促进CD44水平的物质在制备通过促进CD44治疗/预防血管内皮炎症的产品中的应用

摘要

本申请公开了一种促进CD44水平的物质在制备通过促进CD44治疗/预防血管内皮炎症的产品中的应用。本申请提供的一种应用，通过促进血管内皮炎症患者体内的CD44水平来抑制血管内皮炎症的产生及发展，改善患者血管内皮的情况，对于降低心血管疾病的发病率，改善患者预后，降低患者病死率，降低国家医疗成本具有十分重要的意义。

说明书

技术领域

本申请涉及生物领域，更准确地说，涉及促进CD44水平的物质在制备通过促进CD44水平治疗/预防血管内皮炎症的产品中的应用。

背景技术

血管内皮细胞是介于血管壁和血流组织之间的一层单核细胞，作为一种物理屏障将循环血液与血管壁隔开。血管内皮细胞作为一种生理屏障，在一定范围内内皮结构和功能是相对稳定的；而外源性有害刺激(如长期高糖、高血压、高血脂等)可导致血液中产生大量的炎性细胞因子，在这些细胞因子的刺激下，血管内皮出现炎症反应，其功能和结构发生一些明显变化。

目前，临床上有多种针对血管内皮损伤治疗的药物，如二甲双胍类药物、胰岛素、磺脲类药物等，但是控制率仍然较差，且发病率逐年升高。因此早期寻找预防或干预这一进程的靶点，逆转血管内皮炎症反应，对于降低心血管疾病的发病率，改善患者预后，降低患者病死率，降低国家医疗成本具有十分重要的意义。

发明内容

本申请为了解决现有技术中存在的问题，提供了一种促进CD44水平的物质在制备通过促进CD44治疗/预防血管内皮炎症的产品中的应用。

根据本申请的第一方面，提供了一种促进CD44水平的物质在制备通过促进CD44治疗/预防血管内皮炎症的产品中的应用

在本申请一个实施方式中，其中，所述促进CD44水平的物质与其它治疗/预防血管内皮炎症的药物在所述产品中联合使用。

在本申请一个实施方式中，其中，所述促进CD44水平的物质为CD44促进剂。

在本申请一个实施方式中，其中，所述促进CD44水平的物质为CD44重组蛋白。

在本申请一个实施方式中，其中，所述促进CD44水平的物质以促进APPL1入核、激活转录因子TCF/LEF的方式来促进下游靶基因CD44的表达。

在本申请一个实施方式中，其中，所述治疗/预防血管内皮炎症的产品还包括辅料。

在本申请一个实施方式中，其中，所述治疗/预防血管内皮炎症的产品为注射制剂、口服片剂或者口服胶囊剂。

在本申请一个实施方式中，其中，所述血管内皮炎症是由高血压、高血糖或高血脂引起的。

本申请提供的一种促进CD44水平的物质在制备治疗/预防血管内皮炎症的产品中的应用，通过促进血管内皮炎症患者体内的CD44水平来抑制血管内皮炎症的产生及发展，达到治疗/预防血管内皮炎症的目的。

通过以下参照附图对本申请的示例性实施例的详细描述，本申请的其它特征及其优点将会变得清楚。

附图说明

被结合在说明书中并构成说明书的一部分的附图示出了本申请的实施例，并且连同其说明一起用于解释本申请的原理。

图1为观察组患者和正常对照组受试者血清中CD44含量的对比图。

图2是正常培养基对照组和高糖高脂培养基刺激组HUVEC中CD44水平的对比图。

图3是正常培养基对照组和高糖高脂培养基刺激组HUVEC中CD44的mRNA水平柱形对比图。

图4是正常饲料喂养组和高脂饲料喂养组小鼠的血管组织CD44水平的对比图。

图5是高糖高脂对照喂养组、高糖高脂刺激喂养组小鼠血管组织炎症因子ICAM-1蛋白表达水平对比图。

图6是高糖高脂对照喂养组、高糖高脂刺激喂养组小鼠血管组织炎症因子ICAM-1mRNA水平的对比图。

图7是高糖高脂对照喂养组、高糖高脂刺激喂养组小鼠经典炎症通路磷酸化的p65蛋白表达水平的对比图。

图8是高糖高脂对照喂养组、高糖高脂刺激喂养组小鼠炎症因子TNF-αmRNA水平的对比图。

图9是高糖高脂对照喂养组、高糖高脂刺激喂养组小鼠炎症小体NLRP3 mRNA水平的对比图。

图10是六种模型小鼠的体重的柱形对比图。

图11是六种模型小鼠的血糖的柱形对比图。

图12是RNA-seq分析差异表达基因Pathway分析图。

图13是炎症分子富集的分析图。

图14是血管组织中四种炎症因子表达图。

图15是小鼠血管组织中ICAM-1蛋白表达图。

图16是人脐静脉内皮细胞的Western Blot分析图。

图17是人脐静脉内皮细胞激光共聚焦扫描图。

图18是RNA-seq技术分析图。

图19人脐静脉内皮细胞转录因子活性分析图。

图20是人脐静脉内皮细胞转录因子的mRNA水平分析图。

图21是小鼠血管组织CD44的蛋白水平对比图。

图22是人脐静脉内皮细胞炎症因子的mRNA水平对比图。

图23是小鼠血管组织的Western Blot技术分析图。

图24是观察组患者和正常对照组受试者血清中脂联素含量的对比图。

图25是观察组患者和正常对照组受试者血清中CD44含量的对比图。

图26是血清脂联素和CD44水平的相关性分析图。

具体实施方式

为了使本申请的申请目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合具体实施例对本申请进行详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本申请，并非为了限定本申请。

为了简便，本文仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包括在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。

在本文的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“以上”、“以下”为包括本数，“一种或几种”中“几种”的含义是两个及两个以上。

本申请的上述申请内容并不意欲描述本申请中的每个公开的实施方式或每种实现方式。如下描述更具体地举例说明示例性实施方式。在整篇申请中的多处，通过一系列实施例提供了指导，这些实施例可以以各种组合形式使用。在各个实例中，列举仅作为代表性组，不应解释为穷举。

CD44是一种非激酶跨膜蛋白聚糖，由位于人类11号染色体或小鼠2号染色体上的基因编码，其参与细胞间相互作用，细胞粘附和迁移。CD44是透明质酸的受体，还可以与其它配体相互作用，例如骨桥蛋白、胶原蛋白和基质金属蛋白酶(MMP)。CD44在多种细胞类型中表达，多项研究表明CD44可以促进肿瘤发生、癌细胞迁移、增殖。目前也有大量报道关于将CD44作为癌症治疗的分子靶标，通过使用中和抗体、多肽、药物等抑制CD44表达和活性，减轻癌症症状和发生发展。

1、Western免疫印迹(Western blot)

Western免疫印迹是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。其中，对已知表达蛋白可以用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物可以通过融合部分的抗体检测。

Western Blot技术包括如下所述的步骤:

a.清洗玻璃板

玻璃板分1.5mm和1.0mm，常规用1.5mm(梳齿有相对应的1.5和1.0的，各有15孔和10孔)。

首先用清水进行清洗，然后用洗洁精擦洗，接着继续用清水清洗，清水冲干净后立起来，拿蒸馏水冲洗干净，将大板+小板固定在配胶底架上。

b.配胶

分离胶配方：10％的分离胶适合分子量大的分子，12％的分离胶适合分子量小的分子(10-60)。

浓缩胶配方：

配制分离胶，在分离胶的配置过程中先加入其它成分，最后加入TEMED，然后充分混匀，迅速加入玻璃板中，用酒精喷液面以压平液面(30min)。

配制浓缩胶，待分离胶凝固倒出酒精，将浓缩胶加入玻璃板中，立即插入提前准备好的梳齿，静置1h。

c.电泳

将两块板置于电泳槽中，向两块板之间加入配好的1X电泳缓冲液若只跑一块胶，那另一侧就用透明胶板(假板)插在里面。

1)平拔出梳子(两手分别捏住梳子的两侧竖直向上轻轻将其拔出)

2)加样

i、先加蛋白marker：3/5/7/10u均可(视加样情况灵活选择辨明左右的方法，左右加不同的量的marker以区分左右)。

ii、确定上样量：a、以原液上样：根据浓度计算出上30ug(或15ug/20ug/25ug)蛋白样品的体积来上样。b、稀释原液：将不同样本蛋白稀释为同一浓度的体系，等体积上样。

3)盖盖子，黑对黑，红对红。

4)先恒压80V/90V使样品在浓缩胶中跑；跑出分离胶时，将电压改为100V/120V。

5)当蓝色蛋白液跑至胶底部时，结束电泳，关闭电源。

d.转膜

1)配1X电转液(1000ml)，配好电转液后在-80℃的环境下使其迅速冷却或提前配好置于4℃使冷却。其中，双蒸水：甲醇：10X电转液＝7:2:1(700ml，200ml，100ml)。

2)将转膜夹子、膜分别泡在电转液中。

3)将玻璃板撬掉剥下胶，除去小玻璃板后，将胶的上、下、左右轻轻适度。切去一些，避免把分离胶刮破，小心剥下分离胶盖于膜上。

4)擀去夹子白板侧滤纸下的气泡，将膜和胶一同转移到白板侧的滤纸上(白膜黑胶)，调整使其与滤纸对齐，轻轻擀去气泡；在胶上盖3张滤纸并除去气泡；最后盖上另一个海绵垫，合起夹子。

5)盆中装冰，将夹子放入电转槽中，夹子端朝上，黑面对槽的黑面，白面对槽的红面；倒入电转液；设置：300mA，120min。

e.封闭

1)转膜完成后，立即将膜放入1X TBST漂洗1-2min，洗去膜上的转膜液。

2)将膜放入牛奶(5％脱脂奶粉2.5g+1X TBST加至50ml，摇床震荡60min，使其完全均匀。

3)1X TBST洗膜3次，5-10min/次。

f.一抗孵育：

i.稀释一抗：共3ml，用一抗稀释液稀释。

ii.剪膜：按照不交叉孵育一抗的原则，将不同的目的蛋白，内参所在条带的膜剪开，装在分格的盒子里，分别孵育一抗或内参，4℃摇床过夜。

g.孵育二抗

i.第二天取出膜，加入1X TBST(浸没膜)，摇床洗涤5-10min X4次，一抗回收放入-20℃。

ii.稀释二抗，用1X TBST(1:10000)。

iii.二抗室温，摇床震荡孵育1.5-2h，使其完全均匀。

iv.1X TBST洗10min X 4次。

2、Real-time PCR

又称定量即时聚合酶链锁反应(Quantitative real time polymerase chainreaction，简称Q-PCR/qPCR/rt-qPCR、定量即时PCR、即时定量PCR)，是一种在DNA扩增反应中，以荧光染剂侦测每次聚合酶链锁反应(PCR)循环后产物总量的方法技术，有广义概念和狭义概念。广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义概念的定量PCR技术(严格意义的定量PCR技术)是指用外标法(荧光杂交探针保证特异性)通过监测PCR过程(监测扩增效率)达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。

3、小干扰RNA转染

转染前24h，用0.25％胰蛋白酶消化HUVEC细胞并铺在6孔培养板，待细胞生长至70％－80％融合时，换为含有1％胎牛血清的DMEM培养基，每孔1ml。在100μl的DMEM无血清培养基加入25μM siRNA 5μl，柔和混匀。用100μl无血清的DMEM稀释5μl siPortTransfectionReagents试剂，轻轻混匀，室温放置10分钟。将稀释好的siRNA和siPortTransfection Reagents试剂混合；轻柔混匀，室温放置10分钟。将200μl siRNA/siPortTransfection Reagents复合物加入到6孔板内，来回轻柔摇晃细胞培养板。待细胞在培养箱37℃温育6-8h后，更换含有10％胎牛血清的内皮细胞培养基，72h后处理并收集细胞。

4、转录因子激活分析板阵列II

根据制造商的说明，使用转录因子激活分析板阵列II(购自Signosis)来分析HUVEC细胞中转录因子的活性。使用核提取试剂盒(购自Signosis，Sunnyvale，CA)从HUVEC细胞中分离出核蛋白。将基于转录因子DNA结合位点共有序列的生物素标记探针与15μg核蛋白提取物混合，以形成转录因子/探针复合物。将结合的探针与复合物分离，并与预先与探针互补的序列包被的平板杂交。用链霉亲和素-HRP检测捕获的DNA探针，并用微板发光计测量信号强度。使用CT方法计算相对基因表达水平，并标准化为五个管家基因的平均表达水平。

5、转录组测序分析(RNA-seq)

通过TRIzol方法(购自Invitrogen)从小鼠主动脉组织分离总RNA。mRNA被反转录成双链cDNA片段。mRNA库是根据制造商的协议，由用于Illumina的NEB Next UltraDirectional RNA库制备试剂盒(#E7530L，NEB，Ispawich，美国)生成。进行文库质量控制，然后在Illumina HiSeq 4000上以10pM对RNA文库进行测序，以产生150bp的配对末端读数。RNA-seq的差异表达分析是通过DESeq2 v1.20.0 (http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html)进行的。RNA-seq差异表达分析进行后，通过GO或者Pathway富集分析(Gene Ontology，http://geneontology.org/)进行功能注释。FDR<0.05的GO分析或者Pahway分析被认为是显着富集的。

6、人转录因子检测试剂盒

根据制造商说明，使用人转录因子(购自美国Qiagen)分析HUVEC细胞中Wnt/β-catenin途径转录因子的mRNA水平。通过Trizol试剂法(Invitrogen)分离总RNA，用于cDNA合成。使用RT2 SYBR Green Mastermix(PARN-026Z，QIAGEN)在7500Real-Time PC系统(Thermo Fisher Scientific，Inc)上进行qRT-PCR。PCR条件包括：在95℃变性10分钟，在95℃变性15秒，40个循环和在60℃变性1分钟。使用CT值计算基因表达水平。用2-ΔΔCT确定表达的倍数变化。

另外，为了便于说明，先对本实施例中采用的相关缩写词及英文单词进行解释，如下：

WT：野生对照鼠；APPL1 KO：APPL1基因敲除鼠；ND：普通饲料；HFD：高脂高糖饲料；APN：脂联素；NG/NL：普通培养基；HG/HL：高脂高糖培养基；Enrichment：通路富集；Vehicle:生理盐水灌注组；siAPPL1:敲降APPL1基因；siCD44:敲降CD44基因。

本申请提供下述的促进CD44水平的物质的具体应用。

本申请提供一种促进CD44水平的物质在制备通过促进CD44水平治疗/预防血管内皮炎症的产品中的应用。促进CD44水平的物质在制备的该产品或者药物中通过促进血管内皮炎症患者体内的CD44水平来治疗患者的血管内皮炎症。

在本申请一个实施方式中，血管内皮炎症是由高血压、高血糖或高血脂引起的。例如高血糖血管炎症反应是指在长期高糖环境下血管结构的适应性改变。研究发现，高血糖性血管炎症反应主要表现为炎症细胞粘附、迁移和趋化，血管扩张，血管通透性增加等。当然对于本领域的技术人员而言，血管内皮炎症具有相似的反应及病理，因此，血管内皮炎症还可以是由其它疾病引起的，或者作为其它疾病的并发症。

在本申请一个实施方式中，促进CD44水平的物质的可以是促进体内CD44表达水平的促进剂。例如该促进剂可以是CD44重组蛋白，或者是可以促进体内CD44表达的其它药物。

在本申请一个实施方式中，治疗/预防血管内皮炎症的产品可以为注射制剂、口服片剂或者口服胶囊剂等本领域技术人员所熟知的常规剂型。

在本申请一个实施方式中，促进CD44水平的物质与其它治疗/预防血管内皮炎症的药物在所述产品中的联合使用。本申请虽然没有给出与其它治疗/预防血管内皮炎症的药物联合应用的相关实验，但是对于本领域技术人员来说，促进CD44水平的物质只要能够促进患者体内的CD44水平的表达，即可达到本申请的治疗/预防血管内皮炎症的目的。

例如其它治疗治疗/预防血管内皮炎症的药物可以是消炎药等对炎症因子具有一定治疗作用的药物，其可以为药物化合物、药物组合物等，也可以为片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、注射剂等各种剂型的药物，本申请对此不做限制。

治疗/预防血管内皮炎症的产品还包括辅料，在本申请公开的促进CD44水平表达的物质在制备通过促进CD44水平来治疗/预防血管内皮炎症的产品中的应用基础上，合理选择适合的辅料对于本领域技术人员而言是常规的选择，在此不再具体说明。

在本申请一个实施方式中，促进CD44水平的物质以促进APPL1入核、激活转录因子TCF/LEF的方式来促进下游靶基因CD44的表达。找到治疗的靶点对于治疗/预防血管内皮炎症来说非常重要，CD44水平的物质例如脂联素，促进APPL1入核、激活转录因子TCF/LEF、促进下游靶基因CD44表达，以达到抑制炎症的发生或发展。

APPL1(adaptor protein,phosphotyrosine interaction,PH domain andleucine zipper containing 1)是由709个氨基酸组成的一种衔接蛋白，包含氨基酸的BAR结构域、PH结构域和羧基端PTB结构域。

本申请通过各实施例表明了CD44的水平与血管内皮炎症有直接的关系，通过促进体内CD44的水平，可以明显抑制用于反应血管炎症的各炎症因子，例如TNF-α、IL-1β，ICAM-1，NLRP3等。在本发明各对照实验及给药实验的基础上，对于本领域的技术人员而言，其它可以促进体内CD44水平的物质，均可以达到治疗/预防血管内皮炎症的效果。

下面结合具体的实验对本实施例进行进一步说明。

实施例一、患者对照实验

在首都医科大学附属北京市安贞医院连续收集初诊为糖尿病的患者，根据中国糖尿病诊断标准：①空腹血糖(FPG)≥7.0mmol；②有典型糖尿病症状(多尿、多饮和不能解释的体重下降)者，任意血糖≥11.1mmol/L。符合上述标准之一即可诊断为糖尿病。排除标准为①肾脏疾病、嗜铬细胞瘤、原发性醛固酮增多症等继发性高血压；②重度心律失常；③中、重度心功能不全；④活动性肝脏功能障碍，或者查体发现ALT或AST>3倍正常上限；⑤恶性疾病：肿瘤；⑥贫血；⑦急、慢性炎症疾病：包括风湿性关节炎、类风湿关节炎等。按照上述筛选标准，挑选出74位糖尿病患者作为观察组。

在同一医院体检中心进行健康体检且血糖正常的人群中随机选取30位受试者作为正常对照组。采集血脂、血糖、血常规等多项检验指标，并仔细询问心血管疾病、肝肾疾病等疾病病史以及家族史等情况。

所有入选案例，空腹8-10小时之后，静脉采取10ml血液样本，3000rpm，离心10分钟后，抽取血清，冻存于-80℃冰箱。

采用高灵敏度酶联免疫吸附测定法(ELISA)(试剂盒拟购自Cat#38E7963A34,Cloud-Clone Corp)分别测定观察组患者及正常对照组受试者的血清中CD44的含量。

酶联免疫吸附法测定试剂盒中CD44已预先包被于96孔微孔板中，形成固相载体。向微孔中加入标准品及标本，其中CD44与包被于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化标记的CD44抗体，将未结合的生物素化的抗体洗净后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素，再次洗涤后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的CD44浓度呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(O.D.值)，得出标准曲线后，根据标准曲线计算样品中CD44浓度，并采用SPSS软件(IBM Corp.,Armonk,NY,USA)进行统计学分析，得出图1。

图1为观察组患者和正常对照组受试者血清中CD44含量的柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示CD44的含量(ng/ml)，柱形上方的横线表示CD44含量的标准差，星号表示此实验及实验结果具有统计学意义。可以看出，观察组患者血清中的CD44的含量明显低于正常对照组受试者血清中CD44的含量，所以，糖尿病患者的血清中CD44的表达水平具有显著降低，CD44在糖尿病患者中被抑制。

实施例二、人脐静脉内皮细胞HUVEC实验

以人脐静脉内皮细胞HUVEC(购自国家科技资源共享服务平台北京协和细胞中心)为模型，实验分为两组：普通培养基对照组和高糖高脂培养基刺激组，置于5％CO

细胞模型建立成功后，使用裂解液Lysisbuffer(购自中国碧云天生物公司)和1％蛋白酶抑制剂(购自美国Thermo Fisher Scientific)裂解细胞，提取细胞蛋白。

采用Western Blot技术分别检测普通培养基对照组和高糖高脂培养基刺激组细胞模型CD44的蛋白水平，得到图2。

从图2中可以看出，高糖高脂培养(HG/HL)的HUVEC细胞CD44的蛋白水平明显低于正常培养(NG/NL)的细胞CD44的蛋白水平。

采用RT-PCR技术分别检测高糖高脂培养基刺激组和正常培养基对照组HUVEC中CD44mRNA的表达水平，其中，RT-PCR技术的检测步骤包括：提取RNA，反转录，PCR扩增，并通过Graph prism8.0(GraphPad Software,San Diego,CA)进行统计学分析，得到图3。

如图3所示，图3为正常培养基对照组和高糖高脂培养基刺激组HUVEC中CD44的mRNA水平柱形对比图，其中，以正常培养基对照组HUVEC中CD44的mRNA水平为1，高糖高脂培养基刺激组HUVEC的CD44的mRNA水平均以正常对照组细胞的CD44的mRNA水平作为参照，横轴表示组别，纵轴表示CD44的mRNA水平，柱形顶端的横线表示CD44 mRNA水平的标准差，图中最上方的横线及星号表示将横线所覆盖的两组进行比较，具有统计学意义。

从图3中可以看出，高糖高脂培养基刺激组的CD44的mRNA水平明显低于正常对照组CD44的mRNA水平。

实施例三、小鼠模型血管组织中CD44的表达

1、小鼠模型建立

选8-10周C57BL/6小鼠(购自北京斯贝福实验动物有限公司)40只，分为2组：普通饲料喂养组和高脂饲料喂养组，每组20只，喂养10周。其中高脂饲料喂养组进行高脂饲料喂养，高脂饲料(购自常州鼠一鼠二生物科技有限公司)包含60％kcal％的脂肪，通过饮食诱导糖尿病模型。普通饲料喂养组按照普通饲料喂养。

2、解剖

造模成功后，对各组的小鼠使用异氟烷进行气体麻醉处理，对小鼠皮肤消毒开腹，迅速打开小鼠胸腔，心尖取血，生理盐水灌流后充分打开小鼠胸腹腔，剥离多余组织，充分暴露主动脉血管，在体式显微镜下充分分离血管周围组织后，将血管放入液氮中速冻，随后将组织放入-80℃冰箱中待用。

3、Western Blot检测

采用Western Blot技术分别检测普通饲料喂养组和高脂饲料喂养组小鼠血管组织中CD44的蛋白水平。其中，Western Blot技术的检测步骤包括：清洗玻璃板、配胶、电泳、转膜、封闭、孵育、显影。其中一抗为CD44(购自美国Cell Signaling Technology公司)；孵育二抗(购自美国Cell Signaling Technology公司)。采用ChemiDoc

图4中的a图为正常饲料喂养组(ND)和高脂饲料喂养组(HFD)小鼠的血管组织CD44的western-blot图，其中，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)即内部参照，黑色面积表示血管组织CD44和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的含量，黑色面积越大，则小鼠的血管组织中CD44的含量越多，道尔顿(KD)为原子质量单位。图4中的b图为正常饲料喂养组(ND)和高脂饲料喂养组(HFD)小鼠的血管组织CD44的蛋白水平柱形对比图，使用Image Lab软件(Bio-Rad)标出黑色面积大小，然后使用Graph Prism 8.0软件(GraphPad Software,San Diego,CA)进行统计学分析以及绘柱形图，其中，横轴表示组别，纵轴表示CD44的蛋白水平(以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为参照)，柱形顶端的横线表示CD44水平的标准差，图中最上方的横线及星号表示将横线所覆盖的两组进行比较，具有统计学意义。

从图4中可以看出，高脂喂养的小鼠血管组织中CD44的蛋白水平明显低于正常对照小鼠血管组织中CD44的蛋白水平。

实施例四、小鼠给予重组蛋白CD44处理实验

1、小鼠模型建立

C57BL/6小鼠(购自北京斯贝福实验动物有限公司)高糖高脂对照喂养组：高脂饲料(购自常州鼠一鼠二生物科技有限公司)喂养C57BL/6小鼠10周,生理盐水微量泵(微量泵购自美国ALZET科研仪器公司)灌注高糖高脂小鼠，剂量为0.25ug/g/day，通过微量泵持续输注7天，共5只小鼠。

C57BL/6小鼠高糖高脂刺激喂养组(给予CD44处理)：高脂饲料(购自常州鼠一鼠二生物科技有限公司)喂养C57BL/6小鼠10周,CD44重组蛋白(购自中国上海生工生物科技Sangon Biotech公司)微量泵灌注高糖高脂小鼠，剂量为0.25ug/g/day，通过微量泵持续输注7天，共5只小鼠。

2、解剖

对各组空腹4-5小时后的小鼠使用异氟烷气体麻醉处理。待麻醉后，皮肤消毒开腹，迅速打开小鼠胸腔，心尖取血，大约1ml，置于离心管。生理盐水灌流后充分打开小鼠胸腹腔，剥离多余组织，充分暴露主动脉血管，在体式显微镜下充分分离血管周围组织后，将血管放入液氮中速冻，随后将组织放入-80℃冰箱中待用。取材结束后，小鼠全血样本，3000rpm，10分钟进行离心后，吸取血清，冻存于-80℃冰箱。

采用高灵敏度酶联免疫吸附测定法(ELISA)(试剂盒购自Cat#38E7963A34,Cloud-Clone Corp)分别测定CD44处理的高糖高脂小鼠及生理盐水灌注的高糖高脂小鼠血清中CD44的含量。酶联免疫吸附法测定试剂盒中CD44已预先包被于96孔微孔板中，形成固相载体。向微孔中加入标准品及标本，其中CD44与包被于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化标记的CD44抗体，将未结合的生物素化的抗体洗净后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素，再次洗涤后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的CD44浓度呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(O.D.值)，得出标准曲线后，根据标准曲线计算样品中CD44浓度，并采用SPSS软件(IBM Corp.,Armonk,NY,USA)进行统计学分析，结果显示经过CD44处理的高糖高脂小鼠血清中的CD44的含量明显大于生理盐水灌注的高糖高脂小鼠血清CD44的含量，因此成功通过CD44重组蛋白给小鼠体内回补CD44。

采用Western Blot技术分别检测CD44灌注的高糖高脂小鼠组和生理盐水灌注的高糖高脂小鼠的血管组织中ICAM-1的蛋白水平，其中，Western Blot技术的检测步骤包括：清洗玻璃板；配胶；电泳；转膜；封闭；一抗孵育，其中一抗为ICAM-1(购自美国Abcam公司)；孵育二抗(购自美国Cell Signaling Technology公司)；显影，并采用ChemiDoc

从图5中可以看出，CD44灌注的高糖高脂小鼠处理组(HFD+CD44)血管组织ICAM-1的蛋白水平明显低于生理盐水灌注的高糖高脂小鼠(HFD+Vehicle)血管组织CD44的蛋白水平。

采用RT-PCR技术分别检测CD44灌注的高糖高脂小鼠组和生理盐水灌注的高糖高脂小鼠血管组织中ICAM-1的mRNA表达水平，其中，RT-PCR技术的检测步骤包括：提取RNA，反转录，PCR扩增，并通过Graph prism8.0(GraphPad Software,San Diego,CA)进行统计学分析，得到图6。

图6为生理盐水灌注的高糖高脂小鼠和CD44灌注的高糖高脂小鼠血管组织ICAM-1的mRNA水平柱形对比图。其中，以生理盐水灌注的高糖高脂小鼠的mRNA水平为1，CD44灌注的高糖高脂小鼠血管组织的ICAM-1mRNA水平以生理盐水灌注的高糖高脂小鼠的ICAM-1的mRNA水平作为参照，横轴表示组别，纵轴表示ICAM-1的mRNA水平，柱形顶端的横线表示ICAM-1mRNA水平的标准差，图中最上方的横线及星号表示将横线所覆盖的两组进行比较，具有统计学意义。

从图6中可以看出，CD44灌注的高糖高脂小鼠血管组织的ICAM-1的mRNA水平明显低于生理盐水灌注的高糖高脂小鼠血管组织ICAM-1mRNA水平。

采用Western Blot技术分别检测CD44灌注的高糖高脂小鼠和生理盐水灌注的高糖高脂小鼠的血管组织中NF-κB(p65)及磷酸化NF-κB(p-p65)的蛋白水平。其中，WesternBlot技术的检测步骤包括：清洗玻璃板；配胶；电泳；转膜；封闭；一抗孵育，其中一抗NF-κB(p65)及磷酸化NF-κB(p-p65)(均购自美国Cell Signaling Technology公司)；孵育二抗(购自美国Cell Signaling Technology公司)；显影。并采用ChemiDoc

图7中的A图为生理盐水灌注的高糖高脂小鼠和CD44灌注的高糖高脂小鼠组的血管组织p-p65的western-blot图，其中，p65为内部参照，黑色面积表示血管组织p-p65和p65的含量，黑色面积越大，则小鼠的血管组织中p65的含量越多，道尔顿(KD)为原子质量单位。图7中的B图为生理盐水灌注的高糖高脂小鼠和CD44灌注的高糖高脂小鼠组的血管组织p-p65蛋白水平柱形对比图。使用Image Lab软件(Bio-Rad)标出黑色面积大小，然后使用Graph Prism 8.0软件(GraphPad Software,San Diego,CA)进行统计学分析以及绘柱形图，其中，横轴表示组别，纵轴表示p-p65的蛋白水平(以p65为参照)，柱形顶端的横线表示p-p65水平的标准差，图中最上方的横线及星号表示将横线所覆盖的两组进行比较，具有统计学意义。

从图7中可以看出，CD44灌注的高糖高脂小鼠处理组血管组织p-p65的蛋白水平明显低于生理盐水灌注的高糖高脂小鼠血管组织p-65的蛋白水平。

采用RT-PCR技术分别检测CD44灌注的高糖高脂小鼠组和生理盐水灌注的高糖高脂小鼠血管组织中TNF-αmRNA的表达水平，结果如图8所示。CD44灌注的高糖高脂小鼠血管组织的TNF-α的mRNA水平明显低于生理盐水灌注的高糖高脂小鼠血管组织TNF-αmRNA水平。

采用RT-PCR技术分别检测CD44灌注的高糖高脂小鼠组和生理盐水灌注的高糖高脂小鼠血管组织中NLRP3 mRNA的表达水平，结果如图9所示。CD44灌注的高糖高脂小鼠血管组织的NLRP3的mRNA水平明显低于生理盐水灌注的高糖高脂小鼠血管组织NLRP3 mRNA水平。

实施例五、小鼠给予脂联素处理实验

在本实施例中，如无特别说明，采用的各试验材料与其它实施例相同，即相同的购买来源、相同的商品名称、相同的组分等。

一、APPL1介导脂联素抑制血管内皮炎症试验

1、小组模型建立

实验分为六组：

C57BL/6小鼠对照组：普通饲料喂养10周，生理盐水灌注2周，剂量为0.25ug/g/day，通过微量泵持续输注14天，共5只小鼠。

C57BL/6小鼠高糖高脂喂养组：高糖高脂饲料喂养10周，生理盐水灌泵2周，剂量为0.25ug/g/day，通过微量泵持续输注14天，共5只小鼠。

C57BL/6小鼠高糖高脂喂养并给予脂联素处理组：高糖高脂饲料喂养10周，脂联素(拟购自Peprotech公司)的剂量为0.25ug/g/day，通过微量泵持续输注14天，共5只小鼠。

APPL1-/-基因敲除小鼠对照组：APPL1-/-基因敲除鼠(购自中国赛业生物科技有限公司)普通饲料喂养10周，生理盐水微量泵灌注，剂量为0.25ug/g/day，微量泵持续输注14天，共5只小鼠。

APPL1-/-基因敲除小鼠高脂高糖喂养组：APPL1-/-基因敲除鼠高糖高脂饲料喂养10周，生理盐水微量泵灌注，剂量为0.25ug/g/day，微量泵持续输注14天，共5只小鼠。

APPL1-/-小鼠高糖高脂喂养并给与脂联素处理组：高糖高脂饲料喂养10周，脂联素的剂量为0.25ug/g/day，通过微量泵持续输注14天，共5只小鼠。

使用分析天平称重每一种模型鼠体重，图10为上述6种模型鼠体重的柱形对比图。其中，横轴表示组别，纵轴表示小鼠体重，**表示C57BL/6小鼠高糖高脂喂养组与C57BL/6小鼠对照组相比，其体重升高，具有统计学差异。##表示C57BL/6小鼠高糖高脂喂养并给予脂联素处理组与C57BL/6小鼠高糖高脂喂养组相比，两组之间体重有差异。&&表示APPL1-/-小鼠高糖高脂喂养并给与脂联素处理组与C57BL/6小鼠高糖高脂喂养并给予脂联素处理组之间相比，两组之间体重有差异。

从图10可以看出，高脂高糖饲料喂养小鼠体重增加，脂联素(APN)处理可以降低体重。

2、解剖

造模成功后，对空腹4-5小时后各组的小鼠使用异氟烷进行气体麻醉处理，待麻醉后，皮肤消毒开腹，迅速打开小鼠胸腔，心尖取血，大约1ml，置于离心管。生理盐水灌流后充分打开小鼠胸腹腔，剥离多余组织，充分暴露主动脉血管，在体式显微镜下充分分离血管周围组织后，将血管放入液氮中速冻，随后将组织放入-80℃冰箱中待用。

3、抑制血管内皮炎症试验

使用葡萄糖测定试剂盒(购自中国中生北控生物科技有限公司)，按照试剂盒说明，将10ml葡萄糖氧化酶和90ml磷酸缓冲液90ml混合均匀，即为工作液；将标准品进行系列梯度稀释，在比色杯中各加入标准品和小鼠血液样本0.01ml，工作液1.5ml，混匀，37℃保温10分钟，使用酶标仪在波长505nm处检测吸光度。图11为上述6种模型鼠血糖的柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示小鼠空腹血糖，**表示C57BL/6小鼠高糖高脂喂养组与C57BL/6小鼠对照组相比，其血糖升高，具有统计学差异。##表示C57BL/6小鼠高糖高脂喂养并给予脂联素处理组与C57BL/6小鼠高糖高脂喂养组相比，两组之间血糖有差异。&&表示APPL1-/-小鼠高糖高脂喂养并给与脂联素处理组与C57BL/6小鼠高糖高脂喂养并给予脂联素处理组之间相比，两组之间血糖有差异。从图2可以看出，高脂高糖饲料喂养小鼠的血糖增加，脂联素处理可以降低小鼠血糖。

采用RNA-seq技术分析检测脂联素处理后C57BL/6小鼠血管组织炎症通路的变化，其中RNA-seq技术的检测步骤包括：提取血管组织RNA；PCR扩增；测序；质量控制；数据与处理。图12为RNA-seq分析差异表达基因Pathway分析图，其中，横轴表示富集程度FDR值大小，纵坐标表示不同通路，图中横坐标FDR值越大，表示差异富集越明显。从图12可以看出，富集通路中炎症通路明显富集。

采用R语言编程技术(3.6.0版)，使用Pheatmap包以条件(P≤0.05)对13个差异基因(从上述富集通路中筛选出)进行绘图分析，如图13所示，图标从下到上浅灰色变为深灰色表示差异基因表达下调和上调。从左到右每三个竖框代表一组样本，分别是正常对照组血管组织炎症相关基因的差异表达、高糖高脂小鼠血管组织炎症相关基因的差异表达、脂联素处理的高糖高脂小鼠血管组织炎症相关基因的差异表达。从图13可以看出，高糖高脂饲料喂养小鼠促进了小鼠血管炎症反应，而脂联素处理可以抑制血管炎症反应。

由于RNA-seq技术是高通量测序技术，其结果存在一定的不准确性，所以结果需要RT-PCR进行验证，由此证明脂联素抑制血管内皮炎症反应。

采用RT-PCR技术分别检测血管组织炎症因子表达情况，其中，RT-PCR技术的检测步骤包括：提取RNA，反转录，PCR扩增，并通过Graph prism8.0(GraphPad Software,SanDiego,CA)进行统计学分析。

如图14所示，A为C57BL/6小鼠对照组、C57BL/6小鼠高糖高脂喂养组、C57BL/6小鼠高糖高脂喂养并给予脂联素处理组、APPL1-/-小鼠高糖高脂喂养并给与脂联素处理组血管组织的ICAM-1mRNA水平柱形对比图，其中，**表示C57BL/6小鼠高糖高脂喂养组与C57BL/6小鼠对照组相比，以C57BL/6小鼠对照组血管组织ICAM-1的mRNA水平为1，两组之间ICAM-1的mRNA水平有差异。##表示C57BL/6小鼠高糖高脂喂养并给予脂联素处理组与C57BL/6小鼠高糖高脂喂养组相比，以C57BL/6小鼠高糖高脂喂养组血管组织ICAM-1的mRNA水平为1，两组之间ICAM-1的mRNA水平有差异。&&表示APPL1-/-小鼠高糖高脂喂养并给与脂联素处理组与C57BL/6小鼠高糖高脂喂养并给予脂联素处理组之间相比，以C57BL/6小鼠高糖高脂喂养并给予脂联素处理组血管组织ICAM-1的mRNA水平为1，两组之间ICAM-1的mRNA水平有差异。横轴表示组别，纵轴表示ICAM-1的mRNA水平，柱形顶端的横线表示ICAM-1的标准差，具有统计学意义。图14中的B、C、D图中，横轴均表示组别，纵轴分别表示TNF-α、IL-1β、NLRP3的mRNA水平。

从图14中可以看出，C57BL/6小鼠高糖高脂喂养组小鼠血管组织中ICAM-1、TNF-α、IL-1β、NLRP3的mRNA水平明显高于C57BL/6小鼠对照组mRNA水平。然而，C57BL/6小鼠高糖高脂喂养并给予脂联素处理组血管组织中ICAM-1、TNF-α、IL-1β、NLRP3的mRNA水平明显低于C57BL/6小鼠高糖高脂喂养组小鼠，并且脂联素的作用是与APPL1相关的。

采用Western Blot技术分别检测C57BL/6小鼠对照组、C57BL/6小鼠高糖高脂喂养组、C57BL/6小鼠高糖高脂喂养并给予脂联素处理组、APPL1-/-基因敲除小鼠对照组、APPL1-/-基因敲除小鼠高脂高糖喂养组、APPL1-/-小鼠高糖高脂喂养并给与脂联素处理组6组模型鼠小鼠血管组织ICAM-1的蛋白水平，其中，Western Blot技术的检测步骤包括：清洗玻璃板；配胶；电泳；转膜；封闭；一抗孵育，其中一抗为ICAM-1(购自美国Abcam公司)；孵育二抗(购自美国Abcam公司)；显影，并采用ChemiDoc

如图15所示，A图为C57BL/6小鼠对照组、C57BL/6小鼠高糖高脂喂养组、C57BL/6小鼠高糖高脂喂养并给予脂联素处理组、APPL1-/-基因敲除小鼠对照组、APPL1-/-基因敲除小鼠高脂高糖喂养组、APPL1-/-基因敲除小鼠高糖高脂喂养并给予脂联素处理组6组样本血管组织ICAM-1的western-blot图，其中，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)即内部参照，黑色面积表示血管组织ICAM-1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的含量，黑色面积越大，则小鼠的血管组织中ICAM-1的含量越多，道尔顿(KD)为原子质量单位。B图为C57BL/6小鼠对照组、C57BL/6小鼠高糖高脂喂养组、C57BL/6小鼠高糖高脂喂养并给予脂联素处理组、APPL1-/-基因敲除小鼠对照组、APPL1-/-基因敲除小鼠高脂高糖喂养组、APPL1-/-基因敲除小鼠高糖高脂喂养并给与脂联素处理组6组样本血管组织ICAM-1的蛋白水平柱形对比图，使用Image Lab软件(Bio-Rad)标出黑色面积大小，然后使用Graph Prism 8.0软件(GraphPad Software,San Diego,CA)进行统计学分析以及绘柱形图。其中，横轴表示组别，纵轴表示ICAM-1的蛋白水平(以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为参照)，柱形顶端的横线表示ICAM-1蛋白水平的标准差，图中最上方的横线及星号表示将横线所覆盖的两组进行比较，具有统计学意义。

从图15可以看出，高脂喂养的小鼠血管组织中ICAM-1的蛋白水平明显高于正常对照小鼠血管组织中ICAM-1的蛋白水平，而脂联素灌注的糖尿病小鼠的ICAM-1蛋白水平被抑制，脂联素的这种作用是依赖APPL1的。

实施例六、人脐静脉内皮细胞实验--脂联素抑制血管炎症反应的机制

1：

人脐静脉内皮细胞购自国家科技资源共享服务平台北京协和细胞中心，细胞以1x10

收集细胞，采用细胞组分分离试剂盒(购自德国QIAGEN公司，Qproteome CellCompartment Kit)，按照试剂盒说明分离细胞胞膜、胞质和胞核部分，步骤如下：

(1)溶解蛋白酶抑制剂溶液，裂解液，及萃取缓冲液；

(2)溶解后将蛋白酶抑制剂加入到裂解液及缓冲液中；

(3)将细胞悬液转移到15ml离心管中，500g，4℃离心10min，弃上清；

(4)将细胞沉淀悬浮于2ml预冷的PBS中，混匀，500g，4℃离心10min，弃上清；

(5)重复步骤(4)；

(6)将细胞沉淀悬浮于1ml预冷的裂解液中，4℃孵育10min；

(7)离心机以1000g的离心力，4℃离心10min；

(8)将上清液转移至新的离心管中，冰上放置，此蛋白既为胞浆蛋白；

(9)将细胞沉淀悬浮于1ml预冷的缓冲液CE2中，4℃孵育30min；

(10)以6000g的离心力，4℃离心10min；

(11)将上清液转移至新的离心管中，冰上放置，此蛋白既为胞膜蛋白；

(12)加7μl

(13)加入500μl预冷的缓冲液，充分混匀，4℃孵育10min；

(14)以6800g的离心力，4℃离心10min；

(15)将上清液转移至新的离心管中，冰上放置，此蛋白既为胞核蛋白；

采用Western Blot技术分别检测空白对照组、15分钟刺激组、30分钟刺激组、60分钟刺激组、90分钟刺激组和120分钟刺激组APPL1的蛋白分布水平，其中，Western Blot技术的检测步骤包括：清洗玻璃板；配胶；电泳；转膜；封闭；一抗孵育，其中一抗为APPL1(购自美国Cell Signaling Technology公司)；孵育二抗(购自美国Abcam公司)；显影，并采用ChemiDoc

图16为空白对照组、15分钟刺激组、30分钟刺激组、60分钟刺激组、90分钟刺激组和120分钟刺激组APPL1的蛋白分布水平的western-blot图，黑色面积表示细胞APPL1含量，黑色面积越大，则细胞组分APPL1的含量越多，道尔顿(KD)为原子质量单位。图16中第一条Western blot条带为APPL1在胞膜中的分布图，第二条Western blot条带为APPL1在胞质中的分布图，第三条Western blot条带为APPL1在胞核中的分布图。

从图16中可以看出，脂联素以时间依赖的方式促进APPL1入核。

分别对空白对照组、60分钟刺激组和120分钟刺激组人脐静脉内皮细胞进行激光共聚焦扫描，观察APPL1在细胞内的分布情况，即将细胞培养基吸净，每孔加入300μl PBS清洗；用4％的多聚甲醛，室温固定20min；用PBS室温漂洗三次，每次5min；用5％BSA室温封闭20min；甩掉封闭液，加入抗APPL1抗体，4℃孵育过夜；用PBS室温漂洗三次，每次5min；加入Cy5标记的二抗，37℃避光孵育1h；用PBS室温漂洗三次，每次5min；加入DARQT5染色液，室温作用5min；用PBS室温漂洗三次，每次5min；防荧光淬灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜下观察并采集图像，得到图17。

图17中第一行为空白对照组细胞的激光共聚焦染色图，第二行为60分钟刺激组细胞的激光共聚焦染色图，第三行为120分钟刺激组细胞的激光共聚焦染色图，图中点状灰色表示APPL1蛋白，尺寸较大的圆形斑状表示细胞核部分。从图17中可以看出，脂联素以时间依赖的方式促进APPL1入核。

采用RNA-seq技术分析检测脂联素以APPL1依赖的方式激活相关转录因子，其中RNA-seq技术的检测步骤包括：提取血管组织RNA；PCR扩增；测序；质量控制；数据与处理，得到图18。

如图18所示，图标-1到1从下到上表示差异基因表达下调和上调。从左到右每三个框代表一组样本，分别是正常对照组血管组织转录因子相关基因的差异表达、高糖高脂小鼠血管组织转录因子相关基因的差异表达、脂联素处理的高糖高脂小鼠血管组织转录因子相关基因的差异表达、APPL1-/-基因敲除鼠高糖高脂喂养并给予脂联素处理血管组织转录因子相关基因的差异表达。

从图18可以看出，高糖高脂抑制了部分转录因子富集，而脂联素促进转录因子TCF/LEF富集，此过程是与APPL1相关的。

2：

人脐静脉内皮细胞以1x105/ml的密度接种于六孔板，将上述人脐静脉内皮细胞分为空白对照组、高脂高糖培养基刺激组、高脂高糖培养基+脂联素刺激组、敲降siAPPL1(购自苏州吉玛基因有限公司)+高脂高糖培养基+脂联素刺激组，其中，高脂高糖培养基刺激72小时，脂联素刺激24小时。空白对照组使用普通培养基，其成分包含内皮细胞培养基(购自美国ScienCell公司)+10％胎牛血清(购自德国Life technologies公司)+1％抗生素Penicillin-Streptomycin(购自美国Thermo Fisher Scientific)；高糖高脂培养基成分包含4.5g/L D-葡萄糖培养基(购自德国Life technologies公司)+5％高脂工作液(0.01397g棕榈酸钠和1g牛血清白蛋白溶于10ml磷酸液缓冲液PBS制成工作液)+10％胎牛血清(购自德国Life technologies公司)+1％抗生素Penicillin-Streptomycin(购自美国Thermo Fisher Scientific)。

采用转录因子激活分析板阵列II(购自Signosis，Sunnyvale，CA)来分析HUVEC细胞中转录因子的活性。如图19所示，图标从下到上(-2—2)表示差异基因表达下调和上调。从左到右每三个框代表一组样本，分别是空白对照组转录因子相关基因的差异表达、高脂高糖培养基刺激组转录因子相关基因的差异表达、高糖高脂培养基+脂联素刺激组转录因子相关基因的差异表达、敲降APPL1+高糖高脂培养基并给予脂联素处理血管组织转录因子相关基因的差异表达。

从图19可以看出，高糖高脂抑制了部分转录因子激活，而脂联素促进转录因子激活，此过程是与APPL1相关的。

与图19人脐静脉内皮细胞分组一致，采用人转录因子(拟购自美国Qiagen)分析HUVEC细胞中转录因子的mRNA水平。其步骤详见名词解释“人转录因子检测试剂盒”。

如图20所示，A图为人脐静脉内皮细胞空白对照组、高脂高糖培养基刺激组的散点图，其中位于三条直线上方的点(直线左侧)表示与正常对照组相比，高脂高糖上调转录因子的mRNA水平；直线上黑色点表示正常对照组和高脂高糖刺激组转录因子mRNA水平无差异；直线下方的点(直线右侧)表示与正常对照组相比，高糖高脂下调转录因子的mRNA水平，标注TCF7L2表示符合高脂高糖抑制其的mRNA水平。B图为人脐静脉内皮细胞高脂高糖培养基刺激组、高脂高糖培养基+脂联素刺激组的散点图，其中位于三条直线上方的点(直线左侧)表示与高糖高脂培养基刺激组相比，脂联素上调转录因子的mRNA水平；直线上黑色点表示高脂高糖刺激组和高脂高糖+脂联素刺激组转录因子mRNA水平无差异；直线下方的点(直线右侧)表示与高脂高糖刺激组相比，脂联素下调转录因子的mRNA水平，标注TCF7L2表示符合脂联素促进其的mRNA水平。C图为人脐静脉内皮细胞高脂高糖培养基+脂联素刺激组、敲降APPL1+高脂高糖培养基+脂联素刺激组的散点图，其中位于三条直线上方的点(直线左侧)表示与高糖高脂培养基+脂联素刺激组相比，敲降APPL1+高脂高糖培养基+脂联素刺激组上调转录因子的mRNA水平；直线上黑色点表示高脂高糖培养基+脂联素刺激组和敲降APPL1+高脂高糖培养基+脂联素刺激组转录因子mRNA水平无差异；直线下方的点(直线右侧)表示与高脂高糖培养基+脂联素刺激组相比，敲降APPL1+高脂高糖培养基+脂联素刺激组下调转录因子的mRNA水平，标注TCF7L2表示符合脂联素促进其mRNA水平。

3：

人脐静脉内皮细胞以1x105/ml的密度接种于六孔板，将上述人脐静脉内皮细胞分为空白对照组、高脂高糖培养基刺激组、高脂高糖培养基+脂联素刺激组、敲降siAPPL1(拟购自苏州吉玛基因有限公司)+高脂高糖培养基+脂联素刺激组、敲降siAPPL1(拟购自苏州吉玛基因有限公司)+高脂高糖培养基，其中，高脂高糖培养基刺激72小时，脂联素刺激24小时。

收集细胞，采用Western Blot技术分别检测空白对照组、高脂高糖培养基刺激组、高脂高糖培养基+脂联素刺激组、敲降siAPPL1+高脂高糖培养基+脂联素刺激组、敲降siAPPL1+高脂高糖培养基培养基中CD44的蛋白分布水平，其中，Western Blot技术的检测步骤包括：清洗玻璃板；配胶；电泳；转膜；封闭；一抗孵育，其中一抗为APPL1(购自美国CellSignaling Technology公司)；孵育二抗(购自美国Abcam公司)；显影，并采用ChemiDoc

如图21所示，A图为空白对照组、高脂高糖培养基刺激组、高脂高糖培养基+脂联素刺激组、敲降siAPPL1+高脂高糖培养基+脂联素刺激组、敲降siAPPL1+高脂高糖培养基的蛋白分布水平的western-blot图，其中，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)即内部参照，黑色面积表示细胞CD44和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的含量，黑色面积越大，则细胞组分CD44的含量越多，道尔顿(KD)为原子质量单位。B图为空白对照组、高脂高糖培养基刺激组、高脂高糖培养基+脂联素刺激组、敲降siAPPL1+高脂高糖培养基+脂联素刺激组、敲降siAPPL1+高脂高糖培养基细胞CD44的蛋白水平柱形对比图，使用Image Lab软件(Bio-Rad)标出黑色面积大小，然后使用Graph Prism 8.0软件(GraphPad Software,San Diego,CA)进行统计学分析以及绘柱形图，其中，横轴表示组别，纵轴表示CD44的蛋白水平(以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为参照)，柱形顶端的横线表示CD44蛋白水平的标准差，图中最上方的横线及星号表示将横线所覆盖的两组进行比较，具有统计学意义。

从图21可以看出，脂联素以APPL1依赖的方式促进CD44蛋白的表达。

内皮细胞培养后提取RNA，采用Real-time PCR技术分别检测空白对照组、高脂高糖培养基刺激组、高脂高糖培养基+脂联素刺激组、敲降siCD44+高脂高糖培养基+脂联素刺激组观察炎症因子的mRNA水平，得到图22。

如图22所示，A图为空白对照组、高脂高糖培养基刺激组、高脂高糖培养基+脂联素刺激组、敲降siCD44高脂高糖培养基+脂联素刺激组TNF-αmRNA水平柱形对比图，其中，**表示高脂高糖培养基刺激组与空白对照组相比，以空白对照组TNF-α的mRNA水平为1，两组之间TNF-α的mRNA水平有差异。##表示高脂高糖培养基+脂联素刺激组与高脂高糖培养基刺激组相比，以高脂高糖培养基刺激组TNF-α的mRNA水平为1，两组之间TNF-α的mRNA水平有差异。&&表示敲降siCD44高脂高糖培养基+脂联素刺激组与高脂高糖培养基+脂联素刺激组之间相比，以高脂高糖培养基+脂联素刺激组TNF-α的mRNA水平为1，两组之间TMF-α的mRNA水平有差异。横轴表示组别，纵轴表示TNF-α的mRNA水平，柱形顶端的横线表示TNF-α的标准差，具有统计学意义。图22中的B图、C图、D图与A图表示一致，横轴均表示组别，纵轴分别表示IL-1β，ICAM-1，NLRP3的mRNA水平。

从图22中可以看出，脂联素抑制血管炎症反应的作用是与CD44相关的。

4：

采用上述方法建立小组模型：C57BL/6小鼠对照组、C57BL/6小鼠高糖高脂喂养组、C57BL/6小鼠高糖高脂喂养并给予脂联素处理组、APPL1-/-基因敲除小鼠对照组、APPL1-/-基因敲除小鼠高脂高糖喂养组、APPL1-/-小鼠高糖高脂喂养并给与脂联素处理组6组模型采用Western Blot技术分别检测6组模型鼠小鼠血管组织CD44的蛋白水平，得到图23。

如图23所示，A图为6组样本血管组织CD44的western-blot图。B图为6组样本血管组织CD44的蛋白水平柱形对比图，使用Image Lab软件(Bio-Rad)标出黑色面积大小，然后使用Graph Prism 8.0软件(GraphPad Software,San Diego,CA)进行统计学分析以及绘柱形图。其中，横轴表示组别，纵轴表示CD44的蛋白水平(以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为参照)，柱形顶端的横线表示CD44蛋白水平的标准差，图中最上方的横线及星号表示将横线所覆盖的两组进行比较，具有统计学意义。

从图23可以看出，小鼠血管组织脂联素以APPL1依赖的方式促进CD44蛋白的表达。

实施例七：病人血清中脂联素、CD44水平对比实验

在首都医科大学附属北京市安贞医院连续收集初诊为糖尿病的患者，根据中国糖尿病诊断标准：①空腹血糖(FPG)≥7.0mmol；②有典型糖尿病症状(多尿、多饮和不能解释的体重下降)者，任意血糖≥11.1mmol/L。符合上述标准之一即可诊断为糖尿病。排除标准为①肾脏疾病、嗜铬细胞瘤、原发性醛固酮增多症等继发性高血压；②重度心律失常；③中、重度心功能不全；④活动性肝脏功能障碍，或者查体发现ALT或AST>3倍正常上限；⑤恶性疾病：肿瘤；⑥贫血；⑦急、慢性炎症疾病：包括风湿性关节炎、类风湿关节炎等。将剩余的其中74位糖尿病患者作为观察组。

在同一医院体检中心进行健康体检且血糖正常的人群中随机选取30位受试者作为正常对照组。采集血脂、血糖、血常规等多项检验指标，并仔细询问心血管疾病、肝肾疾病等疾病病史以及家族史等情况。

所有入选患者，空腹8-10小时之后，静脉采取10ml血液样本，3000rpm，10分钟进行离心后，抽取血清，冻存于-80冰箱。

采用高灵敏度酶联免疫吸附测定法(ELISA)(试剂盒购自Cat#8B5D6EB29B,Cloud-Clone Corp)分别测定观察组患者及正常对照组受试者的血清中脂联素的含量。酶联免疫吸附法测定试剂盒中脂联素已预先包被于96孔微孔板中，形成固相载体。向微孔中加入标准品及标本，其中脂联素与包被于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化标记的脂联素抗体，将未结合的生物素化的抗体洗净后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素，再次洗涤后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的脂联素浓度呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(O.D.值)，得出标准曲线后，根据标准曲线计算样品中脂联素浓度，并采用SPSS软件(IBM Corp.,Armonk,NY,USA)进行统计学分析，得出图24。

图24为观察组患者和正常对照组受试者血清中脂联素含量的柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示脂联素的含量(ng/ml)，柱形上方的横线表示脂联素含量的标准差，星号表示此实验及实验结果具有统计学意义。可以看出，观察组患者血清中的脂联素的含量明显低于正常对照组受试者血清中脂联素的含量，所以，糖尿病患者的血清中脂联素的表达水平具有显著降低，脂联素在糖尿病患者中被抑制。

图25为观察组患者和正常对照组受试者血清中CD44含量的柱形对比图，其中，横轴表示组别，纵轴表示CD44的含量(ng/ml)，柱形上方的横线表示CD44含量的标准差，星号表示此实验及实验结果具有统计学意义。可以看出，观察组患者血清中的CD44的含量明显低于正常对照组受试者血清中CD44的含量，所以，糖尿病患者的血清中CD44的表达水平具有显著降低，CD44在糖尿病患者中被抑制。

图26为糖尿病患者血清CD44和脂联素的相关分析图，其中，横轴表示血清中CD44水平，纵轴表示血清中脂联素的含量，使用SPSS软件求出相关系数r＝0.259,p＝0.0247,当p小于0.05时，两者之间具有相关性。可以看出，糖尿病患者血清脂联素水平和CD44水平之间有相关性。

以上已经描述了本申请的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。本申请的范围由所附权利要求来限定。