一种基于DNA三棱柱结构构象变化靶向癌细胞的生物传感器

摘要

本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种基于DNA三棱柱结构构象变化靶向癌细胞的生物传感器。在检测之前，先构建DNA三棱柱纳米结构。然后改变反应溶液的pH值，使三棱柱纳米结构的构象发生改变。之后加入癌症标志物ATP，邻近反应使两个荧光基团靠近发生FRET，通过荧光光谱进行检测。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速、准确的定量检测。

说明书

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种基于DNA三棱柱结构构象变化靶向癌细胞的生物传感器。

背景技术

一种优秀的纳米结构应同时具备良好的成像和药物递送能力，才能在肿瘤诊断和治疗中发挥最大的应用价值。与外源材料相比，DNA具有良好的生物亲和性，是生物治疗和生物医学应用的主要材料。随着DNA纳米技术的发展，许多DNA纳米组装如DNA折纸、DNA四面体和DNA笼子已成功构建并应用于癌细胞靶向成像，但这些纳米结构稳定性过好，空间利用率低。因此迫切需要开发一种特异性强、结构可控的DNA纳米结构，用于靶细胞成像。

发明内容

为了提供一种特异性强、结构可控的DNA纳米结构，本发明利用三棱柱结构可调控的特点，在肿瘤细胞的酸性环境下特异性地形成i-motif结构，并合理修饰荧光基团，使得三棱柱纳米结构具备靶细胞成像的功能。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种靶向癌细胞成像的生物传感器，包括6条Oligo DNA：T1、T2、S1、S2、S3、S4，其序列如SEQ ID NO: 1-6所示；其中，S4的5’和3’端分别修饰FRET荧光标记基团对。

所述FRET荧光标记基团对选自CY3和CY5或FITC和Rhodamine。

一种上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）合成T1、T2、S1、S2、S3、S4；

（2）在含Mg

所述退火步骤为：在95℃保温10 min，逐渐冷却到室温。

所述缓冲液的pH为8.0-8.3；所述Mg

一种上述生物传感器在制备癌细胞成像试剂中的应用。

一种含有上述生物传感器的试剂盒。

本发明的检测原理如下：

本发明一共用到了6条DNA链，其序列（5’-3’）分别是：

T1:

GGACCCACATTTGCAATAACACATATCGGTTCAGTACTCTTCATCGTATTCGTGACTGC

T2:CTCAGCGCATTGCCTATATCTCAAGTCTTACGTATACAGTTAATGCTTACACCTCGAC

S1:CCCATT

S2:CCCATT

S3:CCCATT

S4:cy5-AATGGGATAGGGATAGGGATAGGGTAGA-cy3

其中，T1和T2构成三棱柱的两个底，分别与S1/S2/S3的“

当DNA三棱柱纳米结构处于酸性环境时，三棱柱的棱可以形成i-motif结构，释放S4链。S1、S2、S3的两端可以识别ATP形成夹子“工”形结构，与S4链的两端序列特异性结合，FRET荧光标记基团对邻近发生FRET，进而可特异性靶向癌细胞进行成像。

在检测之前，先构建DNA三棱柱纳米结构。然后改变反应溶液的pH值，使三棱柱纳米结构的构象发生改变。之后加入癌症标志物ATP，邻近反应使两个荧光基团靠近发生FRET，通过荧光光谱进行检测。

本发明具有以下优点：

本发明的生物传感器利用DNA三棱柱纳米结构的易变性和可操作性实现靶细胞的成像和治疗；利用癌细胞特有的酸性环境及高浓度ATP可以特异性地靶向目标细胞；利用两个荧光基团发生FRET，性质稳定，背景信号低；该传感器的反应条件温和，反应速度快；由于使用荧光法，其检测方法操作简便、检测周期短；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；制备方法简单，性能稳定，荧光检测的重复性好，适用于细胞靶向成像和生物传感器产业化的实际应用；制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

本发明基于DNA三棱柱纳米结构的构象变化，靶向癌细胞进行细胞成像和释药。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速、准确的定量检测。

附图说明

图1为本发明生物传感器的原理图；

图2为pH优化检测结果图；

图3为ATP浓度优化检测结果图；

图4为传感器对ATP的特异性；

图5为四种条件下的检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 三棱柱纳米结构的制备

（1）根据序列SEQ ID NO: 1-6合成T1、T2、S1、S2、S3、S4，其中，S4的5’和3’端分别修饰CY3和CY5；

以1×TAE溶液（pH 8.0，含10 mM Mg

（2）取灭菌EP管，分别加入5 μL的T1、T2、S1、S2、S3、S4溶液，灭菌水补至50 μL，95℃保温10 min，逐渐冷却到室温，退火获得含三棱柱纳米结构的溶液（10 µM）。

实施例2 检测pH条件的筛选

（1）配置缓冲液，含有MgAc

（2）将5 µL不同pH的缓冲液分别加入9个灭菌的EP管中，分别加入5 µL实施例1中含三棱柱纳米结构的溶液振荡30 s；

（3）再加入5 μL 10 mΜ ATP溶液，将离心管放在37℃的水浴箱中反应2 h；反应结束室温下用F-4600荧光光谱检测（激发波长525 nm，荧光发射光谱扫描范围550-750 nm，狭缝1 nm）；

以pH 4.5的缓冲液在667nm处的荧光强度为1，计算归一化荧光强度，结果见图2，从图中可以看出，检测到的荧光信号随着pH的浓度在8-5.5区间内增大，当pH达到5时，荧光信号趋于稳定，所以pH的最佳浓度为5。

实施例3 ATP浓度筛选

（1）将5 µL实施例2配制的pH 5的缓冲液分别加入12个灭菌的EP管中，分别加入5µL实施例1中含三棱柱纳米结构的溶液振荡30 s；

（2）再加入5 μL 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4、6、8、10 mΜ ATP溶液，将离心管放在37℃的水浴箱中反应2 h；反应结束室温下用F-4600荧光光谱检测（激发波长525 nm，荧光发射光谱扫描范围550-750 nm，狭缝1 nm）；

以ATP浓度为10 mM的试液在667 nm处的荧光强度为1，计算归一化荧光强度，结果见图3，从图中可以看出，检测到的荧光信号随着ATP的浓度在0-10 mM区间内增大而增大，当浓度达到10 mM后，荧光信号达到最大值，所以ATP的最佳浓度为10 mM。

实施例4 三棱柱纳米构型对检测影响

（1）将5 µL实施例2配制的pH 5的缓冲液分别加入5个灭菌的EP管中，然后分别加入5 µL实施例1中含三棱柱纳米结构的溶液振荡30 s；

（2）再加入5 μL 10 mΜ ATP溶液或浓度为1M的UTP、CTP、GTP，将离心管放在37℃的水浴箱中反应2 h；反应结束室温下用F-4600荧光光谱检测（激发波长525 nm，荧光发射光谱扫描范围550-750 nm，狭缝1 nm）；

以含有目标物ATP的试液在667 nm处的荧光强度为1，计算归一化荧光强度，结果见图4，从图中可以看出，只有在ATP存在的情况下才会产生明显的荧光信号。

实施例5 三棱柱纳米构型对检测影响

（1）将5 µL实施例2配制的pH 5、pH 8的缓冲液分别加入灭菌的EP管中，每种各2个，然后分别加入5 µL实施例1中含三棱柱纳米结构的溶液振荡30 s；

（2）再加入5 μL 10 mΜ ATP溶液，将离心管放在37℃的水浴箱中反应2 h；反应结束室温下用F-4600荧光光谱检测（激发波长525 nm，荧光发射光谱扫描范围550-750 nm，狭缝1 nm）；

以pH为8含有10 mM ATP的试液在667 nm处的荧光强度为1，计算归一化荧光强度，结果见图5，从图中可以看出，pH为5含有ATP的体系发生了明显的FRET，含有ATP pH为8及不含ATP的三个体系667 nm处荧光信号低，没有发生FRET，说明只有在酸性环境且ATP存在的情况下，三棱柱纳米构型能够发生相应变化，才能检测到FRET荧光信号，并对靶细胞进行特异性成像。

序列表

<110> 济南大学

<120> 一种基于DNA三棱柱结构构象变化靶向癌细胞的生物传感器

<130> 20201009

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> T1

<400> 1

ggacccacat ttgcaataac acatatcggt tcagtactct tcatcgtatt cgtgactgc 59

<210> 2

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> T2

<400> 2

ctcagcgcat tgcctatatc tcaagtctta cgtatacagt taatgcttac acctcgac 58

<210> 3

<211> 113

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> S1

<400> 3

cccattttaa ggaggaggct ttttatgtgg gtccgcagtc acgatttccc tatccctatc 60

cctatccctt tgcgctgagg tcgaggtgtt ttttgagggg gtcttaatct acc 113

<210> 4

<211> 110

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> S2

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<210> 5

<211> 110

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> S3

<400> 5

cccattttaa ggaggaggct ttttccgata tgtgttattg catttcccta tccctatccc 60

tatcccttag cattaactgt atacgttttt tgagggggtc ttaatctacc 110

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<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> S4

<400> 6

aatgggatag ggatagggat agggtaga 28