一种高效筛选木薯同源四倍体的方法

摘要

本发明属于农业繁殖技术领域，具体公开了一种高效筛选木薯同源四倍体的方法。本发明高效筛选木薯同源四倍体的方法包括以下步骤：(1)离体诱导多倍体植株：采用秋水仙素对木薯单个腋芽的茎段进行诱导后继续培养，得培养植株；(2)初步筛选：通过叶片形态差异进行筛选；(3)继代培养：对初筛植株进行扩繁；(4)干旱处理：采用PEG‑6000对扩繁得到的植株进行处理；(5)二次筛选：通过植株的成活情况以及叶片形态进行筛选；(6)四倍体鉴定：采用流式细胞仪进行鉴定。本发明的筛选方法通过诱导后的叶片形态初筛结合PEG‑6000处理后的成活率和叶片形态复筛，可将诱导植株中的四倍体植株有效筛选出来，筛选效率高、效果好。

说明书

【技术领域】

本发明涉及农业繁殖技术领域，具体涉及一种高效筛选木薯同源四倍体的方法。

【背景技术】

木薯是三大薯类作物之一，既可食用，也可用于榨取酒精和淀粉，是重要的工业原料。但传统木薯种植中优质木薯品种缺乏、良种覆盖率较低，已经无法满足国内生产发展的需要，因此，选育高产稳产的优质品种至关重要。

目前，多倍体育种是改善植物性状和选育经济性状优良新品种的有效方法之一，对于木薯来说，秋水仙素诱导是获得多倍体材料的主要方法之一，但是目前秋水仙素诱导获得木薯同源四倍体的筛选方法通常为以下两种：一是通过多次段截分离结合叶片观察进行多倍体筛选(例如中国发明专利申请CN102239800A三倍体木薯品种的选育方法)，二是通过多次继代培养对诱导产生的倍性嵌合体进行分离之后筛选四倍体(例如中国发明专利申请CN104094853A一种木薯多倍体的诱导方法)，以上两种方法的筛选程序或者判断指标单一，筛选效果差，且需要经过多次培养分离，筛选周期长，筛选基数大，耗费大量人工和物力。

【发明内容】

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种高效筛选木薯同源四倍体的方法。本发明的筛选方法通过诱导后的叶片形态初筛结合PEG-6000处理后的成活率和叶片形态复筛，可有效将诱导植株中的二倍体植株、倍性嵌合体植株筛除而准确筛选出木薯同源四倍体植株，木薯同源四倍体植株筛选效率高、效果好。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种高效筛选木薯同源四倍体的方法，包括以下步骤：

(1)离体诱导木薯多倍体：取生长状态一致的无菌木薯组培苗，切成带单个腋芽的茎段，将茎段转接到含有秋水仙素的培养基中，然后放置于震荡仪上，在90-100r/min、27℃的条件下避光震荡培养，48h后将茎段取出，用无菌水冲洗之后吸干水分，然后接种至半固体培养基中培养，得培养植株；

(2)初步筛选：通过植株的叶片形态从所述培养植株中进行筛选，即得初筛植株；

(3)继代培养：将所述初筛植株进行编号然后进行继代培养增殖，在继代增殖过程中挑选植株叶片表型一致的植株进行下一次继代增殖，得增殖植株；

(4)干旱处理：将所述增殖植株切成带单个腋芽的茎段，将不同编号的所述增殖植株的茎段分别接种于含10％PEG-6000的MS培养基中，培养20d后取出用无菌水冲洗之后吸干水分，然后再接种于含5％PEG-6000的MS培养基中继续培养10d，得处理植株组；

(5)二次筛选：通过植株的的成活情况以及叶片形态从所述处理植株组中进行筛选，即得四倍体植株组；

(6)四倍体鉴定：采用流式细胞仪对所述四倍体植株组进行鉴定。

进一步的，步骤(1)中，所述秋水仙素的浓度为0.05-0.07mg/L，所述半固体培养基的成分包括MS、0.05mg/L6-BA、0.02mg/L NAA、20g/L蔗糖和6.3g/L琼脂。

进一步的，步骤(2)中，所述初筛植株的叶片形态为：叶尖钝化、变圆且叶面积变大，叶片厚度相对较厚，叶片颜色浓绿。

进一步的，步骤(4)中，在培养期间进行光照处理，且光周期为正常光照12h和黑暗12h。

进一步的，步骤(5)中，所述四倍体植株组的成活情况为：成活率超过60％。

进一步的，步骤(5)中，所述四倍体植株的叶片形态为：叶片浓绿且叶尖边缘变圆。

本申请所用的木薯品种为新选048，由广西农业科学院经济作物研究所提供，并以组织培养技术获得的无菌健康组培苗为试验材料。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

申请人于前期大田实验发现，木薯同源四倍体材料相对于二倍体材料具有更好的抗旱性能，申请人基于此特性结合木薯四倍体的外形特征，提供了一种高效的木薯同源四倍体筛选方法，可以有效缩短木薯同源四倍体的筛选时间，筛选效率高且筛选效果好。其中，先通过叶片形态差异对诱导得到的植株进行筛选，将具有或疑似具有四倍体叶片形态的植株筛选出来，再利用四倍体植株所具有较好的抗旱性能，对初筛得到的植株进行干旱胁迫处理，然后再通过每组植株的成活率结合叶片形态进行二次筛选，即可准确将四倍体植株从所有诱导植株中准确筛选出来，经过流式细胞仪的验证，本申请筛选得到的植株100％为木薯同源四倍体植株，筛选效果好、效率高，且筛选得到木薯同源四倍体植株健壮、生长效果好，利于后续木薯同源四倍体的扩繁培育。

【具体实施方式】

下面将结合具体实施例来对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种高效筛选木薯同源四倍体的方法，包括以下步骤：

(1)离体诱导木薯多倍体：取生长状态一致的无菌木薯组培苗，切成带单个腋芽的茎段，将茎段转接到含有浓度为0.05mg/L的秋水仙素的MS培养基中，然后放置于震荡仪上，在90r/min、27℃的条件下避光震荡培养，48h后将茎段取出，用无菌水冲洗之后吸干水分，然后接种至半固体培养基中培养，得培养植株；所述半固体培养基的成分为MS+0.05mg/L6-BA+0.02mg/L NAA+20g/L蔗糖+6.3g/L琼脂；

(2)初步筛选：通过植株的叶片形态进行筛选，从所述培养植株中筛选出叶尖钝化、变圆且叶面积变大、叶片厚度相对较厚、叶片颜色浓绿的植株，即得初筛植株；

(3)继代培养：将所述初筛植株进行编号然后进行继代培养增殖，在继代增殖过程中挑选植株叶片表型一致的植株进行下一次继代增殖，增殖2次之后，得增殖植株；

(4)干旱处理：将所述增殖植株切成带单个腋芽的茎段，将不同编号的所述增殖植株的茎段分别接种于含10％PEG-6000的MS培养基中，培养20d后取出用无菌水冲洗之后吸干水分，然后接种于含5％PEG-6000的MS培养基中继续培养10d，得处理植株组；在培养期间进行光照处理，且光周期为正常光照12h和黑暗12h，正常光照强度为1800lx；

(5)二次筛选：通过所述处理植株组的成活情况以及叶片形态进行筛选，从中筛选出成活率超过60％、叶片浓绿且叶尖边缘变圆的植株组，即得四倍体植株组；

(6)四倍体鉴定：采用流式细胞仪对所述四倍体植株组进行鉴定。

实施例2

一种高效筛选木薯同源四倍体的方法，包括以下步骤：

(1)离体诱导木薯多倍体：取生长状态一致的无菌木薯组培苗，切成带单个腋芽的茎段，将茎段转接到含有浓度为0.06mg/L的秋水仙素的MS培养基中，然后放置于震荡仪上，在95r/min、27℃的条件下避光震荡培养，48h后将茎段取出，用无菌水冲洗之后吸干水分，然后接种至半固体培养基中培养，得培养植株；所述半固体培养基的成分为MS+0.05mg/L6-BA+0.02mg/L NAA+20g/L蔗糖+6.3g/L琼脂；

(2)初步筛选：通过植株的叶片形态进行筛选，从所述培养植株中筛选出叶尖钝化、变圆且叶面积变大、叶片厚度相对较厚、叶片颜色浓绿的植株，即得初筛植株；

(3)继代培养：将所述初筛植株进行编号然后进行继代培养增殖，在继代增殖过程中挑选植株叶片表型一致的植株进行下一次继代增殖，增殖2次之后，得增殖植株；

(4)干旱处理：将所述增殖植株切成带单个腋芽的茎段，将不同编号的所述增殖植株的茎段分别接种于含10％PEG-6000的MS培养基中，培养20d后取出用无菌水冲洗之后吸干水分，然后接种于含5％PEG-6000的MS培养基中继续培养10d，得处理植株组；在培养期间进行光照处理，且光周期为正常光照12h和黑暗12h，正常光照强度为1800lx；

(5)二次筛选：通过所述处理植株的成活情况以及叶片形态进行筛选，从中筛选出成活率超过60％、叶片浓绿且叶尖边缘变圆的植株组，即得四倍体植株组；

(6)四倍体鉴定：采用流式细胞仪对所述四倍体植株组进行鉴定。

实施例3

一种高效筛选木薯同源四倍体的方法，包括以下步骤：

(1)离体诱导木薯多倍体：取生长状态一致的无菌木薯组培苗，切成带单个腋芽的茎段，将茎段转接到含有浓度为0.07mg/L的秋水仙素的MS培养基中，然后放置于震荡仪上，在100r/min、27℃的条件下避光震荡培养，48h后将茎段取出，用无菌水冲洗之后吸干水分，然后接种至半固体培养基中培养，得培养植株；所述半固体培养基的成分为MS+0.05mg/L6-BA+0.02mg/L NAA+20g/L蔗糖+6.3g/L琼脂；

(2)初步筛选：通过植株的叶片形态进行筛选，从所述培养植株中筛选出叶尖钝化、变圆且叶面积变大、叶片厚度相对较厚、叶片颜色浓绿的植株，即得初筛植株；

(3)继代培养：将所述初筛植株进行编号然后进行继代培养增殖，在继代增殖过程中挑选植株叶片表型一致的植株进行下一次继代增殖，增殖2次之后，得增殖植株；

(4)干旱处理：将所述增殖植株切成带单个腋芽的茎段，将不同编号的所述增殖植株的茎段分别接种于含10％PEG-6000的MS培养基中，培养20d后取出用无菌水冲洗之后吸干水分，然后接种于含5％PEG-6000的MS培养基中继续培养10d，得处理植株组；在培养期间进行光照处理，且光周期为正常光照12h和黑暗12h，正常光照强度为1800lx；

(5)二次筛选：通过每组所述处理植株的成活情况以及叶片形态进行筛选，从中筛选出成活率超过60％、叶片浓绿且叶尖边缘变圆的植株组，即得四倍体植株组；

(6)四倍体鉴定：采用流式细胞仪对所述四倍体植株组进行鉴定。

效果验证：

1.干旱处理条件对筛选效果的影响

实验组：实施例1；

对照组1-4：对照组1-4与实验组的区别仅在于：步骤(3)干旱处理中，分别用含1％PEG-6000的MS培养基、含5％PEG-6000的MS培养基、含10％PEG-6000的MS培养基、含15％PEG-6000的MS培养基持续培养30d，且光周期相同；

对照组5：对照组5与实验组的区别仅在于：步骤(3)干旱处理为：先采用含5％PEG-6000的MS培养基培养20d，然后用含10％PEG-6000的MS培养基继续培养10d，光周期相同；

对照组6：对照:6与实验组的区别仅在于：步骤(3)干旱处理为：先采用含15％PEG-6000的MS培养基培养20d，然后用含5％PEG-6000的MS培养基继续培养10d，光周期相同。

以上每组开始均选80根茎段先进行诱导处理，然后进行初步筛选，在本次实验中，实验组和对照组1-6经过初步筛选所得到的初筛植株数量分别为24株、24株、23株、24株、23株、23株和24株；将上述各组得到的疑似四倍体的初筛植株编号后进行2次继代培养扩繁，然后将继代培养得到的增殖植株切成带单个腋芽的茎段(每个编号均取40根茎段)，将不同编号的所述增殖植株的茎段分别接种于培养基中进行相应的干旱处理，干旱处理之后，筛选出成活率(成活率＝每一编号的成活茎段/40根茎段)超过60％、叶片浓绿且叶尖边缘变圆的植株组，记为二次筛出植株组，而不符合成活率和叶片形态要求的植株组记为筛掉植株组,其中一个植株组就对应于一株初筛植株。采用流式细胞仪对二次筛出植株中任意1株萌发植株进行鉴定，验证筛选结果是否准确，同时也对上述各组的筛掉植株组中任意1株萌发植株进行鉴定，检查在筛掉的植株组中是否有四倍体植株组，具体鉴定方法如下：

使用德国Partec公司生产的流式细胞仪，取待测植株1平方厘米大小的幼嫩叶片于小塑料皿中，加入0.5mLPartec HR-A缓冲液，用单面刀片将叶片切碎后放置3min，加入0.5mL HR-B染液，通过微孔过滤器过滤到2.5mL小试管中，上样测定。DNA含量的分布曲线由流式细胞仪自动生成，若得到的图谱中DNA含量的峰值出现在100即可确认为四倍体植株，鉴定结果见下表1：

表2各组实验植株筛选结果

由表1可知，实验组和对照组3的筛选准确率均为100％，说明在该干旱条件和筛选条件下，木薯同源四倍体筛选准确率最高，均为100％；对照组1、对照组2和对照组5中筛出植株组中有不是四倍体植株组的，而对照组4和对照组6的筛掉植株组中有遗漏的四倍体植株组，说明这3组的干旱处理条件不佳，筛选准确率不高，筛选效果差。

在该实验的基础上，进一步将实验组和对照组3的确认的四倍体植株组与各自的空白对照组(即各组中采用同株剪切得到的茎段进行无PEG-6000对照培养，即放在没有PEG-6000的培养基中培养)进行对照，分别对比各组植株的相对地下鲜重(筛选得到的四倍体植株的单株地下鲜重/各自空白对照植株的单株地下鲜重)，结果见表2：

表2各组植株生长情况

由表2可知，相对地下鲜重越高，说明植株越健壮、生长状态越好，由此可知，虽然对照组3的干旱条件也可以准确进行四倍体植株的筛选，但是筛选得到的植株状态相对实验组来说较差，不利于后续植株的扩繁。

2.二次筛选中成活率对筛选效果的影响

按实施例2方法中的步骤(1)-(4)进行操作之后，对步骤(4)干旱处理后得到的处理植株组(共为24组)按以下三个标准进行二次筛选：

一是以成活率超过60％、叶片浓绿且叶尖边缘变圆为标准进行筛选，记为实验组；

二是以成活率超过55％、叶片浓绿且叶尖边缘变圆为标准进行筛选，记为对照组1；

三是以成活率超过65％、叶片浓绿且叶尖边缘变圆为标准进行筛选，记为对照组2。

各组筛选出来的植株组记为筛出植株组(记录相应的编号)，不符合筛选标准的植株组记为筛掉植株组(记录相应的编号)。

先采用流式细胞仪对干旱处理后的所有植株组进行四倍体验证之后，记录确认为四倍体的植株组编号，然后将实验组、对照组1和对照组2筛出植株组中和筛掉植株组中相应的编号与验证出来的四倍体植株组编号进行比对，即可掌握各组的四倍体筛选结果，结果见下表3：

表3各组植株四倍体筛选结果

由表3可知，当二次筛选的成活率要求为大于60％时，四倍体筛选的准确率为100％，而当二次筛选的成活率要求大于55％时，由于成活率要求低，会导致筛出的植株组中混有变异的二倍体或嵌合体，而当二次筛选的成活率要求大于65％时，又会因为成活率要求过高，导致一些四倍体植株被误筛掉，从而降低筛选结果的准确率，综上可知，在该干旱处理条件下，以成活率为超过60％进行筛选的准确率最高。

3.与其它现有筛选方法的筛选结果比较

实验组：本发明实施例3中；

对照组:中国发明专利申请CN104094853A一种木薯多倍体的诱导方法。

采用流式细胞仪对实验组步骤(4)获得的植株(植株组总数为13组)和对照组(3)获得的组培苗(植株组总数为28组)进行验证，同时统计各组整个筛选流程多耗费时间，结果见下表4：

表4不同筛选方法对四倍体筛选的结果比较

由表4可知，本申请相对于现有的木薯同源四倍体筛选方法，不仅筛选周期短，而且筛选准确率明显提升，此外，由于本申请仅进行2次继代培养，相对于现有技术的4-6次继代培养来说，筛选基数明显降低，从而降低了筛选工作量。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。