一种海绵来源链霉菌及其抑制己糖激酶II活性物质的制备和应用

摘要

本发明涉及微生物药物领域，具体为一种具有己糖激酶II抑制作用的海绵来源链霉菌及其抑制己糖激酶II活性物质的制备和应用。海洋链霉菌为Streptomyces sp.18A01，于2020年12月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC 21351。该菌还可以发酵制备α‑吡喃酮类、阿魏酸、α‑ribazole和N‑acetyltryptophan等化合物，特别是制备新颖的α‑吡喃酮化合物germicidins P‑S(1‑4)。制备的α‑吡喃酮类物质作为己糖激酶II的抑制剂，具有开发成抗肿瘤药物候选药物等应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物药物领域，具体为一种具有己糖激酶II抑制作用的海绵来源链霉菌及其抑制己糖激酶II活性物质的制备和应用。

背景技术

放线菌在自然界中分布十分广阔，它们能产生具有多种生物功能的代谢产物。目前已发现的微生物来源的天然产物中约50％来源于放线菌，而链霉菌属贡献了其中70％左右的活性物质。近年来，从海洋链霉菌中发现的新化合物的数量呈现逐年递增的趋势，且大约67％的海洋链霉菌天然产物表现出细胞毒、抑菌、抗疟和抗寄生虫等生物活性(海洋科学集刊,2016,51:86-124)。

链霉菌Streptomyces anthocyanicus和Streptomyces humiferus研究鲜有报道，对Streptomyces tricolor中次级代谢活性产物也尚未报道，Streptomyces coelescens可预防和治疗蚜虫病(CN106967629-A)也可以产生具有去污损作用的系列甘油甘油脂(Biosci.Biotech.Bioch.,2012,76:1746-1751)， Streptomyces violaceoruber产生抗炎的新化合物(J.Antibiot.,2017,70: 991-994)，Streptomyces violaceolatus产生抗肿瘤和抗细菌的活性物质 (JP61167679-A)。但总的来说上述16S rDNA序列同源性最高的链霉菌类群生物活性次级代谢产物报导较少，需要深入和广泛挖掘。

己糖激酶(Hexokinase II,HK2)，是催化己糖使之磷酸化的酶，在正常组织中表达量很少。它是糖酵解途径的第一个酶，也是糖酵解途径的限速酶 (Nat.Commun.2018,9,446)。糖酵解常于细胞缺氧时发生肿瘤细胞分裂活动旺盛，需要巨大的能量。据报道，肿瘤组织即使在氧供充分的条件下也主要是以糖酵解获取能量。己糖激酶在肿瘤组织中表达的量及活性的增加，使得肿瘤组织在缺乏氧的情况下，仍能保证足够的能源，并且糖酵解的许多中间产物可以被瘤细胞所利用，用来合成蛋白质、核酸及脂类等，从而为瘤细胞本身的生长和增生提供了必需的物质基础(J.Nucl.Med.2002,43, 173-180；Fitoterapia 2018,125,123-129)。研究发现了肿瘤的高糖代谢的特点：肿瘤细胞中大约60％的ATP来源于糖酵解途径，在切除的肺、胃肠及乳腺恶性肿瘤的组织中已经证实其己糖激酶的含量是增高的，并且在乳腺癌中已经发现，当病灶发生转移时，己糖激酶的活性会更高(Eur.J.Biochem.2000,267,6067-6073)。也有研究报告，肾肿瘤组织中己糖激酶的活性会增加(Biochem.Mol.Med.1995,54:53-58)。

因此，若能寻找到有效的己糖激酶抑制剂，抑制该酶的活性，则抑制了肿瘤细胞的糖酵解，使肿瘤细胞不能获得足够的6-磷酸葡萄糖，ATP无法转换为ADP为细胞各种活动提供能量，继而使肿瘤细胞发生调亡。本发明提供一种具有己糖激酶II抑制作用的海洋链霉菌，并利用其可制备新颖的α-吡喃酮类己糖激酶抑制剂等活性产物。

发明内容

本发明目的在于提供一种具有己糖激酶II抑制作用的海洋链霉菌及其抑制己糖激酶II活性物质的制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种海绵来源链霉菌，海洋链霉菌为Streptomyces sp.18A01，于2020 年12月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC 21351。

所述海洋链霉菌含8.76Mbp基因组；所述基因组中含有合成产生Desferrioxamine B、Geosmin、Isorenieratene、Hopene、Albaflavenone、 Germicidin、SapB(lanthipeptide)、Spore pigment、Calcium-dependent antibiotic (CDA)、Coelimycin P1、Undecylprodigiosin、Coelichelin、Melanin、Coelibactin 和Actinorhodin骨架化合物的基因簇。

一种海洋链霉菌的应用，所述海洋链霉菌18A01代谢产物作为己糖激酶II抑制剂或抗肿瘤候选药物中的应用。

一种海洋链霉菌的应用，所述海洋链霉菌18A01代谢产物在制备α-吡喃酮类germicidins、阿魏酸、α-ribazole和N-acetyltryptophan中任意一类化合物中的应用。

所述海洋链霉菌18A01代谢产物的制备：

1)将所述海洋链霉菌18A01接种于ISP3固体培养基上培养2-5d活化，然后接种于含人工海盐的ISP3液体培养基，28℃培养2-4d作为种子液；再将发酵种子液按照体积百分比2-10％接种于含人工海盐的ISP3液体培养基，28℃振荡培养5-10d；

2)将发酵液离心去菌体获得发酵上清液，用大孔吸附树脂XAD16固相吸附发酵液中活性成分，树脂与发酵液体积百分比为3％-6％；吸附2h-4h 完成后，先用蒸馏水洗涤树脂，再用甲醇解吸，回收甲醇溶剂后得的粗提物A，即为海洋链霉菌18A01代谢产物。

所述粗提物A进一步纯化制备获得germicidins、阿魏酸、α-ribazole和 N-acetyltryptophan：将粗提物A，采用快速硅胶柱色谱法分离，按照二氯甲烷：甲醇(v/v)比为100:0-0:100梯度洗脱，获得4个流分(F

一种从海洋链霉菌产生新的α-吡喃酮类(germicidin)化合物，α-吡喃酮类(germicidin P、germicidin Q、germicidin R和germicidin S)化合物如 (I)所示，

一种α-吡喃酮类(germicidin)化合物的应用，所述化合物germicidins P (1)、Q(2)、R(3)、S(4)、D(9)、H(10)、L(11)、M(12)和(1S,2S)-germicidin N(13)可作为己糖激酶II抑制剂。

所述α-吡喃酮类(germicidin)化合物在作为抗肿瘤候选药物中的应用。

进一步的说，所述化合物germicidin R(3)可作为抗肿瘤候选药物；其中，肿瘤为结肠癌HCT116。

本发明所具有的优点：

1.本发明所得菌株18A01具有独特性，它生存环境特殊来自于永兴岛海域海绵，具有产生多样活性物质的潜能。与其16S rDNA序列相同的几个菌株，尚未报道能发酵产生α-吡喃酮类、阿魏酸、α-ribazole和 N-acetyltryptophan等类化合物，且基因组ANI与18A01之间较低，显示出与18A01显著不同。

2.本发明菌株18A01可同时制备α-吡喃酮类、阿魏酸、α-ribazole和 N-acetyltryptophan类型化合物，为首次发明；其中α-吡喃酮类germicidins A-C已被报道具有己糖激酶II抑制作用，但germicidins D、H、L-N、P-S 作为己糖激酶II抑制剂为首次发明。

3.α-吡喃酮类germicidins P-S四个新化合物为首次发明。

附图说明

图1为本发明提供的深海来源海洋链霉菌菌落形态图。

图2为本发明提供基于16S rDNA序列的系统进化树显示18A01分类学地位。

图3为本发明提供菌株18A01在ISP3发酵培养基中产生的α-吡喃酮类次生代谢产物。

图4为本发明提供利用菌株18A01获得的化合物1-16的化学结构图。

图5为本发明提供利用菌株18A01获得的Germicidin P(1)的HRESIMS 谱。

图6为本发明提供利用菌株18A01获得的Germicidins P-S(1-4)的

图7为本发明提供利用菌株18A01获得的Germicidin P(1)在CH

图8为本发明提供利用菌株18A01获得的Germicidin Q(2)的HRESIM 图。

图9为本发明提供利用菌株18A01获得的Germicidin Q(2)在CH

图10为本发明提供利用菌株18A01获得的Germicidin R(3)的 HRESIMS谱图。

图11为本发明提供利用菌株18A01获得的Germicidin S(4)的 HRESIMS谱图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明，但本专利的保护内容不仅限于此。

实施例1海绵来源链霉菌18A01的鉴定和特征

菌株18A01分离自西沙群岛永兴岛海域采集的海绵，于2020年12月 10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC 21351。该菌在TSB、高氏1号、ISP3培养基上生长良好，形成圆形灰白色菌落，无色素产生(图1)。

将链霉菌18A01接种于含2.5％人工海盐的TSB液体培养基中，28℃培养36h后按照常规方法提取总DNA。然后采用二代高通量测序技术Illumina HiSeq2500进行基因组测定和组装，获得菌株18A01的基因组草图，基因组大小约8.76Mbp，GC content为72.17％，组装获得54个Scaffolds，N50 大小为385,800bp。对其16S rRNA基因BLAST分析，发现其与四个不同种的标准菌株S.coelescens DSM 40421

其中，链霉菌18A01的16S rRNA基因序列16S rDNA为：

>18A01 16S rDNA

ACGATGAACCACTTACGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGT AACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACG GGGTCTAATACCGGATACTGACCCTCGCAGGCATCTGCGAGGTTCGAA AGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTG AGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGG CGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGA GGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCG ACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGC AGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTA ACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCC GGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGC TAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATG CGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCC GATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAKA TACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAA CATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTG GGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCC CGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAA CCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCC CCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGT CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCG TGTTGCCAGCAAGCCCTTCGGGGTGTTGGGGACTCACGGGAGACCGC CGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCC CCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGC TGCGATACCGCAAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTC GGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAAT CGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACA CCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCC AACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGA CGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACC TCCTTT

而后使用antiSMASH分析和手动矫正发现18A01蕴含有30个以上次生代谢产物基因簇，具有产生Desferrioxamine B、Geosmin、Isorenieratene、 Hopene、Albaflavenone、Ectoine、Germicidin、SapB(lanthipeptide)、Spore pigment、Calcium-dependentantibiotic(CDA)、Coelimycin P1、 Undecylprodigiosin、Coelichelin、Melanin、Coelibactin和Actinorhodin骨架化合物的潜能，以及合成多种新颖PKS和NRPS类化合物的潜能(表1)。说明18A01是生产多种生物活性先导化合物的优良菌株。

表1.菌株18A01合成多样次级代谢产物的潜能

实施例2海洋链霉菌18A01生产多种类型生物活性物质和制备方法

进一步使用OSMAC策略发酵提高18A01产生次生代谢产物的化学多样性，通过活性筛选和HPLC-DAD-MS分析，发现以ISP3(成分包括：20 g燕麦粉，微量元素1mL，自来水1L，pH7.2)为发酵培养基时，该菌能产生一系列α-吡喃酮等类型的次生代谢活性产物(图3)；具体为：

将海洋链霉菌18A01接种于ISP3固体培养基上培养48h活化，然后接种于含人工海盐的ISP3液体培养基，28℃培养72h作为种子液；再将发酵种子液按照体积比1：18接种于相同的发酵培养基，28℃振荡培养7天。将发酵液离心去菌体获得发酵上清液，用大孔吸附树脂XAD16固相吸附发酵液中活性成分，树脂与发酵液体积比为1:25；吸附2h完成后，先用蒸馏水洗涤树脂，再用甲醇解吸，回收甲醇溶剂后得的粗提物A。将粗提物A，采用快速硅胶柱色谱法分离，按照二氯甲烷：甲醇(v/v)比为100:0-0:100梯度洗脱，获得4个流分(F

对上述获得化合物的结构进行解析，具体为化合物1为黄色油状物， HRESIMS数据显示一个m/z 199.0965的[M+H]

化合物2为黄色油状物，HRESIMS数据显示一个m/z 199.09634的[M+ H]

化合物3为黄色油状物，HRESIMS数据显示一个m/z 199.09636的[M+ H]

化合物4为黄色油状物，HRESIMS数据显示一个m/z 213.11220的[M+ H]

表2.化合物1-4的

表3.化合物1-4的

其他的已知化合物germicidin A(5)，germicidin B(6)，isogermicidin B (7)，germicidin C(8)，germicidin D(9)，germicidin H(10)，germicidin L(11)， germicidinM(12)，(1S,2S)-germicidin N(13)，阿魏酸(14)，α-ribazole(15) 和N-acetyltryptophan(16)(图4)均由1D-NMR光谱和旋光等数据比较报道相关文献确定。

实施例3海洋链霉菌18A01及α-吡喃酮化合物具有HK2抑制活性

HK2是糖酵解途径第一步的限速酶，与正常细胞相比，其在癌细胞中的表达水平较高。HK2由于其在肿瘤发生和转移过程中的关键作用，为肿瘤治疗提供了一个新的靶点。

将上述海洋链霉菌18A01提取物和分离制备的化合物，使用HK2酶活测定试剂盒，测定它们对HK2的抑制作用。HK2催化葡萄糖进行磷酸化转化为葡萄糖-6-磷酸，后者被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化形成NADPH。 NADPH的生成速率与葡萄糖浓度有关，NADPH在340nm有特异吸收峰，在波长340nm处检测吸光度的变化，测定化合物对HK2抑制活性的IC

化合物germicidins P、Q、R和(1S,2S)-germicidin N对HK2具有较强抑制活性，特别是germicidin Q和(1S,2S)-germicidin N抑制HK2的IC

表4. 18A01提取物及其制备的α-吡喃酮类物质抑制HK2的活性

实施例4α-吡喃酮germicidins化合物抗肿瘤细胞活性

体外细胞活性增殖抑制实验采用CCK-8检测法考察化合物对各细胞抑制率的影响。

用胰酶消化对数生长期的各细胞，收集后用混匀并计数，将密度为1× 10

序列表

<110> 中国科学院沈阳应用生态研究所

<120> 一种海绵来源链霉菌及其抑制己糖激酶II活性物质的制备和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1463

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgatgaacc acttacggtg gggattagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgggcaatct 60

gcccttcact ctgggacaag ccctggaaac ggggtctaat accggatact gaccctcgca 120

ggcatctgcg aggttcgaaa gctccggcgg tgaaggatga gcccgcggcc tatcagcttg 180

ttggtgaggt aatggctcac caaggcgacg acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc 240

cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca 300

caatgggcga aagcctgatg cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa 360

acctctttca gcagggaaga agcgaaagtg acggtacctg cagaagaagc gccggctaac 420

tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gcgcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt 480

aaagagctcg taggcggctt gtcacgtcgg ttgtgaaagc ccggggctta accccgggtc 540

tgcagtcgat acgggcaggc tagagttcgg taggggagat cggaattcct ggtgtagcgg 600

tgaaatgcgc agatatcagg aggaacaccg gtggcgaagg cggatctctg ggccgatact 660

gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattak ataccctggt agtccacgcc 720

gtaaacggtg ggcactaggt gtgggcaaca ttccacgttg tccgtgccgc agctaacgca 780

ttaagtgccc cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 840

cccgcacaag cggcggagca tgtggcttaa ttcgacgcaa cgcgaagaac cttaccaagg 900

cttgacatac accggaaagc atcagagatg gtgcccccct tgtggtcggt gtacaggtgg 960

tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1020

cccttgtccc gtgttgccag caagcccttc ggggtgttgg ggactcacgg gagaccgccg 1080

gggtcaactc ggaggaaggt ggggacgacg tcaagtcatc atgcccctta tgtcttgggc 1140

tgcacacgtg ctacaatggc cggtacaatg agctgcgata ccgcaaggtg gagcgaatct 1200

caaaaagccg gtctcagttc ggattggggt ctgcaactcg accccatgaa gtcggagtcg 1260

ctagtaatcg cagatcagca ttgctgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1320

ccgtcacgtc acgaaagtcg gtaacacccg aagccggtgg cccaacccct tgtgggaggg 1380

agctgtcgaa ggtgggactg gcgattggga cgaagtcgta acaaggtagc cgtaccggaa 1440

ggtgcggctg gatcacctcc ttt 1463