基于全基因组测序筛选的与广西麻鸡体尺和屠宰性状相关的CNV分子标记组合及应用

摘要

本发明提供了基于全基因组测序筛选的与广西麻鸡体尺和屠宰性状相关的CNV分子标记组合，共包括45个CNV分子标记，它们的信息如表2和表3所示，这些CNV分子标记组合可用于广西麻鸡的分子标记辅助育种，在早期直接在基因组水平上选育个体，不依赖表型信息，可显著提高选择效率，加快育种进程，节省中间饲养费用，提高了育种效率，降低了育种成本，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及基于全基因组测序筛选的与广西麻鸡体尺和屠宰性状相关的CNV分子标记组合及应用。

背景技术

中国是世界上最丰富的家禽遗传资源之一，广西优质肉鸡产业规模居全国第二位，是广西畜牧业中规模化、产业化程度最高的优势产业之一，是广西农业的支柱产业，特点突出、优势明显。广西具有丰富的地方鸡种质资源，广西麻鸡是被列入中国家禽品种资源志的广西地方鸡品种之一，广西麻鸡又名灵山香鸡、里当鸡，原产于广西壮族自治区灵山县、合浦县、浦北县等地，属肉蛋兼用型地方品种。广西麻鸡的特征可概括为“一麻、两细、三短”。一麻是指母鸡体羽以棕黄麻羽为主，两细是指头细、胫细，三短是指颈短、体躯短、胫短。公鸡头昂尾翘，片状羽，羽色以棕红为主，其次为棕黄色或红褐色。广西麻鸡具有耐粗饲、善飞翔、觅食能力强等特点。

尽管有着繁多的优质鸡品种素材，但受到生产方面的局限，如饲养环境，品种类型，营养水平等遏制了优质鸡产业的高速发展。而品种类型则占据优质鸡产业经济的主导地位。从育种发面而言，地方鸡种的种质资源所能带来的经济效益是巨大的，并且地方鸡种有着非常大的开发潜力，前景开阔。所以对广西麻鸡进行选育，符合我国对优质鸡选育的意义和要求，挖掘地方鸡优质性状的基因，保护地方种质资源，扩大地方鸡品种优良基因，以及新品种的培育。同时补充我国优质鸡广西麻鸡的种质资源，具有重要的生产意义。

利用传统的选育方法，国内外已经成功地培育了大量的畜禽品种。但是，传统育种主要凭借育种经验依据表型对后代进行选择，无法对目标基因的基因型进行直接选择，因此，选育耗时长，表型的测量复杂，选择效率和准确性较低。目前，将分子生物学技术应用于育种中，可在分子水平上进行育种，通过分子标记辅助育种或遗传修饰育种(转基因育种)，可以大大提高育种的选择效率，缩短选育时间。通过有效利用分子标记辅助育种，可以加快广西麻鸡在体尺相关性状上的选育进程，提高生产应用的价值。

遗传变异是影响表型变化的主要原因，基因组学研究是解释表型变异的分子机制策略之一。基因组变异主要来源于单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)上，基因组上除了SNP变异之外，还有染色体大片段的改变，如结构变异(StructureVariants， SVs)，拷贝数变异(Copy Number Variation,CNV)等，这些变异在染色体上占的比例比 SNP要大得多。随着对基因组研究的深入，越来越多的证据表明结构多态性在表型多样性中起着重要作用，而另外一种变异类型，即CNV，正在成为许多物种表型变异的重要贡献者。由于CNV可能影响基因表达，因此CNV可能占该物种广泛表型变异的很大一部分。因为现有的SNP研究和基因分型方法倾向于不包含这些更复杂的遗传变异，CNV将成为以SNP为中心的全基因组关联研究的重要补充。

研究地方品种基因组CNV对地方遗传资源的保护和对优良性状的开发利用奠定理论基础。广西麻鸡是广西优良的地方品种，也是广西开发利用得较好的地方品种之一。广西麻鸡在形成、开发利用过程中，哪些CNV发生了变化，是值得研究的科学问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供基于全基因组测序筛选的与广西麻鸡体尺和屠宰性状相关的CNV分子标记组合。

本发明的另一个目的在于提供上述CNV标记组合的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供与广西麻鸡体尺相关的CNV分子标记组合，由30个CNV分子标记组成，所述CNV分子标记的编号分别为：CNV-284、CNV-693、CNV-142、 CNV-657、CNV-304、CNV-660、CNV-668、CNV-263、CNV-534、CNV-220、CNV-217、 CNV-274、CNV-201、CNV-435、CNV-696、CNV-85、CNV-203、CNV-178、CNV-473、 CNV-581、CNV-149、CNV-393、CNV-286、CNV-377、CNV-82、CNV-594、CNV-227、 CNV-574、CNV-573、CNV-74，它们的信息如表2 所示，表2 中提供了每个CNV分子标记所在的染色体，其在染色体上的起始位置和终止位置、拷贝类型和效应变化值。

为了实现本发明目的，本发明还提供与广西麻鸡屠宰性状相关的CNV分子标记组合，由26个分子标记组成，所述CNV分子标记的编号分别为：CNV-682、CNV-394、CNV-660、CNV-393、CNV-668、CNV-693、CNV-203、CNV-220、CNV-574、CNV-681、CNV-304、 CNV-387、CNV-82、CNV-178、CNV-408、CNV-697、CNV-281、CNV-565、CNV-27、CNV-327、 CNV-491、CNV-509、CNV-274、CNV-183、CNV-261、CNV-601，它们的信息如表3 所示，表3 提供了每个CNV分子标记所在的染色体、其起始位置和终止位置、拷贝类型、效应变化值。

在表2 和表3 中：分子标记CNV-284、CNV-142、CNV-657、CNV-263、CNV-534、 CNV-217、CNV-201、CNV-435、CNV-696、CNV-85、CNV-473、CNV-581、CNV-149、 CNV-286、CNV-377、CNV-594、CNV-227、CNV-573、CNV-74与广西麻鸡的体尺相关；分子标记CNV-682、CNV-394、CNV-681、CNV-387、CNV-408、CNV-697、CNV-281、CNV-565、 CNV-27、CNV-327、CNV-491、CNV-509、CNV-183、CNV-261、CNV-601与广西麻鸡的屠宰性状相关；分子标记CNV-660、CNV-393、CNV-668、CNV-693、CNV-203、CNV-220、 CNV-574、CNV-304、CNV-82、CNV-178、CNV-274同时与广西麻鸡的体尺和屠宰性状都相关。

本发明还提供所述CNV分子标记组合在广西麻鸡分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供所述CNV分子标记组合在制备检测试剂盒中的应用。

本发明还提供利用分子生物学技术检测广西麻鸡CNV分子标记的方法，包括以下步骤：根据表2 和表3 中的CNV分子标记所在的染色体及其在染色体上的起始位置、终止位置，在鸡的基因组数据中查询到CNV分子标记对应的序列片段，在CNV分子标记片段中设计实时荧光定量PCR引物，分别进行实时荧光定量PCR扩增反应，根据实时荧光定量PCR扩增结果，计算出待测广西麻鸡CNV分子标记片段拷贝数。

其中，鸡的基因组数据为鸡第五版参考基因组数据，通过在线网站(Ensemble或UCSC) 查询到CNV分子标记对应的序列片段；Ensemble的网址为：

其中，根据实时荧光定量PCR扩增结果，利用2

ΔΔCt＝ΔCt(test)-ΔCt(reference)

NR＝2

其中，test表示待测样本；reference表示参考样本(目的区域没有拷贝数变异)；

当NR＞1.5时，表示重复；当NR＜0.5时，表示缺失；当0.5＜NR＜1.5时，表示正常；

采用ΔΔCt的方法来计算各样本中的拷贝数变异情况，具体方法是将每个样本的平均Ct 值减去对应样本的β-actin的平均Ct值得到各样本的ΔCt值，然后再以某一个样本作为参照样本作为参照，用其他样本的ΔCt值减去参照样本的ΔCt值得到各样本的ΔΔCt值，最后将每个样品相对参照样品的表达量表示为2

本发明还提供上述方法在广西麻鸡分子标记辅助育种中的应用。

通过以上技术方案，本发明的有益效果如下：

家禽的数量性状受多基因效应共同影响，传统育种对无法进行直接选择，导致了选择效率和准确性较低。本发明提供了与广西麻鸡体尺和屠宰性状相关的CNV分子标记组合，可用于广西麻鸡的分子标记辅助育种，在早期可以直接在基因组水平上选育个体，不依赖表型信息，显著提高选择效率和准确性，加快育种进程，节省中间饲养费用，提高了育种效率，降低了育种成本，具有广泛的应用前景。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中使用的动物、仪器、试剂、试剂盒均可由市售得到；

实施例1基于全基因组测序筛选广西麻鸡体尺和屠宰性状相关CNV分子标记

1.材料

1.1试验动物

282只广西麻鸡(公139只，母143只)，试验鸡群按标准的肉鸡饲养程序饲养在广西大学动物生产实习基地。

1.2仪器与设备

游标卡尺(型号为91512)，世达工具有限公司制造；电子天平，沈阳龙腾电子有限公司制造。高效多功能冷冻离心机，德国Eppendorf公司制造。

2.方法

2.1体尺和屠宰性状的测定

试验鸡于120日龄进行屠宰，参考中华人民共和国农业行业标准NY/T 823-2004测定体尺和屠宰性状的相关数据，体尺性状包括胫围、胫长、体斜长、龙骨长、髋宽、胸深、胸宽，屠宰性状包括胴体重、全净膛重、半净膛重、胸肌重、腿肌重。

2.2血液DNA的提取和基因分型

试验鸡120日龄时翅静脉窦采血，用ACD抗凝，然后置于-20℃保存，用于DNA提取。血液基因组DNA采用常规酚/仿法提取，经分光光度计检测和琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送于北京诺禾致源科技股份有限公司，并委托对DNA进行基因组二代测序。

2.3CNV的检测及质控

用DELLY软件的默认参数对广西麻鸡全基因组重测序数据进行CNV检测(DEL和DUP)，在进行关联分析前，需要将CNV进行质控，具体如下：

(1)剔除基因型检出率小于90％的个体；

(2)剔除CNV检出率小于90％的CNV；

(3)剔除频率小于3％的CNV；

(4)剔除哈代温伯格平衡检验中P值小于1×10

采用vcfaid软件对检测的CNV结果进行哈代温伯格平衡检验。

2.4表型统计

采用SAS 9.4软件MEANS过程对体尺、屠宰性状进行描述性统计。统计结果见表1 ：

表1 广西麻鸡体尺、屠宰性状描述性统计

注：标不同大写字母表差异极显著(P<0.01)。

2.5关联分析

利用GAPIT进行CNV的全基因组关联研究。在进行全基因CNV关联分析之前，利用SNP信息进行了群体结构检测，发现试验群体存在分层为了降低关联分析的假阳性或者假阴性结果，利用SNP的前5个主成分作为协变量进行群体的校正。由于本试验广西麻鸡群体为自然群体，缺少家系信息，因此选择基于SNP的亲缘关系矩阵作为家系效应加入到模型中。我们采用混合模型(Mixed liner model,MLM)作为关联分析的模型，如下所示：

Y＝Xβ+Zu+e,

式中，Y表示观察表型值向量，β为固定效应，包括性别,基于SNP标记的前5个主成分值和遗传标记。u是随机效应，来源于个体间加性遗传效应；X和Z是β和u的关联矩阵； e是随机残差效应向量。关联结果以P值小于0.05定义为显著。

在关联分析时对CNV进行分型，包括正常型(变异)、杂合型(缺失)、纯合型(重复)。Effect表示单个变异的对表型的影响。如果Effect为负，表示正常型<杂合型<纯合变异型。Effect为正表示正常型>杂合型>纯合变异型。

2.6基因注释

从ensembl数据库下载鸡第五版基因组注释信息的gtf文件，采用bedtools通过将结构变异区域和CNVR与所提取的基因位置信息进行相互映射，从而达到对结构变异区域和CNVR进行基因比对注释。采用ANNOVAR软件对关联显著的CNV周围区域进行基因注释。

3.结果

筛选出与广西麻鸡体尺和屠宰性状关联的45个CNV分子标记，这些位点的信息如表2 和表3 所示，它们分别与广西麻鸡的体尺和屠宰性状相关联，这些位点可以用于广西麻鸡体尺和屠宰性状的选育。在表2 和表3 中，DEL代表缺失，DUP代表重复，Chr代表该 CNV分子标记所在的染色体，Startposition表示该CNV分子标记在染色体上的起始位置，Endposition表示该CNV分子标记在染色体上的终止位置；MAF表示缺失或重复的频率；Effect表示单个变异对表型的影响。在广西麻鸡育种时，根据表2 和表3 提供的CNV分子标记组合信息，进入Ensembl基因组数据库中的的第五版参考基因组数据 (

ΔΔCt＝ΔCt(test)-ΔCt(reference)

NR＝2

其中，test表示待测样本；reference表示参考样本(目的区域没有拷贝数变异)；

当NR＞1.5时，表示重复；当NR＜0.5时，表示缺失；当0.5＜NR＜1.5时，表示正常。

以与广西麻鸡胫围相关的CNV分子标记CNV-284为例，结合表2 和表3 的信息分析个体可能会出现的性状，保留带有目的性状的个体，可以加快育种速度。

表2 与广西麻鸡体尺相关的CNV分子标记

注：CNV的位置信息参考ensembl鸡第五版参考基因组(Chicken(Gallus_gallus-5.0))。

表3 与广西麻鸡屠宰性状相关的CNV分子标记

注：CNV的位置信息参考ensembl鸡第五版参考基因组(Chicken(Gallus_gallus-5.0))。