AGEs-RAGE信号在调控半月板钙化中的作用及其作用机制的研究方法和应用

摘要

本发明公开了AGEs‑RAGE信号在调控半月板钙化中的作用及其作用机制的研究方法和应用，属于生物医学技术领域。本发明通过对临床样本、半月板原代细胞及小鼠模型三个方面研究AGEs‑RAGE对于半月板细胞成骨及半月板钙化形成的影响，并进一步结合生物信息学分析寻找AGEs‑RAGE的下游通路分析，最终首次提出了AGEs‑RAGE信号在调控半月板钙化中的作用机制，在半月板细胞成骨分化过程中，mTOR活性及ATF4蛋白水平急剧升高并受到AGEs‑RAGE信号调控，mTOR及ATF4作为AGEs‑RAGE的下游在半月板细胞成骨过程中发挥了重要作用，而半月板细胞成骨分化直接导致半月板钙化增加，这为半月板钙化形成的机制提供了新的见解，并为针对半月板钙化这一骨关节炎新兴治疗策略提供了更多的候选靶点。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及AGEs-RAGE信号在调控半月板钙化中的作用及其作用机制的研究方法和应用。

背景技术

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是全世界最常见的关节疾病，大概影响到60岁以上人口中10％的男性和18％的女性。骨关节炎所造成的疼痛和虚弱可严重降低患者的生活质量。膝骨关节炎(KneeOA，KOA)是最常见的骨关节炎之一，目前膝骨关节炎的治疗主要包括疼痛管理和终末期关节置换术。长期的药物治疗往往难以避免出现相关的药物并发症，而进行关节置换术则需要承担手术风险且假体寿命有限。这些方法并未能从早期阻止膝骨关节炎的发展。对膝骨关节炎发病机制的更好理解与对疾病活动性检测的改进相结合，正在促进人们将注意力转移到早期膝骨关节炎的预防和治疗上。

膝关节半月板是两个新月形的纤维软骨盘，位于膝关节内侧和外侧的股骨和胫骨的表面之间，半月板在膝关节中承受许多不同的力，例如剪切力、张力和压缩力。半月板在关节软骨的承重、负荷传递、减震以及润滑和营养中起着至关重要的作用。有研究表明半月板钙化可能是骨关节炎影像学上最早期的线索，同时将加速骨关节炎的进展。但是既往不论是临床研究还是基础研究对半月板钙化的关注都很有限。

目前针对半月板钙化形成的原因尚不十分清楚，有研究认为细胞外焦磷酸盐(PPi)的水平起到了重要作用，PPi的生理水平由不同的机制维持，以防止关节软骨细胞和半月板的病理性钙化，这些机制在骨关节炎中变得失调。Ho等人发现，小鼠中钙化浆细胞膜糖蛋白-1(PC-1)的缺失会导致广泛的关节、半月板和韧带钙化，这解释了半月板钙化的一个可能机制。进一步有研究指出，与PPi转运调节器有关的基因(ANKH和ENPP1)在人类骨关节炎半月板细胞中表达上调，骨关节炎半月板细胞中的钙质沉积被PPi抑制。此外，上述研究也得到了骨关节炎动物模型研究的支持。也有研究显示半月板的细胞肥大和钙化之间有密切关系。众所周知，关节软骨的钙化往往是在肥大的软骨细胞附近发现的。有研究指出形态学外观肥大以及X型胶原蛋白的表达的半月板细胞在半月板中形成集群，并与半月板钙化灶共定位，这与肥大的软骨细胞相似。近期Du等人发现，在前交叉韧带(ACL)损伤后，异常的机械负荷通过加速半月板的肥大和矿化诱导软骨退化。他们的数据表明，ACLT导致豚鼠的半月板明显肥大，并增加了Col X、Ihh、MMP-13和IL-1的水平。总的来说，半月板钙化的成因仍然值得进一步分析，现有的证据表明半月板钙化可能是来源于全身因素和局部因素共同介导的生物化学过程。这让我们联想到了血管肌壁钙化这一类似的病变过程，大量研究表明血管钙化中AGEs-RAGE信号扮演了关键角色，与此同时，AGEs-RAGE是一个十分成熟的靶点，目前已有针对该靶点的多种药物，然而现有研究中并没有针对AGEs-RAGE信号在半月板钙化形成过程中的研究。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明旨在提供AGEs-RAGE信号在调控半月板钙化中的作用及其作用机制的研究方法和应用，通过本发明中的研究发现，在半月板细胞成骨分化过程中，mTOR活性及ATF4蛋白水平急剧升高并受到AGEs-RAGE信号调控，mTOR及ATF4作为AGEs-RAGE的下游在半月板细胞成骨过程中发挥了重要作用，而半月板细胞成骨分化直接导致半月板钙化增加，为半月板钙化形成的机制提供了新的见解。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

AGEs-RAGE信号在调控半月板钙化中的作用，其特征在于：AGEs-RAGE信号通过正向调控下游信号通路调控半月板细胞成骨分化，半月板细胞成骨分化导致半月板钙化增加。

进一步的，AGEs-RAGE信号的下游信号通路包括mTOR和ATF4。

进一步的，AGEs-RAGE信号调控mTOR活性及ATF4蛋白水平升高，mTOR及ATF4促进半月板细胞成骨分化。

进一步的，ATF4与mTOR形成正反馈环，mTOR通过减少ATF4的泛素化来抑制其降解，导致ATF4蛋白水平增加，而ATF4通过增加精氨酸摄取来激活mTOR。

进一步的，AGEs-RAGE信号在调控半月板钙化中的作用机制的研究方法，其特征在于，包括以下步骤，

S1：通过临床样本、半月板原代细胞及小鼠模型，明确AGEs-RAGE信号对于半月板细胞成骨及半月板钙化形成的影响，结合生物信息学分析寻找AGEs-RAGE的下游通路；

S2：通过临床样本、半月板原代细胞及小鼠模型，明确AGEs-RAGE下游通路之间的相互作用以及AGEs-RAGE下游通路与半月板钙化形成的作用。

进一步的，AGEs-RAGE的下游通路包括mTOR和ATF4。

进一步的，步骤S1的具体操作包括以下步骤，

S101：收集人膝关节原代半月板组织临床样本；

S102：对收集到的临床样本进行Micro-CT扫描，然后制备石蜡切片；

S103：对石蜡切片进行茜素红染色、碱性磷酸酶染色和免疫荧光检测；

S104：半月板原代细胞提取，冻存备用；

S105：半月板原代细胞进行成骨分化诱导；

S106：构建ATF4稳定敲低的慢病毒载体，并进行质粒的扩增与提取；

S107：使用慢病毒对半月板原代细胞进行感染；

S108：对半月板原代细胞组织及细胞的总蛋白进行提取和测定，并进行蛋白免疫印迹；

S109：对半月板原代细胞组织及细胞的总RNA进行提取和测定，并进行RNA的逆转录和实时荧光定量PCR以及GSEA分析；

S110：构建小鼠ACLT诱导的KOA模型，制作小鼠膝关节石蜡切片；

S111：对小鼠膝关节石蜡切片进行番红固绿染色和OARSI评分；

S112：对实验结果和数据进行分析。

进一步的，步骤S2的具体操作包括以下步骤，

S201：对半月板原代细胞进行免疫沉淀；

S202：质谱分析检测代谢物含量；

S203：对半月板原代细胞内精氨酸含量进行检测；

S204：对实验结果和数据进行分析。

进一步的，AGEs-RAGE信号通路调节剂在制备防治半月板钙化的药物或试剂盒中的应用。

本发明的有益效果是：

1、本发明中通过收集患者半月板样本后根据糖化血红蛋白水平分组，Micro-CT扫描评估钙化情况，WB、免疫荧光及茜素红染色评估AGEs-RAGE在半月板中的活性及与钙化灶的关系。分离提取原代半月板细胞，WB及qRT-PCR分析成骨过程中AGEs-RAGE信号蛋白水平变化，并通过茜素红染色和ALP染色观察使用外源性AGEs或RAGE小分子抑制剂TTP488处理对半月板原代细胞成骨能力的影响，随后建立C57及糖尿病小鼠的ACLT模型在体内进一步验证，通过GSEA分析寻找AGEs-RAGE的下游信号通路并结合WB及qRT-PCR进行验证；结果可以得出，在半月板细胞成骨分化过程中，mTOR活性及ATF4蛋白水平急剧升高并受到AGEs-RAGE信号调控，mTOR及ATF4作为AGEs-RAGE的下游在半月板细胞成骨过程中发挥了重要作用，而半月板细胞成骨分化直接导致半月板钙化增加，为半月板钙化形成的机制提供了新的见解。

2、本发明中在确定mTOR及ATF4在AGEs-RAGE下游的作用后，通过mTOR的小分子抑制剂Rapamycin，激动剂MHY1485，促ATF4累积试剂MG132，以及构建ATF4敲减慢病毒，设计挽救实验评估mTOR与ATF4的相互作用关系及与AGEs-RAGE信号的联系，通过免疫沉淀实验评估mTOR对ATF4的泛素化情况的影响，通过ELISA评估ATF4对细胞内精氨酸水平的影响，体内则通过免疫荧光实验进行进一步验证；挽救实验结果显示mTOR与ATF4形成正反馈环促进半月板原代细胞成骨分化，AGEs-RAGE信号通过mTOR-ATF4正反馈环实现其下游功能，与此同时靶向mTOR可影响ATF4的泛素化水平，靶向ATF4可调控细胞内精氨酸水平从而进一步影响mTOR活性。从机制上来说，mTOR通过减少ATF4的泛素化来抑制其降解，而ATF4则通过增加精氨酸的摄取来激活mTOR。

附图说明

图1为本发明中不同分组半月板中的钙化情况对AGEs与RAGE的表达情况。

图2为本发明中不同分组半月板RNA与蛋白质中AGEs与RAGE的表达情况。

图3为本发明中茜素红染色法靶向AGEs-RAGE信号通路对半月板原代细胞成骨能力以及半月板钙化情况的影响评估结果。

图4为本发明中ALP染色法靶向AGEs-RAGE信号通路对半月板原代细胞成骨能力以及半月板钙化情况的影响评估结果。

图5为本发明中不同小鼠分组结合番红固绿染色进行OARSI评分结果。

图6为本发明中通过生物信息学分析筛选出AGEs-RAGE信号下游并可能在半月板钙化过程中起作用的信号通路研究过程及结果。

图7为本发明中成骨诱导期间不同时间点及靶向激活或抑制AGEs-RAGE信号后相关通路激活水平的变化情况。

图8为本发明中PI3K/AKT/mTOR轴对半月板细胞成骨分化的影响。

图9为本发明中成骨诱导期间不同时间点及靶向激活或抑制AGEs-RAGE信号后关键成骨相关转录因子表达水平的变化情况。

图10为本发明中ATF4对半月板细胞成骨分化的影响结果。

图11为本发明中通过蛋白印迹实验评估Rapamycin(mTOR抑制)对ATF4的影响结果。

图12为本发明中使用蛋白酶体抑制剂MG132实现ATF4过表达的挽救实验结果。

图13为本发明中通过放线菌酮阻断细胞蛋白质合成，研究mTOR活性对ATF4磷酸化水平、降解速率及泛素化程度的影响结果。

图14为本发明中氨基酸及其衍生物在半月板细胞成骨分化过程中及AGEs处理后的变化情况。

图15为本发明中精氨酸对于半月板原代细胞成骨能力的影响研究过程及结果。

图16为本发明中通过茜素红染色检测激活或抑制AGEs-RAGE信号后靶向mTOR或ATF4对半月板原代细胞成骨能力的影响。

图17为本发明中通过茜素红染色检测激活或抑制AGEs-RAGE信号后靶向mTOR或ATF4蛋白印迹实验结果。

图18为本发明中通过ALP染色标记AGEs-RAGE在小鼠体内对于mTOR-ATF4正反馈环的影响结果。

图19为本发明中通过ALP染色标记AGEs-RAGE在小鼠体内对于mTOR-ATF4正反馈环的影响结果如附图。

图20为本发明中AGEs-RAGE信号导致mTOR-ATF4正反馈环激活机制图。

具体实施方式

为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。

AGEs-RAGE信号在调控半月板钙化中的作用及其作用机制的研究方法，包括以下内容：

一、AGEs-RAGE信号通路活性在半月板钙化形成中的作用及机制研究

1.1实验方法

1.1.1人膝关节原代半月板组织收集

本发明中所使用的人类半月板样本均得到了南方医科大学伦理委员会的批准。所使用人类半月板样本来自20名接受膝关节置换手术的膝骨关节炎患者(平均年龄66.5±5.58岁)。使用Paudi法评估半月板退化的严重程度，结果表明所有患者的半月板组织退化程度为3级(中度变性)或4级(严重变性)。所有样本根据HBAlc水平分为两组(低HBAlc组(n＝10)vs.高HBAlc组(n＝10)，5.81vs.7.04)，所有样本完成显微Micro-CT扫描后常规脱水包埋，制作石蜡切片，进行相关染色分析。

后续提取半月板原代细胞所使用的半月板样本均来自糖化血红蛋白正常患者，所有患者的半月板组织退化程度为3级(中度变性)或4级(严重变性)。

1.1.2样本的Micro-CT扫描

对所有取样标本进行固定处理后进行Micro-CT扫描。扫描参数为：射线管电流200uA，电压85KV，扫描整个物体，扫描分辨率10μm，曝光时间384ms，扫描角度180度。相同条件下扫描体模(Phantom；设备生产商统一配置提供)进行标定。扫描后得到原始图像。对于图像的三维重建使用三维重建软件NRecon(软件版本V1.7.4.2)对原始图像进行选择区域的重建。重建前，先对重建图像进行预览。为了降低图像伪影，以达到最佳重建效果，调整重建参数，设定为以下各值：Smoothing＝2(平滑度)、Beam-hardening＝8(光线强度)、Ringartifacts＝25％(环状尾影)。参数设置完成后，编辑选定指定文件夹开始图像重建。对于图像的分析，使用CTAnalyser(软件版本1.18.8.0)对感兴趣区域进行分析。设定统一参数，由软件计算出组织的总体积(TV)、骨体积(BV)、骨体积分数(BV/TV)等参数，同时导出甘心去区域新的图像集之后使用CTvox重建三维模型。

1.1.3石蜡切片制备

完成对组织的Micro-CT扫描后，将组织用于石蜡切片制作，切片的制作步骤如下：

1)组织固定：将半月板样本或小鼠膝关节样本剔除骨表面附着肌肉组织或其他软组织后，转移到含4％多聚甲醛溶液离心管中，于4℃固定24h。

2)组织清洗：将固定完成的组织转移PBS溶液中，放置于常温摇床上清洗15min三次。

3)组织脱钙：将清洗完毕的组织加入EDTA脱钙液中并置于常温摇床上进行脱钙，每4天更换一次脱钙液，待针头可刺入骨组织后进入下一步(约为10天)。(对于半月板样本省略脱钙步骤直接进行下一步，对于小鼠膝关节样本，将常规脱钙后进行下一步)。

4)组织脱水：待组织完全脱钙后，使用PBS溶液清洗15min三次，随后开始乙醇进行梯度脱水，具体步骤为：70％乙醇(1h)，80％乙醇(1h)，90％乙醇(1h)，100％乙醇Ⅰ(1h)，100％乙醇Ⅱ(1h)，二甲苯Ⅰ(0.5h)，二甲苯Ⅱ(0.5h)。苯蜡(60℃，0.5h)，石蜡Ⅰ(60℃，1h)，石蜡Ⅱ(60℃，1h)。

5)组织包埋：使用包埋机常规包埋组织，将脱水完毕的组织块放入包埋盒内，倒入融化的石蜡完全没过组织，并覆盖包埋盒凹槽，冰上冷却即成蜡块，组织蜡块可于-20℃冰箱长期保存。

6)组织切片：使用石蜡切片机常规进行组织切片，将蜡块嵌在切片机上，设置好切片厚度，右手摇动仪器手柄，同时将左手持镊将已切好的片子放置展片台上展片，最后将切片裱在载玻片上。

7)组织烤片：将裱好的切片做好标记后，置于65℃干燥箱中烘干过夜，贴牢后于4℃冰箱长期保存，待用。

1.1.4茜素红染色

对于半月板组织切片的茜素红染色；

1)样品处理：取出先前制做好的半月板组织石蜡切片，放置在切片夹上，重新于65℃烘干箱中烤片120min，随后按以下步骤进行脱蜡处理：二甲苯Ⅰ(10min)，二甲苯Ⅱ(10min)，100％乙醇Ⅰ(5min)，100％乙醇Ⅱ(5min)，95％乙醇(5min)，90％乙醇(5min)，85％乙醇(5min)，75％乙醇(5min)，自来水洗(5min)，该脱蜡步骤在余下全文中简称为“常规脱蜡”，随后进行染色处理。

2)茜素红染色：切片入茜素红S染色液浸染5min，随后蒸馏水充分洗涤。

3)苏木素复染：切片入苏木素染色液浸染5min，自来水洗10min，盐酸乙醇分化液分化30s，自来水冲洗反蓝10min。

4)透明封片：70％乙醇(10s)，80％乙醇(10s)，90％乙醇(10s)，无水乙醇(10s)，二甲苯Ⅰ(5min)，二甲苯Ⅱ(5min)，随后使用中性树脂封片后即可显微镜下观察拍照，该步骤在余下全文中简称为“常规透明封片”。

对于成骨细胞诱导后的钙结节茜素红染色，本研究使用碧云天公司生产的成骨细胞矿化结节染色试剂盒(茜素红S法)，操作如下：

①试剂盒的准备：首次使用时，在试剂盒包含的固定液中加入40ml的无水乙醇得到工作固定液，并充分混匀后备用。

②样品处理：半月板原代细胞诱导分化完成之后，去除培养液，用PBS洗涤1次。随后加入工作固定液固定20分钟，固定完成后PBS洗涤3次。

③茜素红染色：加入适量茜素红S染色液，均匀覆盖细胞，室温染色30分钟。蒸馏水充分洗涤后即可在显微镜下观察和拍照。

④茜素红定量：使用10％十六烷基氯化吡啶溶解茜素红后在570nm处测量吸光度，对钙化情况进行相对定量。

1.1.5碱性磷酸酶染色

对于半月板及小鼠膝关节组织切片的碱性磷酸酶染色；

1)样品处理：取出先前制做好的半月板组织石蜡切片，放置在切片夹上，重新于65℃烘干箱中烤片120min，按前述过程常规脱蜡处理备用。

2)碱性磷酸酶染色：根据试剂盒说明染色前配制BCIP/NBT染色工作液，滴加至切片位置，室温孵育30-120分钟，直至染色至预期深浅，随后使用自来水洗去染色液。

3)核固红复染：切片入核固红染色5-10分钟，去除染色液，自来水洗涤2次，每次5分钟。

4)透明封片：按前述过程常规透明封片，即可显微镜下观察拍照。

对于成骨细胞诱导后的碱性磷酸酶染色：

1)样品处理：半月板原代细胞诱导分化完成之后，去除培养液，用PBS洗涤1次。随后加入4％多聚甲醛固定20分钟，固定完成后PBS洗涤3次。

2)碱性磷酸酶：根据试剂盒说明染色前配制BCIP/NBT染色工作液，加入适量工作液，均匀覆盖细胞，室温染色1-12小时。蒸馏水充分洗涤后即可在显微镜下观察和拍照。

1.1.6免疫荧光检测

1)样品准备：取出先前制做好的半月板组织石蜡切片，放置在切片夹上，重新于65℃烘干箱中烤片120min，常规脱蜡处理，PBS清洗5min三次。

2)抗原修复：将切片置于盛满柠檬酸抗原修复液的染缸中于65℃烘干箱中抗原修复20-24小时。随后取出染缸自然冷却至室温，PBS清洗5min三次。

3)封闭：使用免疫组化笔于组织周围画圈后滴加适量的5％山羊血清，室温封闭30min。

4)一抗孵育：轻轻甩干封闭液，不洗，根据制造商建议浓度使用通用抗体稀释液配置合适的一抗溶液，滴加于玻片组织上，于湿盒中4℃孵育过夜，孵育完成后取出湿盒，常温下放置30min后回收一抗，将玻片重新置于玻片架上，PBS洗涤5分钟三次。

5)二抗孵育：根据试剂商建议浓度使用通用抗体稀释液配置合适的二抗溶液，荧光二抗溶液需避光保存，将二抗滴加于玻片组织上，置于湿盒中于常温避光孵育1h，随后避光下PBS洗涤5min三次。

6)封片：使用含DAPI的抗荧光淬灭封片液进行封片，于24小时内荧光显微镜下观察拍照。

1.1.7半月板原代细胞提取

1)组织预处理：将手术中收集的半月板组织取出，移至含1％双抗的无菌预冷的DMEM/F12溶液中。准备好预先高温消毒烘干的手术器械：医用组织剪、眼科镊、手术剪等。于超净台中使用弯头眼科镊将半月板组织从滑膜上剥离下来，将所获的半月板组织放在无菌的10cm培养皿中，用PBS溶液反复冲洗，清除组织表面的血渍。待组织完全洗净后，使用外科剪将其剪成碎沫状，随后把组织碎沫转移到50ml离心管中，加入PBS摇晃清洗，常温离心(1000rpm，5min)，弃去上清，重复三次。

2)组织消化：在洗干净的组织碎沫中加入含1％双抗的0.25％胰酶，吹打混匀后，放置培养箱内(37℃，5％CO

3)原代细胞获取：将消化完毕的细胞团通过120目滤网进行过滤，除去未充分消化的的较大的组织块，在离心后将半月板细胞转移到细胞培养瓶中，加入适量含有10％胎牛血清、1％双抗的DMEM/F12培养基(余下全文简称“完全培养基”)，轻轻左右前后晃动混匀，置于37℃培养箱中培养。在第三天进行细胞第一次换液，之后的培养过程中，每隔72小时换一次液。一般在细胞提取的第8-9天，可以观察到半月板细胞充分贴壁且密度明显增加，当细胞密度达80-90％时可以按1传3比例进行细胞传代进一步扩增，为避免表型损失，本发明采用第1-3代细胞进行后续实验或将细胞冻存备用。

1.1.8人体半月板细胞冻存和复苏

1)细胞冻存：本发明细胞冻存实验所使用的是商品化的无血清细胞冻存。细胞冻存方法依照说明书执行：将融合度达到90％半月板细胞用无菌PBS溶液浸洗后，往培养瓶内加入0.25％EDTA胰酶，于37℃消化5min，镜下见半月板细胞变圆后加入三倍胰酶体积的完全培养基终止消化过程。用移液器将细胞混悬液吹匀，转移到15ml离心管内，1000rpm离心5min，弃去上清。依据无血清冻存液的冻存比例，往离心管中加入合适体积的冻存液，充分吹打混匀后，转移到冻存管内(1ml/管)，使用封口膜封好后立即转移到-80℃冰箱保存备用。

2)细胞复苏：预先打开恒温水浴锅进行加热，待温度在37℃恒定后，从-80℃超低温冰箱中取出先前冻存的半月板细胞，快速将细胞放入水浴锅中。缓缓晃动冻存管，加速细胞融化，计时2min，随后于超净台中将含半月板细胞的冻存液转移到干净的15ml离心管中，加入3ml完全培养基，吹打混匀，1000rpm离心5min后，弃去上清。依据培养瓶容积大小加入合适体积的完全培养基，充分摇匀细胞后放置于37℃培养箱静置培养。

1.1.9人体半月板细胞成骨分化

取培养至1-3代的半月板原代细胞，根据后续实验需求接种到6孔板或12孔板中，待细胞汇合度达到90％左右，使用PBS溶液清洗3次，加入预先配好的成骨分化培养基。成骨分化培养基配方如下：完全培养基中额外含有50μM抗坏血酸、10mM磷酸盐和100nM地塞米松。随后将半月板细胞放置于培养箱中继续培养，分别在细胞诱导的第7天和第21天时收获细胞进行碱性磷酸酶染色及茜素红染色评估半月板原代细胞成骨分化情况。

1.1.10质粒的扩增与提取

本发明采用三质粒包装体系构建ATF4稳定敲低的慢病毒载体，AFT4-PLKO.1、PMD2g和PxpAx2载体均购自擎科生物公司。

对于质粒转化与扩增：

1)从-80℃冰箱取出stable3感受态细胞，立即置于冰上，待感受态细胞溶解后，立即加入1uL待扩增的质粒，冰上静置0.5h，预热水浴锅使的水温达到42℃，将静置完毕的质粒及感受态细胞转移至水浴锅内，静置活化60s，待感受态细胞活化完毕，重新将其放在冰上静置3min。

2)在超净台内，往活化后的感受态细胞中加入1mL LB液体培养基(提前配制并高压灭菌)，最后转移到恒温摇床37℃培养1h，将收获的菌液放入离心机内常温低速离心1min获得菌体沉淀。

3)准备含有与质粒相应抗生素抗性的LB固体板，使用接种环(酒精灯加热消毒)将菌体沉淀均匀铺在表面，随后将LB固体平板倒扣细菌培养箱，37℃条件下培养过夜。

4)第二天，使用10uL无菌枪头将单个菌落克隆挑下，转移到LB液体培养基(已添加对应抗生素)，在恒温摇床摇晃(37℃，180rpm)培养12-16h，最后收获菌液进行质粒提取

对于质粒提取，本发明采用的质粒小中量提取试剂盒购自天根公司,依据试剂盒说明书指示进行：

1)试剂配制：Buffer 1中加入试剂盒内配有的RNaseA，4℃长期保存备用；Buffer2中加入适量无水乙醇，室温保存备用。

2)细菌沉淀收集：将LB液转移至50mL离心管中，室温高速离心(1200rpm)，离心5min，将离心弃上清后的离心管倒扣干净滤纸上，彻底去除上清，保留沉淀；依据沉淀大小，往离心管中加入Buffer 1，涡旋混匀菌体沉淀；并将菌液转移至2mL EP管内。

3)加入500μL Buffer2进行裂解，温和混匀数次后，立即加入Buffer 4终止裂解，前后不得超过5min，将细菌沉淀液放在试验台上室温静置10min，再高速离心(1200rpm)10min，将上清液转移到新的无菌无酶2mLEP管内。

4)往管内加入0.3倍体积的异丙醇，轻柔混匀；将上述液体转移过滤柱中高速离心(1200rpm)2min。

5)收集完毕所有的过滤液到新的EP管中，再将其转移至预先平衡好的吸附柱中，高速离心(1200rpm)1min，弃去滤液。

6)依次使用去蛋白液buffer PD、漂洗液buffer(两次)清洗过滤柱，最后空柱离心，将溶液完全除尽，取出过滤柱，开盖挥干乙醇后，加入适量洗脱液，离心收获质粒溶液，通过Nano Drop2000测量质粒浓度后质粒于-80℃保存备用，并取少量质粒送检测序。

1.1.11慢病毒的包装与感染

1)三质粒共转染：在转染前18-24小时以约为400万/10cm皿密度接种HEK 293T细胞，随后按照PxpAx2：PMD2g：AFT4-PLKO.1(或NC-PLKO.1)＝7.5μg:2.5μg:10μg质粒质量进行共转染，转染试剂使用碧云天lipo 293完成，根据试剂商说明书，首先将如上总质量为20μg的质粒添加到总体积750μL的无血清无双抗培养基中，记为A液，移液枪轻轻混匀20次；取Lipo 293试剂40μL添加到总体积750μL的血清无双抗培养基中，记为B液，移液枪轻轻混匀20次；随后将B液逐滴滴加到A液中，移液枪轻柔混匀20次，室温静置15-20min；最后将静置好的转染试剂缓缓滴加到HEK 293T细胞中。记录转染时间、转染质粒、换液时间等参数。

2)病毒收取：转染后的14-18h进行第一次换液，将含有转染试剂的HEK 293T上清更换为10mLDMEM完全培养基；继续培养30h后收取含病毒上清液置于4℃冰箱备用，继续更换完全培养基培养24h后再次收取含病毒上清液于4℃冰箱备用。

3)病毒浓缩：本发明病毒浓缩采用碧云天病毒浓缩试剂盒，按照试剂商的指示，取步骤2中所收取含病毒的上清液使用0.45μm针头滤器过滤以充分沉淀细胞碎片。随后取出4℃预冷的病毒沉淀试剂(4X)，按照1份病毒沉淀试剂(4X)和3份病毒上清液的比例混合。充分混匀后，在混匀仪或侧摆摇床上低转速4℃混匀过夜；3500g离心1h后小心去除上清，切勿触及沉淀，随后再次3500g离心1min彻底去除上清。加入原病毒上清液体积的1-10％的病毒重悬液，静置10min，然后使用移液器小心吹打20-30次，重悬病毒沉淀，吹打时应避免产生气泡，即获得浓缩后的病毒悬液，1周内使用的病毒于4℃保存备用，其余置于-80℃长期保存，避免反复冻融。

4)病毒滴度测定；将第3步中收取的病毒液按照梯度添加到293T细胞中，48h后检测阳性细胞比例，病毒滴度的单位为：TU/mL，代表每毫升病毒液中具有转导功能的病毒颗粒的数目。计算公式为:滴度＝(感染时细胞数(个)×阳性细胞比例)/病毒液体积(mL)，选用滴度＞108TU/mL的病毒液用于后续半月板原代细胞感染。

5)慢病毒感染：感染前16-24小时将半月板原代细胞铺板，密度以感染时细胞融合度70％-80％为宜，感染前更换新鲜完全培养基，以250μL浓缩病毒液(滴度＞108TU/mL)/10cm皿的量对半月板原代细胞进行感染，感染后48小时更换新鲜完全培养基，随后可通过荧光显微镜、qRT-PCR、WB等实验明确感染效率，并进行后续相关实验。

1.1.12组织及细胞的总蛋白提取

1)半月板组织蛋白收取：用于提取蛋白及RNA的组织在收取后立即使用RNAlater保存，于4℃过夜后置于-20℃长期保存备用，在提取蛋白前于4℃过夜解冻，随后使用无酶处理过后的剪刀及镊子将半月板组织剪为小块，加入研磨管并加入无酶陶瓷研磨珠，基于组织量加入适量RIPA裂解液(含蛋白酶及磷酸酶抑制剂)，于研磨仪充分研磨后12000g离心5分钟后取上清，后续步骤即与细胞蛋白提取相同。

2)半月板原代细胞蛋白收取：从培养箱中取出待收获的细胞，加入适量PBS清洗完毕后，基于细胞量向用于WB实验的细胞沉淀中加入适量RIPA裂解液(含蛋白酶及磷酸酶抑制剂)，混匀细胞沉淀后转移置4℃冰箱低温裂解1h。裂解完毕后将细胞裂解液，涡旋混匀1min，冰上裂解10min，循环3次。将细胞裂解液置于离心机中，4摄℃离心15min，取出上清液。

3)蛋白浓度测定：本发明使用的BCA浓度检测试剂盒购于自碧云天公司，检测方法依据说明书逐步配制相关反应试剂，测定吸光度值后，计算样本蛋白浓度。

4)蛋白变性；根据总蛋白将样本浓度调整为一致，随后依据样本1/4体积的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，充分混匀，转移到已经预热至100℃金属浴中，加热变性5min，样本变性后存于-20℃冰箱备用。

1.1.13蛋白免疫印迹

1)电泳凝胶配制：将玻璃板、梳子、制胶架等清洗干净，依据待检测的蛋白分子大小配制不同浓度分离胶，下表1为10％分离胶反应体系：

表1 10％分离胶反应体系

将配制好的分离胶均匀的加入到两玻璃板中，达适宜高度后，加入无水乙醇进行液封，置于室温凝固30min，待分离胶凝固后，弃去无水乙醇，静置挥干多余的乙醇，同时配制浓缩胶，浓缩胶反应体系如下表2所示。

表2浓缩胶反应体系

将配好的浓缩胶均匀的加入到分离胶上，随后缓慢插入梳子，切勿出现气泡，影响后续上样。待浓缩胶完全凝固后，取梳子进行后续电泳步骤，若暂时不进行电泳，可将配好的SDS-PAGE胶放在超纯水中，置于低温冰箱保存备用。

2)蛋白电泳：将蛋白取出解冻，同时将玻璃板组装到电泳卡槽；在电泳槽内加入电泳缓冲液，小心取下梳子，依据先前计算的蛋白浓度，加入样本，按每个孔10μg蛋白进行；在电泳槽外槽加入电泳液，接通电源，先调节电压为80V，待样本进入分离胶时，电压改成120V，直至结束。

3)转膜：取出转膜夹，置于盛有转膜液的手术托盘中，转膜液面高度需浸没转膜夹及上方的海绵和滤纸，去除滤纸和海绵中的气泡，备用。取下电泳玻璃板，打开，按marker大小切下目的条带，放于转膜夹黑面，PVDF膜在甲醇中活化后覆于胶条上，注意做好标记，切勿出现气泡；将转膜夹合上，扣紧，依据“黑胶白膜”放入转膜仪内，设定电流0.2mA，最后依据目的蛋白分子量大小调整转膜时间。

4)封闭：用TBST配制5％脱脂奶粉作为封闭液备用，将转膜完毕的PVD膜放入封闭液中，置于水平摇床，室温慢摇1h进行封闭；封闭完成，将PVDF膜转移到抗体盒，置于摇床上，用TBST清洗膜3次，每次10min，摇床转速100rpm。

5)一抗孵育：用通用抗体稀释液将抗体依据说明书稀释比配制好，洗涤完毕后，弃去TBST溶液，加入与相对应的抗体，4℃孵育过夜。孵育完毕后回收一抗，将一抗孵育完毕的PVDF膜继续在摇床上用TBST清洗条带，转速100rpm，10min，重复三次。

6)二抗孵育；洗涤完毕，加入相应抗性的二抗，置于水平摇床，室温慢摇孵育1h；将二抗孵育完毕的PVDF膜继续在摇床上用TBST清洗条带，转速100rpm，10min，重复三次；

7)化学发光：将洗涤完毕的膜放入凝胶成像仪中，加入适量化学发光液，待设备聚焦完毕后，自动曝光，保存图像即可。

1.1.14组织及细胞的总RNA提取

1)半月板组织RNA获取：将保存于RNAlater溶液中的半月板组织在提取RNA前于4℃过夜解冻，随后使用无酶处理过后的剪刀及镊子将半月板组织剪为小块，加入研磨管并加入无酶陶瓷研磨珠，基于组织量加入适量RNAisoPLUS溶液，于研磨仪充分研磨后3500g离心5分钟后取上清，后续步骤与即与细胞RNA提取相同。

2)半月板原代细胞RNA获取：收获处理完毕的半月板细胞，依据培养皿底面积加入适量RNAisoPLUS溶液，静置裂解1min后，使用移液器把细胞裂解液吹匀，直至不再黏稠即可转移置EP管内。

3)RNA提取：往裂解液中加入总裂解液体积五分之一的氯仿；剧烈震荡15s后，室温静置10min；将先前静置完毕的组织匀浆液转移至预冷完毕高速冷冻离心机，设置离心力12000g，随后在4℃条件下离心10min，小心吸取上清到新的EP管内；往上清液中加入200μL氯仿，涡旋15s后室温静置5min；预冷高速冷冻离心机后，将样本转移到离心机内，离心(12000g，4℃)15min；离心结束后，使用100μL吸头小心吸出上层水相，转移到新的EP管中，不可触及中间层；然后加入与上清液等体积异丙醇并混匀，随后室温静置10min；再次离心(12000g，4℃)10min，结束后，可观察到EP管底出现白色沉淀，即为RNA沉淀，缓慢加入1mL预冷的75％乙醇(DEPC水配制)，轻柔颠倒混匀数次后，再次离心(12000g，4℃)5min；使用移液枪弃去乙醇，空管离心(12000g，4℃)5min；使用10uL吸头将多余的乙醇去除，置于室温10min，挥干乙醇；待RNA沉淀慢慢开始变透明时，依据沉淀大小加入适量DEPC水，轻柔混匀；

4)RNA浓度测定：使用核酸蛋白定量仪NanoDrop2000检测RNA浓度和纯度，根据浓度值加入DEPC水将各样本浓度调整为一致。收获的RNA样本将直接逆转录为cDNA或冻存于-80℃备用。

1.1.15RNA的逆转录

本发明采用的RNA逆转录试剂盒为Takara,依据试剂盒说明书指示和程序进行。首先，去除基因组DNA反应体系如下表3所示。

表3去除基因组DNA反应体系

将反应体系混匀且瞬时离心后，转移至PCR内，设置反应程序：42℃，2min。第一步反应完后，配制逆转录体系，具体如下表4所示。

表4逆转录体系

将反应体系混匀且瞬时离心后，转移至PCR内，设置反应程序：37℃，5min；85℃，5s；4℃，end。反应完成后，将合成的cDNA用于实时荧光定量PCR。

1.1.16实时荧光定量PCR

依据takara试剂说明书指示配制PCR反应体系，配样及加样均需在冰上避光进行，PCR反应体系如下表5所示。

表5 PCR反应体系

配制好反应体系后，设置RT-PCR仪(ABIQuantStudio6 Q6)反应程序，具体如下表6所示。

表6反应程序

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程序运行结束后，依据CT值对目的基因表达量进统计与分析。

本发明中所使用的引物序列如下表7所示。

表7引物序列

1.1.17 GSEA分析

1)获取表达矩阵：本发明通过检索GEO数据库获取了两个与半月板退变相关的表达矩阵，其中GSE185064是健康半月板和骨关节炎半月板的RNA测序数据集，GSE191157是年轻半月板与老年半月板的总RNA测序数据集。为了增加数据可信度我们将两个数据集合并后进行分析，首先使用R包inSilicoMergin来合并数据集，并进一步使用R包limma(3.42.2版)的removeBatchEffect功能来去除批量效应，得到最终矩阵，进行后续GSEA分析。

2)GSEA分析：本发明中的GSEA分析使用GSEA的4.3.2版本完成，打开软件后依次倒入表达矩阵文件，表型数据文件及KEGG通路背景基因集文件，即可开始分析。

1.1.18构建小鼠ACLT诱导的KOA模型

本发明所用的C57BL/6雄性小鼠购自南方医科大学实验动物中心，db/m和db/db小鼠来自Jackson实验室。两次小鼠实验中分别随机将小鼠分为4组，分组信息如下，其中ACLT代表前交叉韧带离断，Sham代表假手术。C57BL/6小鼠分组如下表8所示。db/m和db/db小鼠分组如下表9所示。

表8 C57BL/6小鼠分组情况

表9 db/m和db/db小鼠分组情况

ACLT手术具体操作如下：

1)准备工作：术前将所需要的手显微外科手术器械包含镊子、剪刀、持针器、止血钳等高压灭菌消毒，烘干备用；同时准备好动物固定板、消毒液(75％酒精、5％碘伏)、无菌生理盐水、缝线(6-0)。

2)小鼠麻醉：将准备手术的C57BL/6小鼠转移至动物手术室，先对小鼠称重，随后根据小鼠重量通过腹腔注射1％戊巴比妥钠进行麻醉(10ul/g)。彻底麻醉后使用手术剪对小鼠两侧膝关节皮肤备皮，再将小鼠腹部朝上固定于动物固定板上。

3)手术：对手术部位碘酒消毒后酒精脱碘，使用手术刀沿膝前髌韧带内侧切口，依次切开皮肤、皮下组织及关节囊，在体式显微镜下探查小鼠膝关节前交叉韧带，使用显微探钩轻轻拉住后用显微剪剪断，使膝关节失稳，需注意保护小鼠关节面软骨，手术结束，生理盐水冲洗伤口，依次缝合关节囊、皮肤并消毒。

4)术后处理：术后三日内常规腹腔注射青霉素(2万单位/只)，于术后一周开始关节腔注射相关药物或对照PBS，术后8周取材进行后续实验。

1.1.19番红固绿染色

本发明使用的番红固绿为配制好的溶液，按照试剂商的指示进行染色：

1)样品处理：取出先前制做好的小鼠膝关节石蜡切片，按照前述常规脱蜡后备用。

2)染色：切片入固绿染色液内浸染5min，随后使用1％冰醋酸洗涤切片5-10s，去除残留的固绿，随后快速入水洗除残余冰醋酸溶液，最后入番红染色液内浸染3min。

3)透明封片；番红染液染色后不可入水洗，按照95％乙醇2-3s、无水乙醇Ⅰ2-3s、无水乙醇Ⅱ1min、二甲苯Ⅰ3min、二甲苯Ⅱ3min进行脱水透明，最后使用中性树脂封片，即可镜下观察。

1.1.20OARSI评分

完成番红固绿染色后，使用OARSI评分评估KOA进展情况，评分时至少由三名不同的实验人员独立进行，结束后取三人所得平均分作为最后得分。评分参照OARSI评分系统，具体细则如下：

关节软骨评分细则如下表10所示。骨赘评分和测量，根据测量大小和表11进行打分。

表10关节软骨评分细则

表11骨赘评分和测量准则

关节评价总分＝通过将内侧和外侧骨赘评分与四个关节面(股骨内侧髁、股骨外侧髁、胫骨内侧平台和胫骨外侧平台)关节软骨退化总和相加来计算总关节评分。最大值为30，若为单侧关节面的评分则最高分为15分。

1.1.21数据分析

本发明中所有结果均以平均值±标准差表示，并使用Graphpad Prism 9软件进行分析。所有实验至少重复三次。两组间的差异分析使用t检验。多组之间差异的分析使用方差分析和Tukey事后检验。P＜0.05被认为具有统计学意义。

1.2实验结果

1.2.1 AGEs与半月板中钙化灶的形成正向相关

为了在临床半月板样本中观察AGEs与半月板中钙化灶的关系，本发明中主要研究了两个方向：1)半月板中钙化灶的含量是否与AGEs含量正相关；2)半月板钙化灶周围是否存在AGEs的富集。因为AGEs的形成与糖代谢密切相关，所以在本发明中依据HBAlc高低将半月板临床样本分为高低两组，高HBAlc组代表高AGEs含量组，低HBAlc组即代表低AGEs含量组。

为此，本发明收取了20例半月板临床样本，按上述分组后进行Micro-CT扫描，观察了半月板样本中的钙化灶情况，结果如附图1所示。在附图1中，A为Micro-CT扫描观察半月板中的钙化情况，提示高糖化血红蛋白组半月板钙化更多且钙化灶体积更大；B为使用CTAn软件对半月板样本的总组织体积(TV)和钙化体积(CV)进行定量分析，提示高糖化血红蛋白组中半月板的钙化体积百分数(CV/TV)高于第糖化血红蛋白组，n＝10；C为免疫荧光染色提示AGEs及RAGE存在显著的共定位，同时使用茜素红染色确定钙化灶的定位，提示AGEs-RAGE共定位区域分布于钙化灶及其周围。数据描述为平均值±标准差，两者间的比较采用非配对双尾t检验分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

从附图1中可以看出，KOA患者的半月板中普遍存在钙化灶，且在高HBAlc组中半月板的钙化灶较大且范围分布较广(如附图1中A所示)。随后对半月板中的钙化情况进行定量分析，分析的主要参数有钙化体积分数CV/TV(％)，结果显示在高HBAlc组中半月板的钙化体积百分数显著较大(如附图1中B所示)。为了进一步观察AGEs与钙化灶的情况，在未脱钙前提下制作半月板切片并进行了茜素红染色和AGEs及RAGE的免疫荧光染色，结果显示茜素红阳性区域与AGEs及RAGE阳性区域存在显著的共定位(如附图1中C所示)。

随后进一步提取半月板的RNA与蛋白质分析不同分组的半月板中AGEs及RAGE的表达情况，结果如附图2所示，在附图2中，A为蛋白印迹检测不同分组半月板中AGEs及RAGE的蛋白含量，提示高糖化血红蛋白组半月板中AGEs及RAGE含量均较高；B为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝10；C为实时荧光定量PCR检测不同分组半月板中RAGE的相对mRNA含量，提示高糖化血红蛋白组半月板中RAGEE的相对mRNA含量较高，n＝10；D为ALP染色显示成骨诱导后半月板原代细胞ALP活性显著增强，茜素红染色显示成骨诱导后半月板细胞形成了矿化结节，提示半月板细胞具备成骨能力；E为茜素红染色的定量分析，n＝3；F为蛋白印迹检测不同成骨诱导时间点的半月板细胞中AGEs及RAGE的蛋白含量，结果显示成骨诱导期间上述两者表达量无明显变化；G为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝3。数据描述为平均值±标准差，两者间的比较采用非配对双尾t检验分析，多组间的比较采用单因素方差分析和图基事后检验。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005。

从附图2中可以看出，高HBAlc组半月板中AGEs蛋白、RAGE的蛋白及RNA含量均较高(如附图2中A-C所示)。上述结果提示AGEs-RAGE的激活与半月板中钙化灶形成正向相关。考虑到AGEs在血管中促进钙化的机制主要与促进细胞成骨表型迁移相关，我们接下来评估了半月板原代细胞的成骨能力，半月板原代细胞在成骨诱导培养基中培养至第7天时进行ALP染色，培养至第21天时进行茜素红染色，ALP染色显示进行成骨诱导后ALP活性显著增强(如附图2中D所示)，茜素红染色显示成骨诱导后半月板原代细胞产生了大量钙结节(如附图2中D和E所示)，这些结果表明半月板原代细胞具备成骨能力。随后进一步在成骨诱导的第3天、第7天和第21天收取细胞蛋白进行蛋白印迹分析，结果显示AGEs和RAGE在成骨诱导过程中含量无明显变化(如附图2中F,G所示)，这提示半月板原代细胞成骨分化过程中不会产生更多的内源性AGEs。

上述实验结果表明半月板中的钙化灶形成与AGEs正向相关，这可能与AGEs造成的半月板原代细胞成骨能力增强有关，且AGEs并非由成骨分化的半月板细胞产生。

1.2.2 AGEs-RAGE信号促进半月板原代细胞成骨，并导致半月板钙化增加

为了进一步确定AGEs-RAGE信号在半月板中的作用，本发明中通过在半月板原代细胞成骨诱导期使用额外的AGEs或TTP488(一种RAGE抑制剂)处理半月板细胞，随后通过茜素红染色及ALP染色评估半月板原代细胞成骨能力，结果如附图3和附图4所示。

附图3为茜素红染色法靶向AGEs-RAGE信号通路对半月板原代细胞成骨能力以及半月板钙化情况的影响评估结果，其中，A为通过茜素红和ALP检测半月板原代细胞成骨分化能力，结果显示AGEs处理显著促进半月板细胞成骨，而TTP488处理则导致成骨能力减弱；B为茜素红染色的定量分析，n＝3；C为小鼠膝关节半月板区域钙化体积的三维Micro-CT图像以及与膝关节的合并图像，直观展示了ACLT手术后半月板区域的钙化体积显著扩大，并在ACLT手术+关节腔注射AGEs组中进一步扩大；D为使用CTAn软件将小鼠膝关节半月板区域的钙化体积(CV)进行定量分析，结果与E相符合，n＝5；E为小鼠膝关节半月板区域钙化体积的三维Micro-CT图像以及与膝关节的合并图像，直观展示了db/db小鼠半月板区域的钙化体积在膝关节腔注射TTP488后减少；F为使用CTAn软件小鼠膝关节半月板区域的钙化体积(CV)进行定量分析，结果与G相符合，n＝4。数据描述为平均值±标准差，多组间的比较采用单因素方差分析和图基事后检验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

附图4为ALP染色法靶向AGEs-RAGE信号通路对半月板原代细胞成骨能力以及半月板钙化情况的影响评估结果，其中，A为通过ALP检测半月板原代细胞成骨分化能力，结果显示AGEs处理显著促进半月板细胞成骨，而TTP488处理则导致成骨能力减弱；B为蛋白印迹分析检测成骨过程中不同处理对细胞AGEs和RAGE蛋白水平的影响，结果显示AGEs处理造成细胞内AGEs含量显著升高，对RAGE蛋白水平无明显影响，TTP488处理对细胞AGEs及RAGE蛋白水平均无显著影响；C为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝3；数据描述为平均值±标准差，多组间的比较采用单因素方差分析和图基事后检验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

从附图3的A、B以及附图4的A中可以看出AGEs处理导致半月板细胞成骨分化能力明显增加，而TTP488则引起成骨分化能力下降。

为了评估AGEs-RAGE信号的体内效应，本发明通过ACLT手术在C57BL/6小鼠中建立膝关节不稳定OA模型，随后通过膝关节腔注射AGEs或TTP488模拟AGEs过度激活或抑制的情况。所有小鼠被随机分为以下4组：假手术+关节腔注射PBS，假手术+关节腔注射AGEs，ACLT手术+关节腔注射PBS，ACLT手术+关节腔注射AGEs。手术完成后一周开始膝关节腔注射，每4天注射一次。术后8周处死小鼠收取膝关节进行后续分析。

收取膝关节后通过Micro-CT分析小鼠膝关节半月板区域的钙化情况，结果显示半月板区域的钙化体积在ACLT手术后明显扩大，并在ACLT手术联合膝关节腔注射AGEs后进一步扩大，几乎覆盖了半月板的整块区域(如附图3中C,D所示)。值得注意的是，假手术+关节腔注射AGEs组也导致了钙化区域增加，这提示单独AGEs-RAGE信号已可导致半月板钙化增加，膝关节不稳并不是必要的条件。为了更进一步评估AGEs-RAGE的体内效果，本发明进一步使用db/db小鼠作为天然体内高AGEs的模型，通过关节腔注射TTP488来达到阻断AGEs-RAGE信号的目的。与上述类似，所有小鼠被随机分为以下4组：db/m小鼠+关节腔注射PBS，db/m小鼠+关节腔注射TTP488，db/db小鼠+关节腔注射PBS，db/db小鼠+关节腔注射TTP488。注射周期及取材时间与上述相同。Micro-CT分析表明，db/db小鼠半月板区域的钙化体积较db/m小鼠大，在注射TTP488后钙化体积显著缩小(如附图3中E,F所示)。值得注意的是，在db/m小鼠中注射TTP488也同样导致了半月板区域钙化体积的缩小，这说明了即便在非糖尿病小鼠中同样有AGEs-RAGE信号的激活。上述结果表明AGEs-RAGE信号通路激活可促进半月板原代细胞成骨，并导致半月板钙化增加。

进一步的，本发明中通过蛋白印迹分析评估了不同试剂处理导致的细胞内AGEs及RAGE蛋白水平变化情况(如附图4中B,C所示)，值得注意的是，AGEs处理虽然显著导致了半月板原代细胞中AGEs水平增加，但对RAGE蛋白水平无显著影响。

上述实验结果表明AGEs-RAGE信号通路激活在体外可促进半月板细胞成骨导致矿化增加，在体内可导致半月板钙化体积增加，AGEs-RAGE信号被阻断可产生相反的效果。

1.2.3 AGEs-RAGE信号通路激活导致KOA进展加速

为了进一步研究AGEs-RAGE信号对OA进展的影响，本发明中采用上述1.1.18中的小鼠分组并分析了额外的Micro-CT参数，同时结合番红固绿染色进行了OARSI评分，结果如附图5所示。附图5中，A为不同分组小鼠的膝关节胫骨侧软骨下骨冠状位和水平位的Micro-CT图像，结果显示关节腔注射AGEs加重了ACLT手术所导致的软骨下骨重塑；B为使用CTAn软件将小鼠的膝关节胫骨侧软骨下骨的骨体积分数(BV/TV)进行量化，结果显示与ACLT手术组相比，关节腔注射AGEs可进一步降低软骨下骨的骨体积分数，n＝5；C为小鼠膝关节切片的番红固绿染色，结果显示所有ACLT手术组都存在较明显的关节软骨侵蚀和蛋白聚糖丢失现象，其中ACLT手术+关节腔注射AGEs组最为严重；D为OARSI评分用于评估OA的进展，结果显示ACLT手术+关节腔注射AGEs组得分最高，n＝5；E为不同分组小鼠的膝关节胫骨侧软骨下骨冠状位和水平位的Micro-CT图像，结果显示关节腔注射TTP488减缓了db/db小鼠中ACLT手术所导致的软骨下骨重塑；F为使用CTAn软件将小鼠的膝关节胫骨侧软骨下骨的骨体积分数(BV/TV)进行量化，结果显示在db/m以及db/db小鼠中，关节腔注射TTP488均缓解了ACLT手术所造成的软骨下骨骨体积分数下降，n＝4；G为小鼠膝关节切片的番红固绿染色，结果显示关节腔注射TTP488显著改善了ACLT手术所导致的软骨侵蚀状况；H为OARSI评分用了评估OA的进展，结果显示db/db鼠+关节腔注射PBS组得到最高分，n＝4。数据描述为平均值±标准差，多组间的比较采用单因素方差分析和图基事后检验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

附图5中A展示了有代表性的膝关节胫骨侧软骨下骨的Micro-CT图像，可以看出AGEs注射显著加剧了ACLT手术所引起的软骨下的骨重塑。进一步通过CTAn软件对膝关节胫骨侧软骨下骨的骨体积分数进行了定量分析，与ACLT相比，AGEs注射进一步降低了软骨下骨的骨体积分数(如附图5中B所示)，这表明关节腔注射AGEs加速了OA的进展。此外，通过番红固绿染色观察到所有ACLT分组均存在不同程度的软骨损伤及蛋白聚糖丢失的现象，其中ACLT手术+关节腔注射AGEs组最为严重(如附图5中C所示)。OARSI评分系统被用来进一步评估OA的进展情况，结果与预期一致，ACLT手术+关节腔注射AGEs组得到了最高的OARSI评分(如附图5中D所示)。有趣的是，在假手术组注射AGE同样导致了OA的进展(如附图5中A-D所示)，结合单独注射AGEs导致了钙化体积增加的情况，这进一步说明了半月板在OA进展中的独特作用。与之相类似附图5中E展示了糖尿病鼠及其对照鼠分组中具有代表性的Micro-CT图像，结果表明膝关节腔注射TTP488减少了膝关节胫骨侧软骨下骨的骨重塑。TTP488的注射增加了db/m和db/db小鼠软骨下骨的骨体积分数，表明OA的进展得到了缓解(如附图5中F所示)。同样的，通过番红固绿染色观察表层关节软骨的状态，db/db鼠+关节腔注射PBS组中软骨损伤是最严重的，注射TTP488可以减轻软骨的损伤(如附图5中G所示)。OARSI评分提示了类似的结果，db/db鼠+关节腔注射PBS组得到最高评分(如附图5中H所示)。上述结果表明，AGEs-RAGE信号的激活加剧了KOA的进展。

1.2.4 mTOR信号通路、MAPK信号通路和WNT信号通路位于AGEs-RAGE信号下游并在半月板退化过程中激活

在明确了AGEs-RAGE信号对半月板细胞成骨及半月板钙化形成有促进作用之后，接下来进一步探究AGEs-RAGE产生该效应的下游机制。本发明中通过GEO数据库查询到了两个与OA期间半月板细胞基因表达变化密切相关的芯片数据——GSE185064和GSE191157，GSE185064芯片是针对健康半月板组织样本与骨关节炎半月板组织样本的总mRNA测序数据(n＝4)，GSE191157芯片则是针对青年人群半月板组织样本与老年人群半月板组织样本的总RNA测序数据(n＝4)。为了得到更具有代表性的结果，利用R软件包inSilicoMerging对数据集进行合并，随后进一步使用R软件包limma(version 3.42.2)的removeBatchEffect函数进行去除批次效应，最终获得去除批次效应后的矩阵，结果如附图6所示。在附图6中，A为利用R软件包inSilicoMerging对GSE185064和GSE191157两个数据集进行合并，并使用R软件包limma的removeBatchEffect函数进行去除批次效应，箱线图提示去除批次效应之前各个数据集的样本分布差异较大，去除批次效应之后各个数据集之间的数据分布趋于一致,中位数在一条线上；B为UMAP图可以观察到去除批次效应之前各个数据集的样本各自聚在一起，去除批次效应之后各个数据集之间的样本互相聚类交织在一起，提示了较好的去除了批次效应；C为使用合并数据集进行GSEA分析，结果提示细胞周期检查点、IL-2信号、Toll信号、mTOR信号、MAPK信号和WNT信号通路在退变的半月板中富集；D为韦恩图显示，mTOR信号、MAPK信号和WNT信号通路是AGEs-RAGE的下游信号通路，同时在退化的半月板中富集。

从箱线图中可以观察到去除批次效应之前各个数据集的样本分布差异较大，提示了具有批次效应，去除批次效应之后各个数据集之间的数据分布趋于一致,中位数在一条线上,提示较好的去除了批次效应(如附图6中A所示)。从UMAP图可以观察到去除批次效应之前各个数据集的样本各自聚在一起，提示了具有批次效应，去除批次效应之后各个数据集之间的样本互相聚类交织在一起，提示了较好的去除了批次效应(如附图6中B所示)。随后将合并的数据集进行基因集富集分析(GSEA)。结果显示，在退化半月板中存在大量的信号通路富集，如细胞周期检查点通路，IL-2信号通路、Toll信号通路、mTOR信号通路、MAPK信号通路和WNT信号通路等(如附图6中C所示)。结合既往的AGEs-RAGE通路相关研究报道，我们最终选定mTOR信号通路、MAPK信号通路和WNT信号通路进行后续的进一步研究(如附图6中D所示)。

1.2.5 mTOR信号通路位于AGEs-RAGE信号下游并在半月板细胞成骨中起到重要作用

为了进一步确定哪个通路在作为AGEs-RAGE下游靶标的同时在半月板细胞成骨中起到关键作用。本发明中在成骨诱导的不同时间点通过蛋白印迹及实时荧光定量PCR实验比较了三个信号通路中的代表性基因表达水平的变化情况(结合GSEA结果，PI3K/AKT/mTOR用于代表mTOR信号通路，p38/ERK用于代表MAPK信号通路，β-catenin用于代表WNT信号通路)。

蛋白印迹实验结果如附图7所示，在附图7中，A为蛋白印迹分析检测半月板原代细胞成骨诱导期间不同时间点PI3K/AKT/mTOR、p38/ERK和β-catenin的总蛋白水平及激活情况，结果显示PI3K/AKT/mTOR的总蛋白水平和激活程度随着半月板原代细胞成骨诱导时间的增加而显著增加；B为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝3；C为蛋白印迹分析靶向激活或抑制AGEs-RAGE信号对PI3K/AKT/mTOR、p38/ERK和β-catenin的总蛋白水平及激活程度的影响，结果显示AGEs-RAGE并不显著影响各个通路的总蛋白表达水平，但能显著影响蛋白的磷酸化水平；D为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝3；E为实时荧光定量PCR检测半月板原代细胞成骨诱导期间不同时间点PI3K/AKT/mTOR、p38/ERK和β-catenin的mRNA水平，结果显示除β-catenin外其余通路各个基因的mRNA表达水平均随着成骨诱导时间的延长而明显增加，以PI3K/AKT/mTOR增加最为显著，n＝3；F为实时荧光定量PCR检测靶向激活或抑制AGEs-RAGE信号对PI3K/AKT/mTOR、p38/ERK和β-catenin的mRNA水平影响情况，结果显示无论激活或者抑制AGEs-RAGE信号对上述通路中各个基因的mRNA表达均无显著的影响，n＝3。数据描述为平均值±标准差，多组间的比较采用单因素方差分析和图基事后检验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

从附图7中可以看出，随着成骨诱导的时间的延长，半月板原代细胞中PI3K/AKT/mTOR三个基因的蛋白质水平(总蛋白和磷酸化蛋白)都明显增加，在另外两个通路中，ERK及β-catenin总蛋白水平无显著变化(如附图7中A,B所示)。实时荧光定量PCR的结果显示PI3K/AKT/mTOR三个基因的mRNA水平随着成骨诱导显著升高，上升幅度较p38更大，β-catenin的mRNA水平在成骨诱导期间无显著变化(如附图7中E所示)。综合以上结果，可以推测PI3K/AKT/mTOR信号通路在半月板细胞成骨过程中起着最关键的作用。同时，进一步观察了AGEs-RAGE信号对三个通路蛋白表达量及激活情况的影响，蛋白印迹实验结果提示AGEs处理增强了PI3K/AKT/mTOR的激活，而TTP488处理导致了相反的效果，在另外两个通路中也起到了类似的效果(如附图7中C,D所示)。值得注意的是，AGEs-RAGE信号并未影响三个通路中所有基因的总蛋白水平和mRNA水平(如附图7中C,D,F所示)，而是单纯的影响了通路的活性。因此，本发明中选定PI3K/AKT/mTOR信号通路进行进一步的研究。

为了评估PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性对于半月板原代细胞成骨能力的影响，本发明中评估了PI3K抑制剂(Copanlisib)、AKT抑制剂(MK2206)和mTOR抑制剂(Rapamycin)对半月板细胞的成骨分化能力的影响，结果如附图8所示。在附图8中，A为通过茜素红和ALP染色检测靶向抑制PI3K/AKT/mTOR轴对半月板原代细胞成骨分化能力的影响，结果显示Copanlisib、MK2206和Rapamycin对半月板原代细胞的成骨能力有显著的抑制作用，其中Rapamycin的作用最为明显；B为茜素红染色的定量分析，n＝3。O.I.，成骨诱导，当没有注明诱导时间时指进行成骨诱导21天。数据描述为平均值±标准差，多组间的比较采用单因素方差分析和图基事后检验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

附图8中显示任何一种抑制剂都明显的抑制了成骨能力，其中mTOR抑制剂Rapamycin的效果最为显著。以上数据表明，PI3K/AKT/mTOR信号通路位于AGEs-RAGE信号下游且在半月板细胞成骨分化过程中起到了十分重要的作用。

1.2.6 ATF4是半月板细胞成骨过程中重要的成骨转录因子

本发明中选取RUNX2、OSX、ATF4这三个具有代表性的成骨相关转录因子作为研究对象。

首先通过实时荧光定量PCR评估了半月板原代细胞成骨诱导过程中ATF4、RUNX2和OSX的mRNA水平变化，结果如附图9所示，在附图9中，A为实时荧光定量PCR检测半月板原代细胞成骨诱导期间不同时间点ATF4、RUNX2和OSX的表达变化情况，结果显示RUNX2和OSX的mRNA水平随着半月板原代细胞成骨诱导时间延长而增加，ATF4的mRNA水平无明显变化，n＝3；B为A分组中各个基因的平均△Ct值比较，结果显示ATF4的△Ct值为2左右，显著小于另外两个基因。n＝3；C为实时荧光定量PCR检测半月板原代细胞成骨诱导过程中靶向激活或抑制AGEs-RAGE信号对ATF4、RUNX2和OSX的mRNA水平的影响，结果显示上述基因的mRNA水平不受AGEs-RAGE信号的影响，n＝3；D为C分组中各个基因的平均△Ct值比较，结果显示ATF4的△Ct值为2左右，显著小于另外两个基因。n＝3；E为蛋白印迹实验检测半月板原代细胞成骨诱导期间不同时间点ATF4蛋白的含量变化，结果显示ATF4蛋白随着半月板原代细胞成骨诱导而明显增加；F为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝3；G为蛋白印迹实验检测半月板原代细胞成骨诱导过程中靶向激活或抑制AGEs-RAGE信号对ATF4蛋白水平的影响，结果显示AGEs处理显著增加ATF4蛋白水平，而TTP488则产生了相反的效果；H为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝3。O.I.，成骨诱导，当没有注明诱导时间时指进行成骨诱导21天。数据描述为平均值±标准差，两者间的比较采用非配对双尾t检验分析，多组间的比较采用单因素方差分析和图基事后检验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

结果显示，随着成骨诱导时间增加，RUNX2和OSX的mRNA水平均有所上升，但ATF4的mRNA水平无显著变化(如附图9中A所示)。随后进一步评估了靶向激活或抑制AGEs-RAGE信号对上述三个成骨相关转录因子mRNA的影响，结果显示无论激活或者抑制AGEs-RAGE均对mRNA水平无显著影响(如附图9中B所示)。值得注意的是，ATF4的mRNA水平在半月板原代细胞中始终保持在一个显著的高水平，ATF4在实时荧光定量PCR过程中的Ct值与内参基因GAPDH的Ct值差值仅在2左右(如附图9中B,D所示)。

进一步的，本发明中还评估ATF4的蛋白水平在半月板原代细胞成骨诱导期间的变化情况。蛋白印迹分析表明与RUNX2及OSX相比，ATF4蛋白水平随着成骨诱导时间延长而明显增加(如附图9中E,F所示)。与此同时，在成骨诱导期间的AGEs处理进一步上调了ATF4的蛋白水平(如附图9中G,H所示)。这些结果强烈地表明ATF4作为AGEs-RAGE的下游在半月板原代细胞成骨过程中起到了独特的作用。

为了进一步评估ATF4的作用，本发明中通过构建慢病毒(LV)载体在半月板原代细胞中敲减了ATF4的表达水平，随后通过实时荧光定量PCR及蛋白印迹分析确定了敲减效率，结果如附图10所示，在附图10中，A和B分别为实时荧光定量PCR及蛋白印迹实验检测不同序列慢病毒感染对ATF4的mRNA含量和蛋白含量的影响，结果显示所有慢病毒都显著降低了ATF4的mRNA水平和蛋白水平，n＝3；C为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝3；D为茜素红染色和ALP染色检测ATF4敲减对半月板原代细胞成骨能力的影响，结果显示ATF4敲减显著抑制了半月板原代细胞的成骨能力；E为茜素红染色的定量分析，n＝3。O.I.，成骨诱导，当没有注明诱导时间时指进行成骨诱导21天。数据描述为平均值±标准差，两者间的比较采用非配对双尾t检验分析，多组间的比较采用单因素方差分析和图基事后检验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

从附图10中可以看出，3号慢病毒具有最佳的敲减效率，因此后续的ATF4敲减均使用3号慢病毒实现。随后通过茜素红及ALP染色评估了ATF4敲减对半月板原代细胞成骨能力的影响，与假设一致，ATF4敲减显著抑制了半月板原代细胞的成骨能力(如附图10中D,E所示)。以上结果表明，ATF4在AGEs-RAGE信号激活所引发的半月板细胞成骨分化过程中作为成骨相关转录因子起到了关键作用。

综上所述，本发明中首次提出了半月板细胞成骨分化与半月板钙化形成之间的联系，并指出AGEs-RAGE信号在其中的正向作用，同时我们发现在半月板细胞成骨分化过程中mTOR活性及ATF4蛋白水平急剧升高并受到AGEs-RAGE信号调控，提示了mTOR及ATF4作为AGEs-RAGE的下游在半月板细胞成骨过程中发挥了重要作用，这为半月板钙化形成的机制提供了新的见解，并为针对半月板钙化这一骨关节炎新兴治疗策略提供了更多的候选靶点。

二、mTOR-ATF4轴在半月板钙化形成中的作用及机制研究

2.1方法

2.1.1免疫沉淀

1)总蛋白获取：收获处理完毕的半月板细胞，使用PBS清洗后依据细胞量加入适量RIPA弱裂解液(含蛋白酶抑制剂及泛素醛)，将细胞置于冰上裂解1h，用一次性细胞刮将裂解后的细胞刮下，转移到1.5mLEP管中，再次静置裂解30min，预冷离心机后将EP管放入12000g 4℃离心15min；用移液器小心吸出上清液，按先前方法进行BCA浓度测定后，每个蛋白样本各取30μL作为input对照，加入1/4体积的5×loading buffer，混匀后置于金属浴上100℃变性10min，备用。

2)免疫沉淀蛋白纯化：剩余蛋白上清样本用A/G磁珠进行纯化，首先备好磁力架(分离磁珠)，依据样本量准备适量蛋白用A/G磁珠，用试剂盒配备的磁珠洗涤液重悬洗涤两次。加入到已裂解好的蛋白样本中，4℃翻转过夜。第二天，用磁力架分离磁珠，取出上清转移到新的EP管。(蛋白纯化完毕)

3)免疫沉淀：另取新的蛋白A/G磁珠，按上述再次清洗后加入纯化后的蛋白样本中，同时根据样本总蛋白量加入适宜体积的ATF4抗体，4℃翻转过夜。将反应过夜的抗体/蛋白/磁珠混合液用磁力架收集磁珠，再用PBS(含1％PMSF)溶液洗涤两次后，加入loadingbuffer，于金属浴上100℃煮沸10min。将变性后的样本转移到离心机内，12000g瞬时离心，小心收集上清到新的EP管中，避免吸入磁珠，而后按第一部分所述蛋白电泳步骤进行SDS-PAGE电泳及后续免疫印迹分析ATF4泛素化水平。

2.1.2质谱分析检测代谢物含量

1)样本前处理：收获处理完毕的半月板原代细胞，加入RIPA裂解液，按先前的步骤提取总蛋白并进行BCA蛋白定量。取100uL总蛋白裂解液，加入10uL现配的TCEP工作液(200mM)，吹打混匀后，室温静置15min；往蛋白裂解液中加入100uL NEM工作液(50mM)及1mL甲醇溶液(含内标Phe-D5)，涡旋混匀，将样本置于-20℃反应2h；预冷离心机，将反应完毕的样本从-20℃取出，涡旋1min后，15000rpm 4℃离心10min；小心取出上清溶液到新EP管，将样本转移至真空浓缩仪(2000rpm，37℃)内进行干燥，待溶剂完全挥干后，将样本保存在-80℃冰箱。

2)质谱检测：上机检测前，用含5％甲醇的超纯水复溶样本，并转移至进样小瓶中，放入仪器内上机检测，采用ESI源对氨基酸及代谢物在正负离子模式下进行MRM扫描。

3)色谱检测：色谱柱采用Waters X Bridge

表12样本洗脱程序

2.1.3细胞内精氨酸含量检测

本发明使用试剂盒检测精氨酸含量，实验按照试剂盒说明书指示进行，实验主要原理为酶联接免疫吸附剂测定，试剂盒中提供的微量板已用精氨酸蛋白预涂覆。

1)细胞内代谢物准备：使用细胞刮刮下处理完毕的半月板原代细胞，用PBS稀释细胞悬液，使细胞浓度达到100万/ml左右。利用液氮和37℃水浴对样品进行两到三次快速的冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。随后3000rpm离心20分钟。仔细收集上清，取少量进行BCA蛋白定量用于标准化。-20℃或者-80℃冷冻保存。

2)酶联免疫吸附：将试剂盒中所有试剂室温平衡后，于酶标板每孔加入标准品工作液50μL或样品50μL，然后立即加入50μL生物素结合物工作液，混匀后37℃孵育60min。随后弃去酶标板中液体，每孔加入200μL洗涤缓冲液，洗涤3次。拍干后每孔加入100μL HRP酶工作液，37℃孵育60min。弃去酶标板内液体，每孔加入200μL洗涤缓冲液，洗涤5次。拍干后每孔加入90μL TMB，37℃孵育20min。最后每孔加入50μL中止液，立即测量其于450nm波长处吸光度。通过比较样品与标准曲线的OD值来确定样品中精氨酸的浓度。

其余实验方法和实验数据分析方法与第一部分相同。

2.2实验结果

2.2.1 ATF4与mTOR形成正反馈环促进半月板原代细胞成骨分化

首先通过蛋白印迹实验评估Rapamycin(mTOR抑制)对ATF4的影响，结果如附图11所示，在附图11中，A为蛋白印迹实验分析mTOR与ATF4的上下游关系，结果显示半月板原代细胞成骨诱导过程中Rapamycin处理导致mTOR活性和ATF4蛋白水平均下降，其中ATF4蛋白水平下降的效果被MG132逆转，mTOR活性下降的效果被少部分逆转。同时ATF4敲减导致ATF4蛋白水平和mTOR活性下降，这种效果被MHY1485部分逆转，mTOR活性下降被逆转较多水平；B为实时荧光定量PCR分析mTOR和ATF4间的相互作用，结果显示mTOR的mRNA水平不受ATF4敲减的影响，ATF4的mRNA水平同样不受Rapamycin的影响，n＝3；C,D为使用茜素红染色靶向mTOR或ATF4对半月板原代细胞成骨分化能力的影响，结果显示Rapamycin和ATF4敲减均可造成半月板原代细胞成骨能力下降，这种效应分别可被MG132及MHY1458所部分逆转；E,G为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝3；F,H为茜素红染色的定量分析，n＝3。O.I.，成骨诱导，当没有注明诱导时间时指进行成骨诱导21天。数据描述为平均值±标准差，两组间的比较采用非配对双尾t检验分析，多组间的比较采用单因素方差分析和图基事后检验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

附图11显示成骨诱导过程中Rapamycin处理显著降低了ATF4蛋白水平(如附图11中A,E,G所示)，这提示ATF4处于mTOR的下游。但有趣的是，当使用慢病毒敲减ATF4后同样导致了mTOR的活性下降。以上实验结果表明，mTOR和ATF4在半月板原代细胞成骨分化过程中形成一个正反馈回路，互相刺激对方的激活和累积。值得注意的是，ATF4和mTOR的mRNA水平都没有受到对方的影响(附图11中B所示)，这提示ATF4和mTOR之间的相互作用可能是在蛋白质水平。

随后挽救实验被用于进一步证实我们的假设，本发明将使用蛋白酶体抑制剂MG132来实现ATF4的过表达，这是因为在半月板原代细胞中ATF4的mRNA表达水平极高，用常规方法很难达到过表达的目的，结果如附图12所示，在附图12中，A为用茜素红染色检测MG132对半月板原代细胞成骨分化能力的影响，结果显示MG132处理导致半月板细胞的成骨能力增强，这一效果被ATF4敲减完全逆转；B为茜素红染色的定量分析，n＝3；C为蛋白印迹实验检测MG132对半月板原代细胞中mTOR活性及ATF4蛋白水平的影响，结果显示MG132处理导致ATF4蛋白水平升高，这种影响被ATF4敲减完全逆转，mTOR活性未显著受到MG132的影响；D为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝3；E为茜素红染色检测MHY1485对半月板原代细胞成骨能力的影响，结果显示MHY1485处理对半月板原代细胞成骨能力无显著影响；F为茜素红染色的定量分析，n＝3；G为蛋白印迹实验检测MHY1485对半月板原代细胞成骨分化过程中mTOR活性及ATF4蛋白水平的影响，结果显示MHY1485处理增强了mTOR的活性，但对ATF4蛋白水平无显著影响；H为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝3。O.I.，成骨诱导，当没有注明诱导时间时指进行成骨诱导21天。数据描述为平均值±标准差，两者间的比较采用非配对双尾t检验分析，多组间的比较采用单因素方差分析和图基事后检验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

首先通过蛋白印迹实验确定了MG132处理可造成半月板原代细胞中ATF4积累(如附图12中C,D所示)，更加值得注意的是ATF4敲减在蛋白水平完全逆转了MG132的作用(如附图12中C,D所示)，并同时完全逆转了MG132所导致的半月板原代细胞成骨分化能力增强的情况(如附图12中A,B所示)，这表明MG132虽然不是特异性的ATF4激动剂，但MG132促进半月板原代细胞成骨能力是完全依赖于ATF4实现的，因此MG132在半月板原代细胞成骨过程中依然起到相对独特的作用。对于mTOR的挽救则使用公认的mTOR激动剂MHY1485来实现。

进一步的挽救实验结果提示，Rapamycin所造成的半月板原代细胞成骨分化能力下降的作用被MG132所部分逆转(如附图11中C,F所示)。同时，MHY1485也能够部分逆转ATF4敲减所造成的半月板原代细胞成骨能力下降(如附图11中D,H所示)。与此同时，蛋白印迹实验结果表明Rapamycin所造成的ATF4蛋白水平下降被MG132逆转(如附图11中A,E,G所示)，ATF4敲减所造成的mTOR活性下降同样可以被MHY1485逆转(如附图11中A,E,G所示)，这表明挽救实验是有效的。该部分实验结果还有更多值得关注的细节，半月板原代细胞成骨诱导过程中单一的MG132处理导致了ATF4积累，但却没有增强mTOR活性(如附图12中C,D所示)，单一的MHY1485处理导致了mTOR活性增强，但却没有增加ATF4的累积，也没有导致半月板原代细胞成骨能力的增强(如附图12中E-H所示)。

综上所述，该部分实验结果表明mTOR与ATF4在半月板原代细胞成骨诱导期间形成了正反馈环，该正反馈环进一步刺激了半月板原代细胞的成骨能力。

2.2.2 mTOR通过抑制ATF4的泛素-蛋白酶体降解导致ATF4累积

为了进一步研究ATF4-mTOR正反馈环背后的形成机制。本发明中首先探讨了mTOR是如何参与ATF4的调控的。2.2.1部分的实验提示ATF4的mRNA表达水平不受Rapamycin的影响，且ATF4的mRNA水平在半月板原代细胞中一直处于很高的水平，因此mTOR影响ATF4调控的可能性不大，我们推测mTOR通过转录后的机制调节ATF4的蛋白水平；基于现有技术中对mTOR和ATF4之间关系的研究成果，可以得出mTOR通过调节ATF4的磷酸化水平来影响其活性。在Ser219位点和Ser245位点中，若mTOR在下游激活ATF4的Ser219位点，那将直接导致ATF4被βTrCP识别随后被降解，考虑到在现有的实验结果中mTOR的活性与ATF4的积累趋于正相关，再加之ATF4的Ser245磷酸化与成骨过程密切相关，因此本部分研究中重点研究了mTOR对于ATF4的Ser245的磷酸化水平的影响，并观察了mTOR活性对ATF4蛋白稳定性的影响。

首先，通过放线菌酮阻断细胞蛋白质的合成后通过蛋白印迹实验观察了不同时间点各个蛋白的变化情况，结果如附图13所示。在附图13中，A为蛋白印迹实验检测mTOR活性对ATF4蛋白降解速率的影响，结果显示Rapamycin处理显著加快了ATF4蛋白的降解速率，同时降低了ATF4的磷酸化水平；B为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝3；C为蛋白印迹实验检测mTOR活性对ATF4蛋白泛素化程度的影响，结果显示Rapamycin处理显著增加了ATF4蛋白的泛素化程度；D为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝3。数据描述为平均值±标准差，多组间的比较采用单因素方差分析和图基事后检验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

附图13的结果显示Rapamycin处理显著加速了ATF4的降解速率，同时伴随着ATF4的Ser245位点磷酸化水平的显著下降(如附图3中A,B所示)。值得注意的是放线菌酮不会显著影响mTOR的活性及蛋白水平，这在之前的研究中也有过相关的报道。ATF4的降解主要依赖于泛素-蛋白酶体途径，为此进一步分析mTOR活性对于ATF4蛋白泛素化水平的影响，蛋白印迹实验结果显示Rapamycin处理明显增加了ATF4的泛素化水平(如附图13中C,D所示)。以上结果表明mTOR刺激ATF4的Ser245位点磷酸化降低其泛素化水平，进而导致ATF4蛋白的累积。

2.2.3 ATF4通过增加精氨酸的摄取激活mTOR

本发明中还进一步研究了正反馈环中ATF4是如何参与到mTOR活性调控中的。如前所述，ATF4在细胞中主要是作为转录因子发挥作用。然而，ATF4及mTOR作为两个目前已被广泛研究的蛋白质，仍未见明确的研究报道ATF4在转录上调控mTOR。与此同时，前期的结果还表明ATF4敲减并不会显著影响mTOR的总蛋白水平。所以，可以推测在半月板原代细胞中ATF4同样未在转录水平上调控mTOR。值得注意的是，ATF4在作为成骨分化的重要转录因子之一的同时，也是一种十分重要的应激诱导表达蛋白，在促进营养物质的合成和吸收方面具有重要作用，而与此同时mTOR最重要的激活因素之一就是营养物质，尤其是氨基酸的水平。综上所述，可以推测在AGEs诱导强化的mTOR-ATF4正反馈环中，营养物质的代谢参与了ATF4对mTOR活性的调控。

为了发现有潜力的代谢物，本发明中首先关注了氨基酸及其衍生物在半月板细胞成骨分化过程中及AGEs处理后的变化情况，结果如附图14所示，在附图14中，A为使用质谱分析检测半月板原代细胞成骨过程中及AGEs处理对半月板原代细胞内氨基酸及其衍生物含量的影响，箭头标注的位置为精氨酸含量的变化，n＝3；B为使用茜素红染色检测精氨酸缺乏对于半月板原代细胞成骨能力的影响，结果显示精氨酸缺乏导致成骨能力下降，MG132及MHY1458可逆转这一效应；C为茜素红染色的定量分析，n＝3；D为蛋白印迹实验检测精氨酸缺乏对半月板原代细胞成骨过程中mTOR-ATF4正反馈环的影响，结果显示精氨酸缺乏导致细胞中ATF4蛋白水平升高，mTOR活性下降，MG132及MHY1458可进一步增加ATF4蛋白水平，并少量增加mTOR活性；E为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝3；F为使用ELISA法检测精氨酸缺乏对半月板原代细胞成骨过程中细胞内精氨酸含量的影响，结果显示精氨酸缺乏导致了细胞内精氨酸含量显著降低，MG132及MHY1458可部分逆转这一效应，n＝3。G为使用ELISA法检测靶向AGEs-RAGE信号及mTOR-ATF4正反馈环后半月板原代细胞内精氨酸含量的变化，结果显示半月板原代细胞成骨过程中存在精氨酸积累，AGEs及MG132可增强这一效应，TTP488、ATF4敲减及Rapamycin可逆转这一效应，MHY1458对其无显著影响，n＝3；H为使用ELISA法检测靶向mTOR-ATF4正反馈环对半月板原代细胞成骨过程中细胞内精氨酸含量的影响，结果显示MHY1458无法逆转ATF4敲减所造成的细胞内精氨酸含量下降，但MG132可逆转Rapamycin造成的细胞内精氨酸含量下降，n＝3。O.I.，成骨诱导，当没有注明诱导时间时指进行成骨诱导21天。数据描述为平均值±标准差，多组间的比较采用单因素方差分析和图基事后检验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

附图14的结果显示，多种氨基酸及其衍生物的水平在成骨分化过程中发生了显著变化(如附图14中A所示)。其中精氨酸的积累引起了我们的兴趣。原因主要有以下三点：1)细胞中精氨酸最重要的转运载体之一SLC7A1直接受到了ATF4的调控；2)精氨酸是mTOR的重要激活因素之一；3)已有研究报道在成骨过程中存在精氨酸的积累。质谱分析结果显示，在成骨分化过程中，细胞内的精氨酸水平升高，使用AGEs处理后其含量进一步增加。我们使用精氨酸定量ELISA试剂盒进一步验证了精氨酸的变化，结果显示AGEs、MG132均可导致半月板原代细胞成骨过程中细胞内精氨酸含量进一步增加，而单独MHY1458处理则没有类似的效果(如附图14中G所述)，结合附图12的实验结果，这些结果表明细胞内精氨酸含量增加更可能与正反馈环中的ATF4有关，与此同时，半月板原代细胞成骨诱导过程中细胞内精氨酸的积累可以被TTP488、ATF4敲减和Rapamycin部分逆转(如附图14中G所示)。为了进一步验证精氨酸在半月板原代细胞成骨分化过程中的作用，精氨酸缺乏的培养基被用于半月板原代细胞成骨诱导，结果显示精氨酸缺乏会显著抑制半月板原代细胞的成骨分化能力(如附图14中B,C所示)。有趣的是，这种抑制作用会被MG132和MHY1485所部分逆转。为了了解背后原因我们同时测量了缺乏精氨酸成骨诱导时半月板原代细胞内精氨酸水平的变化，结果显示在培养基不含精氨酸的前提下，MG132和MHY1485仍可增加细胞内精氨酸的含量(如附图14中F所示)，这表明ATF4或mTOR影响了精氨酸的细胞内代谢途径，MG132和MHY1458可部分逆转精氨酸缺乏导致的细胞成骨能力下降原因可能在此。同时蛋白印迹实验结果表明，在缺乏精氨酸的培养基中，成骨分化过程半月板原代细胞内ATF4蛋白水平增加的同时mTOR活性却受到抑制，这提示mTOR-ATF4正反馈在精氨酸缺乏的情况下被破坏了(如附图14中D,E所示)。

为了进一步评估培养环境中精氨酸对于半月板原代细胞成骨能力的影响，过量氨基酸(2倍常规培养基中精氨酸含量：168mg/L)的培养基被用于进行挽救实验，结果如附图15所示，在附图15中，A为茜素红染色检测过量氨基酸对半月板原代细胞成骨能力的影响，结果显示过量的氨基酸不会增强细胞成骨能力，也不能逆转ATF4敲减所导致的细胞成骨能力下降；B为茜素红染色的定量分析，n＝3；C为蛋白印迹实验检测过量精氨酸对半月板原代细胞成骨过程中mTOR-ATF4正反馈环活性的影响，结果显示过量精氨酸不会导致正反馈环活性增强，也不能逆转ATF4敲减所导致的正反馈环活性下降；D为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝3；E为使用ELISA法检测过量精氨酸对半月板原代细胞成骨过程中细胞内精氨酸含量的影响，结果显示过量精氨酸不会导致细胞内精氨酸含量进一步上升，也不能逆转ATF4敲减所导致的细胞内精氨酸含量下降，n＝3；F为茜素红染色检测半月板原代细胞成骨能力变化，结果显示过量的氨基酸不能逆转Rapamycin所导致的细胞成骨能力下降；G为茜素红染色的定量分析，n＝3；H为蛋白印迹实验检测mTOR-ATF4正反馈环活性的变化，结果显示过量精氨酸不能逆转Rapamycin所导致的正反馈环活性下降；I为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝3；J为使用ELISA法检测细胞内精氨酸含量的变化，结果显示过量精氨酸不能逆转Rapamycin所导致的细胞内精氨酸含量下降，n＝3。Arg++，过量氨基酸，指所使用的精氨酸浓度为常规培养基中精氨酸浓度的两倍(168mg/L)。O.I.，成骨诱导，当没有注明诱导时间时指进行成骨诱导21天。数据描述为平均值±标准差，多组间的比较采用单因素方差分析和图基事后检验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

结果显示，茜素红染色显示过量的精氨酸不能导致半月板原代细胞成骨能力增强，也不能逆转ATF4敲减所导致的成骨分化能力下降(如附图15中A，B所示)，蛋白印迹实验显示过量氨基酸不会显著导致ATF4蛋白水平及mTOR活性升高，也不能逆转ATF4敲减所导致的ATF4蛋白水平下降和mTOR活性的下降(如附图15中C，D所示)，与此同时，通过ELISA分析半月板原代细胞内精氨酸的含量变化，结果显示过量氨基酸不会导致细胞内氨基酸含量显著上升，也不能逆转ATF4敲减导致的细胞内精氨酸含量的减少(如附图15中E所示)。我们继续分析了过量氨基酸对雷帕霉素的影响，也展现出了类似的结果(如附图15中F-J所示)，这些数据表明，常规培养环境下的精氨酸已能完全满足半月板原代细胞成骨过程中细胞内氨基酸的需求，限制细胞内精氨酸含量的主要因素是ATF4蛋白水平或mTOR活性(或者说正反馈环的活性)，而不是细胞所处环境中精氨酸含量。

然而，因为正反馈环的存在，目前仍然难以确定到底是ATF4还是mTOR直接负责半月板原代细胞中精氨酸的摄取，为了进一步明确ATF4-mTOR正反馈换在精氨酸摄取中的确切作用。本发明进一步设计了挽救实验，结果表明MG132完全逆转了Rapamycin所导致的半月板原代细胞精氨酸含量下降的情况，但MHY1485却没有逆转ATF4敲减所导致的类似的作用(如附图14中H所示)，这表明半月板原代细胞中精氨酸的积累更可能位于正反馈调节网络中mTOR的上游、ATF4的下游。结合精氨酸缺乏介质中的蛋白表达模式(如附图11中A所示)，可以推测精氨酸的积累是ATF4蛋白水平增加的结果，是mTOR激活的触发因素。综上所述，本部分实验结果表明ATF4促进半月板原代细胞中精氨酸的积累以激活mTOR。

2.2.4 AGEs-RAGE通过调控mTOR-ATF4正反馈环促进半月板原代细胞成骨

本发明中还进一步研究了AGEs-RAGE信号对ATF4-mTOR正反馈环活性的影响，以及AGEs-RAGE下游对于半月板原代细胞成骨能力的影响是否是通过mTOR-ATF4正反馈环实现的。首先，通过茜素红染色检测了激活或抑制AGEs-RAGE信号后靶向mTOR或ATF4对半月板原代细胞成骨能力的影响，结果如附图16所示，附图16中，A为茜素红染色检测在半月板原代细胞成骨分化过程中使用AGEs进一步激活AGEs-RAGE信号后靶向抑制ATF4或mTOR对成骨能力的影响，结果显示AGEs增强半月板原代细胞成骨分化能力的作用被ATF4敲减及Rapamycin完全逆转；B为茜素红染色的定量分析，n＝3；C为茜素红染色检测在半月板原代细胞成骨分化过程中使用TTP488抑制AGEs-RAGE信号后靶向激活ATF4或mTOR对成骨能力的影响，结果显示TTP488对半月板原代细胞成骨分化能力的作用被ATF4累积及MHY1485部分逆转；D为茜素红染色的定量分析，n＝3；E为免疫沉淀及蛋白印迹实验分析半月板原代细胞成骨过程中激活或抑制AGEs-RAGE信号后靶向mTOR对ATF4泛素化水平的影响，结果显示AGEs减少的ATF4泛素化水平可被Rapamycin逆转，TTP488增加的ATF4泛素化水平可被MHY1485逆转；F为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝3；G为ELISA分析半月板原代细胞成骨过程中激活或抑制AGEs-RAGE信号后靶向ATF4对细胞内精氨酸水平的影响，结果显示AGEs增加的细胞内精氨酸水平可被ATF4敲减逆转，TTP488减少的细胞内精氨酸水平可被MG132逆转。O.I.，成骨诱导，当没有注明诱导时间时指进行成骨诱导21天。数据描述为平均值±标准差，多组间的比较采用单因素方差分析和图基事后检验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

附图16的结果显示AGEs增强的半月板原代细胞的成骨能力可被ATF4敲减或Rapamycin完全逆转(如附图16中A,B所示)，而TTP488对半月板原代细胞成骨能力的抑制作用也可被MG132或MHY1485部分逆转(如附图16中C,D所示)。

蛋白印迹实验结果如附图17所示，附图17中，A为蛋白印迹实验分析半月板原代细胞成骨诱导过程中AGEs处理后靶向抑制ATF4或mTOR对正反馈环活性的影响，结果显示AGEs增强的ATF4蛋白水平及mTOR活性可以被ATF4敲减或Rapamycin完全逆转；B为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝3；C为蛋白印迹实验分析半月板原代细胞成骨诱导过程中TTP488处理后靶向激活ATF4或mTOR对正反馈环活性的影响，结果显示TTP488抑制的ATF4蛋白水平及mTOR活性可以被MG132或MHY1485部分逆转；D为使用ImageJ对蛋白印迹条带进行灰度分析以进行相对定量，n＝3；O.I.，成骨诱导，当没有注明诱导时间时指进行成骨诱导21天。数据描述为平均值±标准差，多组间的比较采用单因素方差分析和图基事后检验。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

附图17的结果表明药物的处理起到了相应的作用(如附图17中A-D所示)。这些结果表明，AGEs-RAGE促进半月板细胞成骨的能力是通过mTOR-ATF4正反馈回路实现的，同时结合第一部分的实验结果，可以推测AGEs-RAGE同时影响了正反馈环中ATF4及mTOR的活性，是正反馈环继续活化的一个强大的刺激因素。此外，我们进一步分析了AGEs-RAGE对半月板原代细胞中ATF4泛素化情况以及细胞内精氨酸含量的影响，结果显示ATF4的泛素化水平同样受到AGEs-RAGE的调节，但这种调节可以通过靶向抑制mTOR阻断(如附图16中E,F所示)，这表明AGEs-RAGE并未直接影响ATF4的泛素化水平，而是通过影响mTOR后进一步影响ATF4泛素化水平的，当然，这不能排除AGEs-RAGE可能存在其他方式直接影响ATF4蛋白的水平。随后，类似的分组模式被用于检测AGEs-RAGE对细胞内的精氨酸含量的影响，结果显示AGEs-RAGE对精氨酸的影响也可以通过靶向ATF4阻断(如附图16中G所示)，这同样表明AGEs-RAGE信号没有直接影响细胞内精氨酸的水平，而是通过ATF4来实现间接影响的。上述结果表明，半月板原代细胞中mTOR-ATF4正反馈环的活性是AGEs-RAGE发挥其下游作用的必要条件。

同时，本发明还在小鼠膝关节切片中通过免疫荧光分析了p-mTOR、ATF4和AGEs在小鼠半月板上的分布情况，不同的蛋白在相邻的切片上进行染色。小鼠被分组及处理按第一部分的描述进行，通过ALP染色标记AGEs-RAGE在小鼠体内对于mTOR-ATF4正反馈环的影响结果如附图18所示，通过ALP染色标记AGEs-RAGE在小鼠体内对于mTOR-ATF4正反馈环的影响结果如附图19所示，在附图18中，A为通过ALP染色标示不同分组小鼠半月板中成骨分化活跃的区域，通过免疫荧光染色标示出不同分组小鼠半月板中ATF4、p-mTOR及AGEs表达量高的区域，结果显示ATF4、p-mTOR和AGEs高表达区域(使用黑色箭头标出)更多出现在半月板形成的毛细血管样结构的内部，它们与ALP阳性区域(使用红色箭头标出)相邻而不是重叠；B为通过CTvox重建小鼠半月板区域钙化灶的三维模型，从切面可以观察到钙化灶内存在大量管腔样结构，ATF4、p-mTOR和AGEs高表达区域存在于这些管腔样结构中。ACLT，前交叉韧带横断术。

结果显示，p-mTOR、ATF4和AGEs蛋白在小鼠半月板上存在明显的共定位，特别是在半月板外侧区域(如附图18中A,B和附图19所示)。因为小鼠膝关节切片需要在脱钙后进行，无法通过茜素红染色标示半月板钙化区域，所以ALP染色被用来标示潜在的成骨区域(同时用核固红进行细胞核染色)，结果显示，ACLT手术、关节腔注射AGEs均可诱导半月板区域形成毛细血管样的管腔结构，同时可观察到管腔内部有细胞群，ALP阳性区域(染色呈片状灰棕色，使用红色箭头指出)主要在这些毛细血管样结构周围发现(如附图18中A和附图19所示)。有趣的是，ATF4、p-mTOR和AGEs强阳性区域(使用黑色箭头标出)往往在这些毛细血管样结构的内部发现，它们与ALP阳性区域相邻而不是重叠。进一步通过Micro-CT重建了半月板区域钙化灶的三维模型，从冠状切片可以观察到在钙化区域内有大量的管腔样结构(如附图18中B所示)，通过与切片相比对，可以发现半月板钙化灶中的管腔样结构即为切片中所发现的毛细血管样的结构，这表明ATF4、p-mTOR和AGEs强阳性区域被钙化灶包围(如附图17中B所示)。上述结果表明，AGEs、ATF4和mTOR的相互作用促进了体内半月板钙化的形成。

综上所述，半月板原代细胞成骨过程中形成了mTOR-ATF4正反馈回路，AGEs-RAGE激活了该正反馈回路，从机制上来说，mTOR通过减少ATF4的泛素化来抑制其降解，导致ATF4蛋白水平增加，而ATF4则通过增加精氨酸摄取来激活mTOR。我们还发现AGEs-RAGE可导致小鼠半月板中血管形成增加，新生血管为半月板带来的更多的AGEs，如附图20所示。这些数据有助于进一步了解半月板钙化的形成机制，并为KOA的药物治疗带来新的启示。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。