg 2340

aaggaggatg tactgcactt cctaaacgag ctcagttggt tgtttcagaa gaagggcact 2400

ccttcgagtc tcataaccat ggatttctca aatgctcggt tcaaatttct gattacattt 2460

tcagttgaac gtgattggtc ggctctcgta aaattaattc tagatatact tgtcgagagg 2520

agcatccgaa gtgacgtcct agcccaagaa gctctggaaa tgctctcaga agttcaattg 2580

ctgagcagag ctgtgaagag gaagtgtagg cagatggttg acatgcttct ccattattcc 2640

gtaaggaggg gacctgatac ttcaaagctg tacctttttc ctccgaacgt ctcaggccca 2700

ggtggattga ctcccttgca tctcgctgca tctacacagg aatcggcgga catggttgat 2760

gtgctgacaa acgacccaca agaggttgga ttgcaatgct gggattccgt aaaggacaac 2820

aatggccata ctccatacat gtatgcatcg atgagaaata acaatgcata caatacactg 2880

gtggatagaa agctcattga tgtgcaaagc ggccaaatct ccatagacgt ctctttaaaa 2940

ccaggcacag gggatgagtc agataagcga ccgttgcaag ctgggctttg tgtacggtgt 3000

gcggttatgg acacaaggcg tggtaggcga gttgtacgca cacaggggtt cctccagcgg 3060

ccatatgtcc attcattgct tgctattgct gcggtttgtg tttgtgtctg cctgtttctc 3120

cgaggcatgc cgagggtggg gtgcgggtca cccttcaaat gggagaattt agatttcggc 3180

cctagttaac ttcaatgcag aaggagtagc ttatca 3216

<210> 4

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgtttgatt ctgggtgcag ccttgagggc tgacagaaga gagtgagcac acagcgtgct 60

gcagcggcat cattgggatg cggttcccgt tgcgtgctca cttatctttc tgtcagctgc 120

cttttacctc tccctcttta tgctaccaag agtccatttt taccatttga ttgttttttt 180

ttttgttttg attaggcatg aggtcacagg atttggagaa gagatctaca aatgggtact 240

caagtaaaag gagatgacta gatgggagaa cgaatattgg tctctccaca gacttgcaac 300

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgacagaaga gagtgagcac a 21

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cggggtaccg tcgtctcccg taattctcga 30

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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