PAI-1抑制剂在制备肝脏缺血再灌注损伤治疗药物中的应用

摘要

本发明公开了一种PAI‑1抑制剂在制备肝脏缺血再灌注损伤治疗药物中的应用，涉及生物医药技术领域。本发明选择PAI‑1基因敲除小鼠和C57BL/6野生型小鼠为实验对象，分别构建小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型，研究PAI‑1在肝脏缺血再灌注损伤中的功能。研究发现，PAI‑1敲除后可通过影响肝脏中性粒诱铺网的形成和募集，抑制肝脏的炎症反应减轻肝脏缺血再灌注损伤，PAI‑1为影响中性粒细胞活化的关键基因，是调控再灌注时期炎症反应的重要靶点。经动物实验验证PAI‑1特异性抑制剂PAI‑039能够减轻小鼠肝缺血再灌注的损伤程度，为开发新的预防、缓解和/或治疗组织缺血再灌注损伤的药物提供新的思路。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及PAI-1抑制剂在制备肝脏缺血再灌注损伤治疗药物中的应用。

背景技术

肝脏缺血/再灌注损伤(Hepatic ischemia-reperfusion injury，肝I/R)是肝移植、肝切除及肝动脉结扎或栓塞治疗中不可避免的并发症，也是引起早期移植失败、组织损伤、器官排斥甚至肝脏衰竭的重要原因。统计学分析发现有10％的早期肝移植失败都是由于肝I/R造成。肝I/R主要表现为肝窦充血、肝细胞肿胀、汇管区炎症细胞浸润，严重时可见到细胞凋亡和坏死，造成肝脏不可逆性损伤，严重阻碍了肝脏移植手术的应用和救治效果。目前肝I/R依旧是尚未攻克的临床难题，由于肝I/R的作用机制复杂多样且受不同因素的影响，对其的防治手段也是多种多样，除了传统的缺血前预处理等预防手段外，还有很多小分子抑制剂，例如脯氨酰羟化酶抑制剂和腺苷受体激动剂等，但这些治疗方法效果参差不齐，迄今为止尚未有一种行之有效的干预手段。因此，探索肝I/R的发病机制，寻找肝I/R早期的干预手段，既是研发肝I/R新型疗法的基础，也是肝I/R研究的热点之一。

临床实践都将中性粒细胞作为评价移植肝损伤程度的生物标志物之一。所以我们认为再灌注时期中性粒细胞引起的强烈的先天免疫反应被认为导致肝功能严重受损的核心因素，我们将重点关注中性粒细胞在这个阶段的行为变化。然而中性粒细胞的激活诱导肝损伤的过程十分复杂，而目前对于中性粒细胞在炎症反应中的具体机制仍不清楚。因此，深入探索中性粒细胞在肝I/R诱导的肝脏炎症反应中的调控机制，对于我们从本质上理解肝I/R再灌注时期的免疫炎症反应至关重要。

纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen activator inhibition 1，PAI-1)是由Serpine1基因编码的一种具有多个结构域的单链糖蛋白，是纤溶酶原激活物(PAs)的生理抑制剂，特别是尿激酶-凝血酶原激活剂(uPA)和组织型凝血酶原激活剂(tPA)。PAI-1主要由肝细胞，内皮细胞以及单核细胞合成分泌，并在循环血液血小板中蓄积。除了抑制纤维蛋白溶解，PAI-1还可以调节纤维蛋白溶解、凝血，细胞基质重建，细胞粘附、迁移等多种重要生理及病理过程。近年来研究发现PAI-1在心肌梗死、败血症和急性肺损伤等多种炎症性疾病发挥重要调控作用。PAI-1作为一种应激基因，既是在炎症早期高表达的重要因子，又是影响炎性细胞趋化，参与炎症因子网络形成的关键基因。目前研究认为在急性肝损伤期，炎症级联反应主要由肝脏微环境免疫细胞导致的。中性粒细胞、库普弗细胞、自然杀伤细胞以及CD4

发明内容

本发明的目的在于提供一种PAI-1在肝脏缺血再灌注损伤中的应用，确定PAI-1基因的表达与肝脏缺血再灌注损伤之间的关系，揭示PAI-1在肝脏缺血再灌注损伤中的新功能，提供PAI-1基因抑制剂在制备肝脏缺血再灌注损伤治疗药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了PAI-1抑制剂在制备肝脏缺血再灌注损伤治疗药物中的应用。

优选地，所述抑制剂选自PAI-1基因拮抗剂、PAI-1酶活抑制剂、抑制PAI-1基因表达的shRNA或抑制PAI-1基因表达的基因编辑载体。

更优选地，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

更优选地，所述基因编辑载体为CRISPR-CAS9基因编辑。

本发明还提供了PAI-1基因或PAI-1蛋白作为靶点在制备肝脏缺血再灌注损伤治疗药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

本发明选择PAI-1基因敲除小鼠(C57BL/6JGpt-Serpine1em1Cd4033/Gpt)和C57BL/6J野生型小鼠(WT)；选择构建腺相关病毒介导的PAI-1肝脏特异性敲低小鼠(pAAV8-TBG-sfEFG-3xFLAG-mir30shRNA(Serpine1)-WPRE)、以及空载对照(NC)小鼠；选择PAI-1特异性抑制剂PAI-039给药处理和溶剂对照C56BL/6J小鼠，分别构建小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型，研究PAI-1在肝脏缺血再灌注损伤中的功能。

通过肝功能测定、HE染色、免疫荧光、ELISA、q-PCR、统计分析等检测分析，结果显示：

(1)与Sham组相比，缺血再灌注损伤组肝脏组织PAI-1mRNA和蛋白水平以及血清PAI-1的分泌的显著增加；临床肝移植患者相比于正常和肝移植供体样本肝脏PAI-1的表达显著增加；

(2)与WT组相比，PAI-1-KO组的肝脏坏死面积显著减少，PAI-1基因敲除减少了肝脏中性粒细胞的浸润，抑制了肝脏炎症反应，减轻了肝脏缺血再灌注损伤程度。

(3)与NC组相比，AAV8-shPAI-1组的肝脏坏死面积显著减少。

(4)与溶剂对照组相比，PAI-039处理组肝脏坏死面积显著减少，肝脏中性粒细胞的浸润显著减少，肝脏炎症反应显著减轻。

本发明发现了PAI-1基因在肝脏缺血再灌注损伤中的新功能，PAI-1敲除或者活性抑制后可通过抑制中性粒以及NETosis诱导的炎症反应减轻肝脏缺血再灌注损伤，因此可将PAI-1应用于筛选或制备预防/治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物中，为肝脏缺血再灌注损伤提供新的药物靶点。

附图说明

图1为肝I/R小鼠RNA-seq(A)以及肝移植患者芯片数据中(B)Serpine1的表达图；

图2为ELISA和q-PCR方法检测WT小鼠缺血1h再灌注不同时间点后血清PAI-1的蛋白水平(A)和肝脏Serpine1 mRNA(B)的表达图；

图3为免疫荧光染色检测WT小鼠缺血1h再灌注12h后肝脏Serpine1的表达图；

图4为WB和qPCR检PAI-1-cKO和对照小鼠肝脏PAI-1的蛋白(A)和mRNA(B)表达图；

图5为ELISA检测PAI-1-cKO和对照小鼠IRI 12h后血清ALT(A)以及AST(B)的水平图；

图6为H&E方法检测PAI-1-cKO和对照小鼠IRI 12h后肝脏组织病理结构(A)，并通过Image pro plus软件统计各组小鼠肝脏坏死面积图(B)；

图7为qPCR测定PAI-1-cKO和对照小鼠IRI 12h后肝脏炎症因子mRNA表达图；

图8为PAI-1-039给药处理组和溶剂对照小鼠IRI 12h肝脏的解剖结构(A)和肝脏组织H&E染色的病理结果图(B)；

图9为PAI-1-039给药处理组和溶剂对照小鼠IRI 12h生存曲线图；

图10为ELISA检测PAI-1-039给药处理组和溶剂对照小鼠IRI 12h后血清ALT以及AST的水平图；

图11为qPCR测定PAI-1-039给药处理组和溶剂对照小鼠IRI 12h后肝脏炎症因子mRNA表达图；

图12为流式检测PAI-1-shPAI-1和对照小鼠IRI 12h后肝脏部位免疫细胞所建立分群策略图；

图13为髓系细胞以及淋巴系T细胞在肝脏占CD45

图14为髓系细胞包括巨噬细胞，中性粒细胞以及炎性单核细胞占CD11b

图15为T淋巴细胞包括CD4

图16为免疫荧光染色检测PAI-1-shPAI-1和对照小鼠IRI 12h后肝脏Ly6G的表达图；

图17为免疫荧光染色检测PAI-1-039给药组和溶剂对照小鼠IRI 12h后肝脏Ly6G的表达图；

图18为多重免疫荧光染色检测PAI-1-shPAI-1和对照小鼠IRI 12h后肝脏Ly6G

具体实施方式

本发明提供了PAI-1基因抑制剂在制备肝脏缺血再灌注损伤治疗药物中的应用。

在本发明中，所述抑制剂选自PAI-1基因拮抗剂、PAI-1酶活抑制剂、抑制PAI-1基因表达的shRNA或抑制PAI-1基因表达的基因编辑载体。在本发明中，所述PAI-1酶活抑制剂可选自Tiplaxtinin，PAI-039。

在本发明中，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。优选地，本发明使用Sigma和Invitrogen Block-iT设计shRNA序列，将Serpine基因序列克隆到腺相关病毒载体pAAV-TBG-sfEGFP-3×FLAG-WPRE中，得到pAAV-TBG-sfEGFP-3×FLAG-mir30shRNA(Serpine1)-WPRE。利用脂质体将上述质粒转染至AAV-293细胞中，转染72h后收集上清及细胞内病毒，按照标准流程纯化，浓缩病毒，用于构建体内肝脏特异性敲除Serpine1小鼠。

在本发明中，所述基因编辑载体为CRISPR-CAS9基因编辑。目前已经可以使用CRISPR-Cas9在成年动物上进行在体编辑DNA，然而由于缺乏合适的载体运输CRISPR-Cas9进入动物体内，限制了该技术的应用。在本发明中，作为一种可以实施的方式，将Cas9和gRNA整合到腺病毒载体中，包装CRISPR-Cas9腺病毒，用于成年动物体内编辑，构建PAI-1敲除小鼠。

在本发明的具体实施例中，所述PAI-1基因敲除或抑制剂抑制PAI-1基因表达能够减少肝I/R小鼠肝脏的斑块状坏死面积，减轻水肿和出血程度。

在本发明的具体实施例中，所述PAI-1基因敲除或抑制剂抑制PAI-1基因表达能够降低肝I/R小鼠血清ALT和AST的表达，减轻肝功能损伤程度。

在本发明的具体实施例中，所述PAI-1基因敲除或抑制剂抑制PAI-1基因表达能够抑制肝脏炎症反应，抑制促炎因子的释放；所述促炎因子包括IL-6、TNF-α、IL-β、IFN-γ、Mcp1、IL-1β、CXCL2。

在本发明的具体实施例中，所述PAI-1基因敲除或抑制剂抑制PAI-1基因表达能够减少肝脏部位CD45

在本发明的具体实施例中，所述PAI-1基因敲除或抑制剂抑制PAI-1基因表达能够减少肝脏受损部位中性粒细胞的浸润。

本发明提供了一种PAI-1基因或PAI-1蛋白作为靶点在制备肝脏缺血再灌注损伤治疗药物中的应用。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

从南京集萃药康生物科技有限公司购买Serpine1基因敲除小鼠(C57BL/6JGpt-Serpine1

小鼠肝脏I/R损伤模型

手术：采用经典方法构建小鼠肝I/R损伤模型，手术前小鼠禁食12小时，可自由饮水。术前小鼠用3％戊巴比妥钠麻醉后，四肢固定在小鼠手术操作板上，手术操作区用75％乙醇消毒。腹侧中线切口进入腹部(逐层暴露)，暴露肝脏左、中叶的肝蒂。开腹后用血管夹钳夹肝左叶和肝中叶的肝动脉、门静脉和胆管的三叉结构，造成约70％的肝脏缺血。与未闭锁的右叶相比，如果阻塞叶变白，说明血流阻塞成功，操作正确。然后，开始缺血并维持1h。Sham组小鼠无肝血流阻塞。缺血后去除血管夹，恢复肝血流。操作完成后用聚丙烯缝合线连续缝合内、外侧皮肤。假手术的小鼠除了夹住血管外，还接受同样的手术过程。腹腔缝合后，将术后小鼠置于37摄氏度保温的干净的笼子中安置观察。

取样：小鼠在术后指定时间从Sham手术组(Sham组)和I/R组中取出，用3％戊巴比妥钠麻醉。然后从眼眶静脉丛取1ml的血，分离血清。同时收集肝中叶并冷冻于液氮中，肝左叶固定于4％多聚甲醛中48h，脱水，包埋，制备成石蜡切片。

质粒构建

将Serpine基因序列克隆到腺相关病毒载体pAAV-TBG-sfEGFP-3×FLAG-WPRE中，得到pAAV-TBG-sfEGFP-3×FLAG-mir30shRNA(Serpine1)-WPRE。引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。利用脂质体将上述质粒转染至AAV-293细胞中，转染72h后收集上清及细胞内病毒，按照标准流程纯化，浓缩病毒。用TCID50法测定病毒滴度，病毒的滴度不得低于1.0*10

腺相关病毒介导的Serpine1肝脏特异性敲低小鼠的构建方法

pAAV8-sh(Serpine1)病毒粒子(1*10

CRISPR/Cas9技术制备基因敲除小鼠

CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。在CRISPR-Cas9系统中，通过融合crRNA与tracrRNA序列形成sgRNA，识别基因组的靶序列末端的三核苷酸区域PAM(5’-NGG-3’)位点，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂。CRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。Serpine1基因有3个转录本(如下表)。根据Serpine1基因的结构，Serpine1-2010的外显子3-外显子5(ENSMUST0000041388.10)转录本被推荐作为敲除区，该区包含628bp的编码序列。敲除该区域将导致蛋白质功能的破坏。本发明使用CRISPR/Cas9技术来修饰Serpine1基因。通过CRISPR-Cas9介导的同源重组(HR)反应，可以将目的基因、筛选标记或其他遗传因子整合到小鼠第6号染色体上的ROSA26 safe harbor位点，确保转入基因长期、稳定的表达。

表1Serpine1基因的三个转录本

肝功能以及血清生化指标分析

用南京建成试剂盒检测血清中的血清丙氨酸转氨酶(ALT)和血清天冬氨酸转氨酶(AST)。采用R&D公司。用ELISA试剂盒测定小鼠血清中PAI-1的表达水平和酶活，具体操作按试剂盒说明操作。

HE染色

肝脏切片(4μm)用H&E染色，用image pro plus软件分析坏死区域。每只小鼠在5个以上的区域中盲目量化组织切片总面积中坏死面积的百分比。一位不知道实验方案的病理学家提供了形态学评估。

免疫荧光

新鲜动物组织以4％多聚甲醛固定包埋后做连续石蜡切片。应用PAI-1、Ly6G、H3Cit抗体，通过免疫荧光染色检测中性粒细胞向肝脏切片的浸润并进一步检测中性粒诱铺网(NETs)的表达情况。切片在敷抗体前用含有10％山羊血清的PBST封闭，加入待测的一抗4℃过夜孵育，再以二抗室温避光孵育1h。用DAPI标记细胞核。免疫荧光图像的捕获和分析使用Image Pro Plus(版本6.0)。

蛋白免疫印迹

将相同质量的蛋白质样品加入负载缓冲液中，用10％SDS-PAGE电泳分离。电泳后，将蛋白转移到PVDF膜上。在室温下用5％脱脂奶粉封闭膜约1h后，加入一抗体在4℃孵育过夜。加入相应物种的二级抗体，在室温下孵育1h，用增强化学发光系统制备印迹，并将结果记录在感光成像胶片上。用凝胶成像系统(Chemidoc-XRS+)采集信号。用ImageJ软件定量检测蛋白表达水平。

qRT-PCR

新鲜组织，用Trizol裂解组织或细胞，然后提取RNA，设计引物，取2ug mRNA，用Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒合cDNA，以cDNA为模板，进行qRT-PCR(Real-Time-polymerase chain reaction，qRT-PCR)，以β-actin为内参照物检测基因表达水平，对每个基因进行分析。反应条件设置如下：在95℃下孵育10min，然后40个周期95℃下孵育10s，60个℃下孵育1min。得到的数据用公式2

流式细胞术

用流式细胞术检测肝脏免疫细胞的浸润情况，每只小鼠肝脏称取0.5g肿瘤组织，其余分装。取肿瘤消化液(胶原酶0.1mg/mL，DNaseⅠ0.25mg/mL，Hanks配，现用现配，酶易降解)，每只4mL，将肿瘤剪碎，37℃，100rpm，30min。然后1200rpm离心5min，去上清，用PBS溶液洗一遍。样品用5％BSA冰上封闭20min。然后2000rpm离心5min，弃掉BSA，PBS洗3遍，离心去上清，获得细胞。用PBS或者5％BSA来配制抗体，抗体为(CD45、CD11b、CD3、CD4、CD8、Ly6G、Ly6C)各抗体配制比例为1：1000，4℃，避光孵育30min。然后2000rpm，离心5min，弃上清，用PBS清洗一遍。注意染色时要分装单阳及减一对照管。弃去上清，加200μLPBS重悬，过滤，然后上机。

统计分析

所有数据均以平均值±标准误表示。本发明使用SPSS19.0软件进行所有的统计分析。使用单向方差分析比较2组以上的统计差异，然后进行Bonferroni分析(用于满足方差齐性的数据)或Tamhane的T2分析(用于显示异方差的数据)。将两组之间的统计差异与双尾学生的T检验进行比较。有统计学意义P<0.05。

结果分析

肝I/R过程中PAI-1表达上调，下调PAI-1表达加重小鼠I/R模型肝损伤。为了分析PAI-1是否参与I/R诱导的肝功能不全，本发明首先测定了PAI-1在I/R小鼠肝脏中的表达。在小鼠肝I/R模型中，RNA-seq结果显示PAI-1的mRNA表达在再灌注后12h后上调(图1A)。同时在临床肝移植样本中，基因芯片数据显示移植肝24h后PAI-1mRNA表达上调(图1B)。与此一致的是，缺血1h再灌注(2、6、12h)后小鼠血清和肝脏PAI-1的蛋白和基因水平呈时间依赖性升高(图2A-B)。在I/R后12h，免疫荧光染色结果显示PAI-1主要在肝窦细胞中显著高表达(图3)。PAI-1表达的大幅变化强烈地暗示了PAI-1是肝I/R后肝脏损伤的病理过程中是一个关键的调节因子。

为了探讨PAI-1在肝I/R损伤中的作用，本发明构建了Serpine1基因敲除小鼠。通过Westernblot和q-PCR分析证实PAI-1基因敲除表达(图4A-B)。用Serpine1基因敲除鼠(C57BL/6JGpt-Serpine1em1Cd4033/Gpt)和野生型(WT)小鼠建立肝I/R损伤模型。与WT缺血再灌注小鼠相比，PAI-1敲除小鼠血清AST和ALT水平明显降低(图5A-B)，小鼠肝脏的斑块状坏死面积、水肿和出血等病理结果大幅度恢复。并维持了相对正常的肝脏结构(图6A-B)。因此，可以被认为PAI-1基因敲是在I/R损伤的进展中发挥了关键作用。此外，本发明还检测了基因敲除小鼠肝脏炎症因子的表达情况，结果显示，PAI-1敲除后，能够明显抑制肝I/R小鼠肝脏促炎因子(IL-6、TNF-α、IL-β等)的释放，抑制抑炎因子IL-10的释放(图7)，这些结果提示PAI-1的基因敲除改善了肝I/R损伤。

为了进一步证实PAI-1在肝I/R损伤中的重要作用，本发明将WT缺血再灌注小鼠给与PAI-1特异性抑制剂(PAI-039)和相应的溶剂对照观察其疗效。根据HE染色结果，在12h后，PAI-039组的肝脏损伤程度和坏死面积显著减少(图8A-B)，100％缺血总体生存期显著改善(图9)，且ALT和AST水平显著降低(图10)。本发明检测了PAI-039和溶剂对照小鼠在缺血再灌注后肝脏的炎症反应。在PAI-039小鼠肝I/R损伤模型中，肝组织中炎性因子如TNF-α、IL-6、IL-1β、CCL2和IFN-γ的mRNA表达水平在损伤后12h显著降低(图11)。上述结果表明，肝脏PAI-1的表达在调节肝脏功能障碍方面起着重要作用。在I/R过程中，PAI-1缺失对肝I/R的保护作用可能与其抑制肝脏炎性反应相关。

众所周知，在肝脏急性损伤期，炎症级联反应主要有肝脏微环境免疫细胞导致的。库否细胞、中性粒细胞、CD4

接下来本发明进一步探索了PAI-1对肝I/R肝脏募集的中性粒细胞功能的影响，根据目前文献报道，NETs是中性粒细胞在众多疾病中诱导免疫炎症反应的新型活化形式，目前以及广泛的被关注。因此，我们通过多重免疫荧光染色进一步分析了腺相关病毒AAV8肝脏特异性敲除Serpine1小鼠[AAV8-TBG-shPAI-1]和对照小鼠肝I/R后肝脏Ly6G(中性粒细胞标志物)和H3Cit(中性粒细胞诱铺网标志物)的蛋白表达。结果显示，与对照组相比，PAI-1敲低组小鼠肝脏Ly6G的蛋白表达显著降低(图16)，且在PAI-039给药处理组中得到相同结论(图17)，提示PAI-1能够明显抑制肝脏部位中性粒细胞的数量。那么，PAI-1是否能够调控NETs的募集产生促肝I/R损伤作用，本研究在AAV8-TBG-shPAI-1和对照小鼠肝I/R小鼠模型中将Ly6G和H3Ci进行共染。结果显示，PAI-1敲低后能够明显抑制Ly6G和H3Ci的共同表达(图18)，该研究结果提示，PAI-1敲除能够改善肝I/R进展且可能与NETs的形成和募集有关。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。