AtZHD8基因在促进植物根组织变为绿色茎状组织中的应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体为拟南芥ZHD家族转录因子

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及拟南芥ZHD家族转录因子

背景技术

转基因技术是指利用DNA重组、转化等技术将特定的外源目的基因转移到受体生物中，并使之产生可预期的、定向的遗传改变。转基因技术被称为“人类历史上应用最为迅速的重大技术之一”。转基因技术与传统育种技术有两点不同：第一，传统技术一般只能在生物种内个体上实现基因转移，而转基因技术不受生物体间亲缘关系的限制，可打破不同物种间天然杂交的屏障，扩大可利用基因的范围；第二，传统的杂交和选择技术一般是在生物个体水平上进行，操作对象是整个基因组，不可能准确地对某个基因进行操作和选择，对后代的表现预见性较差。而转基因技术所操作和转移的一般是经过明确定义的基因，功能清楚，后代表现可准确预期。

现有技术中，以转基因技术获得共表达ZHD1和REM7的诱导型共表达转基因株系，通过外源施加雌二醇进行诱导，使拟南芥超量表达ZHD1和REM7，此时拟南芥根部发育出绿色茎状组织，而单独诱导超表达ZHD1或者REM7，则不会出现绿色茎状组织。与本发明中技术方案相比，现有方案转基因载体构建较为复杂，并需要外源刺激进行目的蛋白诱导表达，增加了实验成本。

发明内容

本发明的目的在于提供

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

所述植物为拟南芥。

具体是在拟南芥中过表达ZHD8可促进根部形成绿色茎状组织。具体包括

本发明的优点在于：

1、转录因子ZHD8超表达可控制植物根发育出绿色茎状组织；

2、此绿色茎状组织仅通过单基因ZHD8超表达即可实现。

附图说明

图1 蛋白免疫印迹验证ZHD8超表达电泳结果。其中，上图为以野生型Col-0为对照，在转基因株系里鉴定到ZHD8的蛋白表达，下图为蛋白样品丽春红染色结果，以此为参考可以对转基因株系里ZHD8蛋白表达水平进行比较。

图2 超表达ZHD8使拟南芥根部发育出绿色茎状组织。其中A是培养箱中生长3天的幼苗；B是持续生长7天的ZHD8超表达株系。

具体实施方式

实施例1

一、At

1. 以拟南芥野生型Col-0的cDNA为模板扩增ZHD8 基因。

此全长基因组序列内编码区序列（以大写字母表示）不含内含子（一般情况下，启动子序列、非编码区序列以及内含子序列以小写字母表示），因此可直接以gDNA为模板进行基因扩增。本方案中本着严谨负责的态度，依然提取RNA，并反转录出cDNA，以cDNA为模板进行了基因的扩增。全长基因组序列的相关信息亦可在拟南芥官网seqviewer.arabidopsis.org进行搜索。

植物总RNA提取

本提案中采用植物总RNA提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，Ltd.，Beijing，China）制备来自拟南芥野生型Col-0的总RNA。具体操作步骤如下：

（1）匀浆处理:50 mg拟南芥叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450 μl RL（操作前在RL中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml RL中加入10 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配），涡旋剧烈震荡混匀。

（2）将所有溶液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000 rpm 离心3min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。

（3）缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇（通常为225 μl），混匀（此时可能会出现沉淀），将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中， 12,000 rpm离心60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

（4）向吸附柱CR3中加入350 μl 去蛋白液RW1，12,000 rpm离心60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

（5）DNase I 工作液的配制：取10 μl DNase I 储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μl RDD溶液，轻柔混匀。

（6）向吸附柱CR3中央加入80 μl的DNase I 工作液，室温放置15 min。

（7）向吸附柱CR3中加入350 μl 去蛋白液RW1， 12,000 rpm离心60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

（8）向吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min，12,000 rpm离心60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

（9）重复步骤8。

（10）12,000 rpm离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

（11）将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50 μl RNase-Free ddH

制备cDNA

得到的 RNA 用逆转录酶进行反转录后，得到相应的 cDNA

（1）采用GoScript TM逆转录系统（Promega Biotech，Co.，Ltd.，Beijing，China）用1μg总RNA合成第一链cDNA。具体如下：使用前将每种组分混合并短暂离心。混合以下内容：

总RNA 1.0 μg

引物Oligo（dT）15 1.0 μl

无核酸酶水 X μl

最终体积 5.0 μl

（2）在70℃加热5分钟。立即将冰水冷却至少5分钟。在微量离心机中离心10秒钟。存放在冰上直至添加逆转录混合物。

（3）制备逆转录反应混合物，每个cDNA反应15μl；按照顺序在冰上添加。

（4）将15μl逆转录混合物与5μl RNA和引物混合物混合。

（5）在25℃的加热块中退火5分钟。

（6）在42℃的加热块中延伸长达一小时。

（7）在70℃的加热块中逆转录酶15分钟。

载体构建

1.3.1 PCR 反应液的配制

注：引物序列如下：ZHD8-F：ATGGATGTAATAGCTACTAC，ZHD8-R：TCACGTCGAAGAAAACGACC。

反应条件

预变性：98℃ 30 sec；变性：98℃ 10 sec，退火：55℃ 15 sec，延伸：68℃ 10sec，30 Cycles；终延伸：68℃ 10 min。

加A反应

在上述PCR反应产物中加入1µl TaKaRa r Taq 酶 72℃处理30 min。将PCR产物连接到pEntry (Gateway entry vector) 载体中，获得pEntry-T载体，随后通过测序确认，测序公司博尚 (中国福州)。

载体使用方法如下：

（1）用XcmI限制性内切酶消化pEntry-T质粒，（2）电泳胶回收，（3）用T4 DNA连接酶连接加A反应产物和胶回收的产物，（4）转化Dh5α感受态细胞，（5）LB培养基培养18小时后挑单克隆，（6）提取质粒，（7）PCR鉴定并测序。

质粒提取

质粒提取采用天根质粒小提试剂盒进行提取，具体操作步骤试剂盒如下：

（1）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl的平衡液BL，12,000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）。

（2）取1-5 ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm离心1 min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

（3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

（4）向离心管中加入250 μl溶液P2，温和地上下翻转8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段 。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5 min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

（5）向离心管中加入350 μl溶液P3，立即温和地上下翻转8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000 rpm离心10 min。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

（6）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000 rpm离心60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

（7）可选步骤：向吸附柱CP3中加入500 μl去蛋白液PD，12,000 rpm离心60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。

（8）向吸附柱CP3中加入600 μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

（9）重复操作步骤8。

（10）将吸附柱CP3放入收集管中, 12,000 rpm离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

（11）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μl洗脱缓冲液EB，室温放置2 min，12,000 rpm离心2 min将质粒溶液收集到离心管中。

构建最终基因超表达载体

通过TA反应将PCR片段克隆到pEntry中，然后通过LR反应与目的载体pEarleyGate104载体（35S：N-YFP）重组获得pEarleyGate104-ZHD8质粒（35S∷YFP-ZHD8）。重新提取质粒，并采用电击转化法将载体转化到农杆菌菌株GV3101中。

电击转化法

该方法步骤如下：

（1）在-80℃冷库中取出农杆菌感受态细胞（GV3101），置于冰上，直至完全解冻。

（2）取1 μl待转化质粒加入解冻后的GV3101中，轻柔混合，置于冰上20 min，使待转质粒与感受态细胞充分接触。

（3）取出电极杯，将质粒与感受态细胞的混合物加入电击杯，然后放入电转仪进行电转。

（4）将电转完成的混合液从电极杯中移至含有1 ml无抗LB液体培养基中，然后置于28℃恒温摇床中培养2小时，以活化GV3101细胞。

（5）离心沉淀菌株，7000 rpm，1 min。用移液枪吸出部分上清液，将余下上清和菌株混合均匀，取适量菌液涂在添加抗性的固体LB培养基上。放于28℃培养箱中培养约48 h。

（6）取出培养基后利用菌落PCR检测目的片段是否插入，挑选正确克隆为后续实验做准备，并且保存菌株（-80℃）。

二、

2.1 植物培养

花序浸染实验使用的是拟南芥野生型（Col-0）植株。将Col-0种子4℃春化两天后播种在营养土中，5天后移去盖子保持植株的正常生长。植物在恒温光照培养室（温度为22℃，日照16 h）中培养。

花序浸染

（1）从-80℃取出存储载体的菌株（GV3101），使用划线法在抗性培养基上活化农杆菌细胞（28℃培养箱，约48 h），再小摇农杆菌（28℃摇床，约24 h），取小摇菌液2 ml加入200ml 液体LB抗性培养基中过夜培养至菌液OD值为0.5。LB液体培养基中加入抗生素：卡那霉素，利福平，庆大霉素。

（2）收集菌体，将200 ml的菌体培养液在室温下离心，5000 rpm，10 min。

（3）再用普纯水重悬菌体沉淀，离心5000 rpm，10 min。用以除去LB液体培养基内的抗生素，残余抗生素可能会影响植株生长。

（4）准备5% 浓度的蔗糖溶液，200 ml。

（5）用5% 浓度的蔗糖溶液重悬菌体沉淀。

（6）将重悬液倒在烧杯内，然后加入去垢剂（Sliwet-77）50 μl。

（7）将植物花序全部浸入上述混合液，等待40 s。

（8）将浸染过后的植株置于黑暗中一天，用以抑制植物生长，利于农杆菌浸染。

（9）将植物放置在正常条件下培养，继续生长。

（10）一周后再次浸染。

（11）待种子成熟后，收集种子，此时为T1代。

3、转基因植株筛选

pEarelyGate104 构建的表达载体pEarleyGate104-ZHD8质粒转入拟南芥后，使拟南芥具有Basta的抗性，不含有该表达载体的植株施用Basta后会死亡。

（1）将收集的T1种子，均匀撒入营养土中。4℃条件下春化两天，再将植物放入培养室中正常条件培养。大约一周时间，待植物长出两片真叶时喷洒Basta稀释液（10%的Basta原液稀释1000倍），每两天喷一次，一共三到四次。对存活下来的植物进行蛋白水平检测，待T1代植物的种子成熟后，收集种子标记为T2代。

（2）配制含有Basta的1/2 MS培养基，将T2代种子种植在该筛选培养基上。 5-6天后统计植株存活率，待存活率为75%的植株（即符合3：1的分离比）成熟后收集种子标记为T3。

（3）将T3代种子种植在含Basta的1/2 MS培养基上。5-6天后统计植株存活率，存活率为100%的植株即为纯和转基因植株。

三、Western Blot检测转基因株系蛋白表达

Western Blot（蛋白免疫印迹）是常用到的检测蛋白表达水平的方法。本提案中在筛选出T1代阳性植株时即取阳性株系莲座叶进行蛋白表达量检测。

具体操作步骤如下：

3.1.1 蛋白样品的制备

蛋白质易降解，所有提取蛋白质的操作都应在冰上低温进行。

（1）取适量新鲜植物叶片或其他组织（50 mg），称取重量并记录。取好的样品放入液氮内速冻。

（2）将材料磨成粉末。

（3）向研磨好的植物材料粉末中加入重量数值2倍大小体积的2×SDS LoadingBuffer（例如：a mg的材料需加入2a μl的2×SDS Loading Buffer），剧烈涡旋震荡，混合均匀。

（4）将上述样品放置在95℃金属浴中，加热10 min。

（5）离心，12000 rpm，10 min。

（6）将上清转移到新的 EP管中。

注：蛋白样品需存储在-80℃条件下。

制备蛋白胶（SDS-PAGE）

（1）按需求组装制胶板

（2）分离胶的制备

根据蛋白大小选择分离胶（10%），每块胶约10 ml，按以下配比配制：

混合完成后，灌胶，再加入1 ml异丙醇液封，等待分离胶凝固，约30 min。

（3）浓缩胶的配置

分离胶凝固后弃掉异丙醇，再用蒸馏水洗3-4次，然后配制浓缩胶。每块分离胶需对应配置浓缩胶约3 ml，浓度为5%，按以下配比配制：

混合好后灌胶，然后根据需要插入合适孔数的梳子，等待浓缩胶凝固。

点样

待浓缩胶凝固后拔掉梳子，向电泳仪的槽内倒1×SDS Tank Buffer，然后向孔中注入蛋白样品。

电泳

调节初始电压为80 V，约30-40 min，保证所有样品离开浓缩胶进入分离胶后，提高电压至140 V。最后根据蛋白大小和溴酚蓝指示带的位置判断是否需要结束电泳。

转膜（PVDF膜）

本提案中采用的转膜方法是半干转，由半干转转膜仪（Bio-Rad）进行，将蛋白质从蛋白胶转移至PVDF膜，具体的操作步骤如下：

（1）根据胶的大小准备好厚滤纸（厚约3 mm）和PVDF膜，PVDF膜需放入甲醇中激活，约1min后取出PVDF膜，浸泡入转膜液中。

（2）将裁剪好的厚滤纸浸泡在转移缓冲液中。

（3）将完全浸湿的厚滤纸取出，平铺在转膜仪的内槽中，用滚轮来回碾压滤纸赶出气泡。

（4）取出PVDF膜，将其覆盖在滤纸上，用滚轮碾压赶走气泡。PVDF膜大小应该略大于滤纸，以防发生短路现象。

（5）将蛋白胶盖在PVDF膜上，注意要赶走气泡（注意不要弄破蛋白胶）。

（6）再将一块厚滤纸覆盖在蛋白胶上，注意要赶走气泡。

（7）扣合电极板与内槽，然后放进转膜仪，设定仪器程序，设置电流为1.3 A（限流），电压为25 V（恒压），时间设置为10 min。

封闭

封闭液为5%浓度的脱脂奶粉，溶剂为1×PBST，涡旋混匀。取出已完成转膜的PVDF膜，放入干净塑料方皿中，加封闭液。置于摇床上，室温下封闭1 h，或4℃封闭过夜。

孵育一抗

封闭结束后，丢弃封闭液。根据所用载体选择合适抗体。本提案中，采用的是YFP标签，因此使用抗GFP鼠源抗体。一张PVDF膜孵育10 ml抗体稀释液即可。量取0.5 g脱脂奶粉，加入适量1xPBST，震荡涡旋混匀后定容至10 ml，然后按照1:1000的稀释度加入一抗，混匀后即为抗体稀释液。将一抗稀释液倒入塑料方皿中，置于摇床上2h，或4℃条件下过夜孵育。

一抗孵完后需要回收。用1×PBST将PVDF膜清洗3次，每次10 min。

孵育二抗

量取10 ml的1×PBST，加入0.5 g脱脂奶粉，震荡涡旋混匀，然后按照1:5000的比例加入二抗(羊抗鼠)，混匀。将二抗稀释液倒入塑料方皿中，置于摇床上室温孵育1 h。

二抗孵完后，回收二抗，用1×PBST将PVDF膜清洗5次，每次10 min。

曝光

曝光使用的是AI600 蛋白成像系统，打开仪器后，当AI600软件的指示信号为绿色时便可以使用。将准备好的显影液（Thermo），按照1:1混匀，均匀滴加到膜上，最后放入仪器中并且可根据需求选择曝光时间。

染色

染色之前先用蒸馏水清洗两遍PVDF膜，再用丽春红染液染色1-2 min，后用蒸馏水清洗2-3次，拍照记录。

转基因植株蛋白鉴定结果

如图1所示，Basta筛选的阳性苗经蛋白免疫印迹鉴定出超表达株系（图中仅为部分株系）。图中以野生型Col-0为对照，在两个BASTA筛选的阳性转基因株系中鉴定到了ZHD8蛋白的表达，以丽春红染色为参照，确定转基因株系中ZHD8蛋白表达量的高低，即在上样量一致的情况下，免疫印迹自显影的条带越亮，表达量越高。

四、纯合转基因植株表型观察

将筛选出的纯合转基因植株种子均匀点在1/2培养基上，4℃春化3天，再将植物放入培养箱中（22℃，全日照），竖直培养。

定期观察植株表型，并记录。

观察发现部分ZHD8超表达植株根部发育出绿色茎状组织。如图2中，A是培养箱中生长3天的幼苗，可明显看到位于下胚轴下部本应发育白色根系组织的部位发育出了绿色茎状组织（shoot stem-like green organs，SSOs)，图中以黑色箭头指示SSO所在位置；B是持续生长7天的ZHD8超表达株系，可看到SSO持续存在并在其下发育出了正常的根组织，图中以白色箭头指示SSO所在位置。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> AtZHD8基因在促进植物根组织变为绿色茎状组织中的应用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3779

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tctctcatat gtgttacgca aaacagacaa gtaacagtct gagataatgt tttcccggcc 60

cgttataaac tcatcgaata atgggccaac attctaagcc tcaggctctg gcccgtcaac 120

gcggctagat ccgttcattg aatcagaaac atatttatcc tatcgggttt aaaatttcaa 180

ttaaaatttc aaacataaat ttctctcata ttatcatata tggacgaacc agctttgttt 240

ttggcataat gtgaaatcaa gagccaactt gttttagcca ttaaagtttc ctcaaatact 300

tctcaagttg ccatgcacat caatatttag tttttgaatt attattttct tgtaatttta 360

cacattccta ttcaaaaaca atacaattaa aataaaatca tttcgtttat aacacaaaaa 420

aaggaagaag aagatgtcat tgtttttttc tttattcaca aatcttaaga acagtccata 480

ttaatgcata ctaaccaccc atgcgataca ttcatcgtat atgataaatc cttccaattg 540

catttgcaca catacataaa gtaggatatg tgtatatata aaacatatac aggcataaca 600

tataatagat tttagaaaga aagaaaaaat cacagataga tcatcaaata attgcgtcag 660

ataatatatc ctgaaaaaaa aaaactaatt aatattatcc ttgttatggg cataaagctt 720

atttaatgtc ggtttgcctt attcttccta actaaagagt aaaaagcctt ataactattt 780

ctaaaacaat aatatatgtg ttatattatt ttgttgtcta tgaaatctat agataatcgt 840

agtgcggtaa caataagacc aatcaacaat caagttatat ctaaatgctt gaaatgttga 900

tacggtggtt ccctattttg gctatggtaa gtcgtgcaag tcgtaatata tacctacatt 960

aattaaagta taatgttaaa gttcaatgta tttgagaaga agagaattgt cttccataac 1020

agacgaacat ggtttgatta ggtagcgcca tgttgcaaga tatgtacgcg tgttagctgt 1080

ttttggtatt tagacaattt catatcatca ttagtcaaaa gaaagaaaaa gttttaagag 1140

ttgagattta caattacgtt actactataa gaaaacagac gacattttag aaacccgtta 1200

aaattcaaaa ttttgacgga gaattcaacc gttggattta gagcatcaaa attaaaactt 1260

ccataaaatt tgtctgaatt ttttgataaa atttatcggt catattttag caaatctcct 1320

aaaaaaattg gtatactatc aattatttat ggagtttttg ctttgaattg ttagtttatc 1380

acttattatt agtaatggat ttgcaaacga tcttaggttt ggtctacacc tctctgatta 1440

aagacttttt tatacagctt taaagaagtt tggagtaaac ggcatcgttc ttcaccactg 1500

ctcgtgtcag cttttttagt tgtggtctcc ttttcttaag gccactttaa ccgtcaacat 1560

gtatagtcaa taaacatttt tgagttaatt agtggagtag ttgagaagta aataaattaa 1620

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gatagttttt tcgacataag attgaagaca aaccatgaac tataaaacta gggaaggtcg 1740

agattttaac atttttggat aaacattgct tttgatcaac aatacgaaat attaactttt 1800

gtctttagtt aacatcattg aatcaacaac ccgaatcaac cttaattata ttcatgcttt 1860

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ttgtttttcg aaaccctaaa tgttttgagt tgtcatggat gtaatagcta ctacaactac 2580

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tcacgcttta gacggatgcg gcgagtttat gccgtcaccg tcgtttaact ccaatgaccc 2820

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tgacgtggtg gttaaggagt tttgtcggga gattggagtt gataaaagcg ttttcaaagt 3240

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ttatctttgt tagagaggtg atttgagttg tatctttcga ccaaatgtga gaagaaagat 3600

aaatgagtaa cctcctaaaa ccgaataaca aagtcaatta atccaattgt tttctaaatt 3660

ctatatcagt ttgctttttt atttttactt tttttcttta tatagaaatt tatgaaagaa 3720

atgagggaat ttgttgcaat tatgtgacat tactagattt ttaacccgcg gtataccgc 3779

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcacgtcgaa gaaaacgacc 20