具有经修饰的肌肉生长抑制素基因的转基因动物

摘要

本申请涉及具有肌肉生长抑制素基因的动物或细胞，所述肌肉生长抑制素基因中第二外显子的12个碱基对缺失。本申请还可以包括能够操纵肌肉生长抑制素基因的12个碱基对的缺失以构建动物或细胞的组合物。本申请还涉及该组合物用于增加肌肉的用途。

说明书

技术领域

本申请涉及具有经人工修饰的基因的转基因动物或细胞。所述转基因动物或细胞具有第二外显子中12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素(myostatin)基因。

本申请涉及与转基因动物或细胞的生产有关的技术。

背景技术

“比利时蓝(Belgian Blue)”作为具有发达的肌肉的牛的优良品种而闻名。该品种是在19世纪由比利时育种者通过杂交偶然创造的。尽管与野生型相比，它们不消耗许多饲料，但由于遗传原因，它们的特征是肌肉细胞高度增殖，使其脂肪低且蛋白质高。据报道，这些特征是由肌肉生长抑制素基因的修饰引起的(McPherron AC，Lawler AM，Lee SJ(1997)Nature 387:83-90)。

肌肉生长抑制素从名字上蕴含着“肌肉(myo)+抑制素(statin)”的意思，并且随着研究的继续，已经知道肌肉生长抑制素蛋白会抑制肌肉分化和生长。在各种动物模型中，已经对肌肉生长抑制素进行研究以使用基因编辑工具通过基因调控来控制肌肉细胞的分化和生长。

此外，在肌肉生长抑制素转基因大动物的情况下，可以获得高质量的肉，从而提高利用。然而，肌肉生长抑制素基因的删除仍然具有技术局限，有数种副作用，例如心脏增大、血压升高和短的寿命。

作为上述技术局限的，肌肉生长抑制素转基因动物还不能用于工业用途。

因此，本申请人试图获得健康且具有增加的肌肉质量的肌肉生长抑制素转基因动物。因此，通过确认本申请的转基因牛科动物具有其中肌肉生长抑制素被修饰的特定变体，并且是没有常规副作用的转基因动物，完成了本公开。

相关技术文献

(专利文献1)CN 104531705A

(专利文献2)CN 107034221A

非专利文献

(非专利文献1)Am J Physiol Endocrinol Metab.2017年3月1日；312(3):E150-E160，Myostatin propeptide mutation of the hyper muscular compact micedecreases the formation of myostatin and improves insulin sensitivity.

发明内容

技术问题

本申请的一个目的是提供具有经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的动物，所述肌肉生长抑制素基因中第二外显子的12个碱基对缺失。

本申请的另一个目的是提供具有经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的胚胎，所述肌肉生长抑制素基因中第二外显子的12个碱基对缺失的。

本申请的又一个目的是提供用于使肌肉生长抑制素基因第二外显子的12个碱基对缺失的组合物。

本申请的又一个目的是提供使用该组合物诱导动物肌肉中肌肉生长的用途。

技术方案

为了解决上述问题，本申请文件提供了转基因动物，所述转基因动物具有特定部分经人工修饰的肌肉生长抑制素基因。

该修饰可能发生在肌肉生长抑制素基因的第二外显子中。

与野生型动物中的肌肉生长抑制素基因序列相比，上述修饰是第二外显子中12个碱基对的缺失，对应于编码亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸和酪氨酸的氨基酸序列的区域。

编码顺序为亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸和酪氨酸的氨基酸序列的核酸可以具有编码各个氨基酸的一个或多个序列。

也就是说，编码亮氨酸的序列可以是选自5'-CTT-3'、5'-CTC-3'、5'-CTA-3'或5'-CTG-3'中的一个，并且编码色氨酸的序列可以是选自5'-TGG-3'中的一个，编码异亮氨酸的序列可以是选自5'-ATT-3'、5'-ATC-3'或5'-ATA-3'中的一个，并且编码酪氨酸的序列可以是选自5'-TAT-3'或5'-TAC-3'中的一个。

转基因动物中肌肉生长抑制素mRNA的表达量低于在野生型动物中的表达量。

此外，转基因动物可以表达具有与野生型动物相同氨基酸序列的成熟的肌肉生长抑制素蛋白。

与野生型动物相比，转基因动物可能有外表的肌肉量的增加。

转基因动物包括哺乳动物。

哺乳动物包括有蹄类动物。

有蹄类动物包括偶蹄类动物。偶蹄类动物可以包括猪、鹿、牛、绵羊和山羊，但不限于此。

哺乳动物可以包括啮齿动物。啮齿动物可以包括小鼠和大鼠，但不限于此。

优选地，本申请中的转基因动物是牛科动物。所述牛科动物表达包含由SEQ IDNO：30表示的氨基酸序列的原肌肉生长抑制素(pro-myostatin)蛋白。

此外，本申请提供了具有经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的经工程化的细胞，所述肌肉生长抑制素基因具有经修饰的特定部分。

经工程化的细胞的转化可以发生在肌肉生长抑制素基因的第二外显子中。

与野生型细胞中的肌肉生长抑制素基因序列相比，上述修饰是第二外显子中12个碱基对的缺失，对应于编码亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸和酪氨酸的氨基酸序列的区域。

编码顺序为亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸和酪氨酸的氨基酸序列的核酸可以具有编码各个氨基酸的一种或多种序列。

也就是说，编码亮氨酸的序列可以是5'-CTT-3'、5'-CTC-3'、5'-CTA-3'或5'-CTG-3'中的一个，并且编码色氨酸的序列可以是5'-TGG-3'中的一个，编码异亮氨酸的序列可以是5'-ATT-3'、5'-ATC-3'或5'-ATA-3'中的一个，并且编码酪氨酸的序列可以是5'-TAT-3'或5'-TAC-3'中的一个。

与野生型细胞相比，经工程化的细胞表达更少的肌肉生长抑制素mRNA。

此外，经工程化的细胞可以表达具有与野生型动物相同的氨基酸序列的成熟肌肉生长抑制素蛋白。

细胞可以是胚胎细胞、体细胞或干细胞。

细胞包括但不限于，例如，卵母细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、巨噬细胞、单核细胞、肌肉细胞和B淋巴细胞、T淋巴细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胎儿来源细胞、胎盘细胞和胚胎细胞。此外，可以使用来源于各种组织来源的成体干细胞，例如来自脂肪、子宫、骨髓、肌肉、胎盘、脐带血或皮肤(上皮)的组织来源的干细胞。非人宿主胚胎通常可以是含有2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期、32细胞期、64细胞期、流产胚胎或囊胚的胚胎。

所述细胞可获得自哺乳动物。

优选地，本申请的细胞可获得自牛科动物。

经工程化的细胞可以表达具有由SEQ ID NO：30表示的氨基酸序列的原肌肉生长抑制素蛋白。

本申请提供了用于修饰肌肉生长抑制素基因的组合物。

为了修饰肌肉生长抑制素基因，所述组合物可以包含

向导RNA或编码所述向导RNA的DNA，所述向导RNA包含与靶序列形成互补键的向导序列；

以及Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸序列。

所述靶序列可以包括选自SEQ ID NO：38至SEQ ID NO：60的一种或多种。

所述向导序列可以包括选自SEQ ID NO：624至SEQ ID NO：84的一种或多种。

Cas蛋白可以是选自于由酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)来源的Cas9蛋白、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)来源的Cas9蛋白或Cas 12a蛋白(曾称为CPF1：普雷沃菌和弗朗西丝菌1)组成的组中的一种。编码Cas蛋白的核酸可以是选自于由以下所组成的组中的任一种：编码酿脓链球菌来源的Cas9蛋白、金黄色葡萄球菌来源的Cas9蛋白或编码Cas 12a蛋白(曾称CPF1：普雷沃菌和弗朗西丝菌1)的核酸。

所述组合物可以以编码向导RNA和Cas蛋白的DNA的形式存在于质粒载体中。

所述组合物可以以编码向导RNA和Cas蛋白的DNA的形式存在于病毒载体中。

此时，病毒载体可以是选自于由以下所组成的组中的一种或多种：逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、痘苗病毒载体、痘病毒载体和单纯疱疹病毒载体。

基因操纵组合物可以处于复合体(RNP：核糖核蛋白)的形式，所述复合体包含向导RNA和Cas蛋白。

此外，本申请提供了制备具有用上述组合物修饰的经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的细胞或胚胎的方法。

本申请的生产肌肉生长抑制素工程化细胞或胚胎的方法，

可以包括使细胞或胚胎与组合物接触。接触步骤可以在体内或体外进行。

接触步骤可以通过选自以下的一种或多种方法进行：自显微注射、电穿孔、脂质体、质粒、病毒载体、纳米颗粒和蛋白转导结构域(PTD，protein translocation domain)融合蛋白方法。

此外，本申请提供了制备具有人工修饰的肌肉生长抑制素基因的动物的方法。

本公开的生产肌肉生长抑制素转基因动物的方法可以包括以下步骤：通过使胚胎与如上所述的组合物接触来生产具有经人工修饰基因的转基因胚胎，以及将转基因胚胎转移到代孕母亲。

通过上述生产方法生产的动物比野生型动物表达更少的肌肉生长抑制素mRNA。

动物可以是人以外的哺乳动物。

有益效果

由于肌肉生长抑制素mRNA的低表达水平，与野生型动物相比，本申请的肌肉生长抑制素转基因动物可以增加肌肉量。

因此，可以提供具有低脂肪含量和高蛋白含量的优质肉。

常规的肌肉生长抑制素突变的转基因动物具有各种副作用(例如寿命短)，但本申请可以提供没有此类各种副作用的健康的肌肉生长抑制素突变的转基因动物。

此外，本申请提供的组合物是能够修饰肌肉生长抑制素基因的组合物，并且当注射到动物组织中时可能能够增加肌肉质量。

附图说明

图1示出了肌肉生长抑制素基因中修饰的位置的图，并列出了在本公开的一个实例中使用的原间隔序列。

图2是生产具有经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的转基因胚胎的方法的示意图，所述肌肉生长抑制素基因中第二外显子的12个碱基对缺失。

图3示出了通过T7E1测定证实经工程化的胚胎中的肌肉生长抑制素的修饰，所述经工程化的胚胎具有其中第二外显子中12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因。

图4示出了肌肉生长抑制素基因的原间隔序列，以及用含有与其互补的靶序列结合的序列的向导RNA对肌肉生长抑制素工程化的胚胎进行的Sanger测序，揭示了多种变体。

图5示出了用于驱动肌肉生长抑制素基因的第二外显子的12个碱基对的删除的不同量的Cas9的mRNA或向导RNA，以确定最合适的向导RNA和CAS9 mRNA的量来进行本申请。

图6示出了具有第二外显子中12个碱基对的肌肉生长抑制素基因的缺失的牛，该牛在出生后的一到四个月每月拍摄一次用于外观检查。

图7示出了通过T7E1测定证实牛中肌肉生长抑制素的修饰，所述牛具有其中第二外显子中缺失了12个碱基对的肌肉生长抑制素基因。

图8示出了通过T7E1测定鉴别的关于潜在脱靶位点的五个序列，以证实可以由CRISPR/Cas9产生的脱靶效应。通过混入野生型DNA或不混入野生型DNA，证实了对于所有五个脱靶位置既没有发生杂合敲除(hetero-knockout)也没有发生纯合敲除(homo-knockout)。

图9示出了将通过图2的方法产生的胚胎植入代孕母亲的子宫后出生的17头牛的深度测序结果，证实了肌肉生长抑制素基因中的12个碱基对的缺失。

图10列出了野生型牛的深度测序结果，该野生型牛作为具有在第二外显子中有12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因的牛的阴性对照。

图11列出了6号牛的深度测序结果，该牛具有在第二外显子中有12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因。

图12列出了14号牛的深度测序结果，该牛具有在第二外显子中有12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因。

图13列出了17号牛的深度测序结果，该牛具有在第二外显子中有12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因。

图14示出了14号和17号牛中的肌肉生长抑制素mRNA表达量，所述牛具有在第二外显子中有12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因。

图15示出了MSTN突变雌性的生殖系传递的验证、来源于MSTN突变牛卵母细胞的MSTN突变囊胚的产生以及在第30天通过超声机进行的妊娠诊断的代表性照片。

图16是源自在OPU期间获得的卵泡液的体细胞图像。

图17示出了来自MSTN突变雌性的囊胚的T7E1测定结果和测序数据。

图18示出了来自卵泡液中的体细胞的T7E1测定结果和测序数据。

图19示出了通过计算机辅助精液分析对来自MSTN雄性首建者(founder)的精液的总结。

图20示出了作为来自MSTN突变雄牛的生殖系传递的验证结果的代表性囊胚的照片。

图21示出了来源于体外受精的MSTN突变公牛精液的囊胚中MSTN基因的突变率。

具体实施方式

发明的实施方式

为了描述本文公开的内容，本文将定义数个术语。除这些术语外，在必要时，本申请文件中其它地方定义了其它术语。除非本文另有明确定义，否则本文中使用的行业术语应具有它们领域公认的含义。在有冲突的情况下，将以本文中的定义为准。

肌肉生长抑制素基因的保守区

肌肉生长抑制素基因的保守区是指在进化过程中跨越物种，编码肌肉生长抑制素氨基酸序列中未经修饰的共同保留区的核酸序列。

在本申请中，术语“按照物种的肌肉生长抑制素基因的保守区”包含在肌肉生长抑制素的保守区中以亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸和酪氨酸的顺序编码氨基酸的核酸序列(见表3)。

按照物种的肌肉生长抑制素的保守区可能具有相同的氨基酸序列，但根据物种，可存在对于氨基酸序列的数种碱基密码子。也就是说，编码亮氨酸的核酸序列可以是5'-CTT-3'、5'-CTC-3'、5'-CTA-3'或5'-CTG-3'中的一个，并且编码色氨酸的核酸序列可以是5'-TGG-3'中的一个，编码异亮氨酸的核酸序列可以是5'-ATT-3'、5'-ATC-3'或5'-ATA-3'中的一个，并且编码酪氨酸的核酸序列可以是5'-TAT-3'或5'-TAC-3'中的一个。

因此，本申请的“按照物种的肌肉生长抑制素基因的保守区”的核酸序列对于各个物种可能不同。在本申请文件中，“肌肉生长抑制素基因的保守区”有时缩写为“保守区”。

转基因动物

本申请中的术语“转基因动物”意指具有经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的动物。

在本申请中，“转基因动物”具有其中第二外显子的12个碱基对缺失的经人工修饰的肌肉生长抑制素基因，并表达与野生型动物具有相同序列的成熟的肌肉生长抑制素蛋白。

本申请的转基因动物中的经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的性状由后代遗传。

作为第一代动物的F0具有经人工修饰的肌肉生长抑制素基因。F0可以产生子代F1。在F1和F1后继子代(sub-F1 progeny)中包含的肌肉生长抑制素基因具有与经人工修饰的肌肉生长抑制素基因相同的核苷酸序列。本申请中的术语“转基因动物”包括F0、F1和F1后继子代。换言之，当动物F1具有经修饰的肌肉生长抑制素基因时，即使在动物F1的生产过程中或在生产出动物F1之后不应用用于转化的直接人工操纵，其也是本申请的转基因动物。

动物

本申请的动物包括非人动物。

动物包括哺乳动物。

哺乳动物包括有蹄类动物。

有蹄类动物包括偶蹄类动物。偶蹄类动物可以包括猪、鹿、牛、绵羊和山羊，但不限于此。

哺乳动物可以包括啮齿动物。啮齿动物可以包括小鼠和大鼠，但不限于此。

靶区域

本申请中的术语“靶区域”意指其中基因将被人工操纵以产生转基因动物的野生型基因组中的区域，并且包含如下所示的包含原间隔序列和靶序列的区域。

原间隔(Protospacer)序列

本申请中的术语“原间隔序列”是指在本申请的靶区域中PAM序列的位置边，与PAM序列相邻的20个序列。原间隔序列和靶序列是互补序列。也就是说，这意味着与靶序列互补结合的向导序列相同的序列。然而，向导序列可具有在原间隔序列中T(胸腺嘧啶)被U(尿嘧啶)取代的序列。

靶序列

本申请的术语“靶序列”是包含在本申请的靶区域中的序列，并且是与原间隔序列互补结合的序列。靶序列可以与向导序列互补地结合。

A、T、C、G和U的含义

如本文所用，符号A、T、C、G和U被解释为本领域普通技术人员所理解的含义。根据上下文和技术，这些符号中的每一个可以被适当地解释为DNA或RNA上的碱基、核苷或核苷酸。例如，当各个符号意指碱基时，符号A、T、C、G和U可以分别解释为腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或尿嘧啶(U)。当各个符号意指核苷时，符号A、T、C、G和U可分别解释为腺苷(A)、胸苷(T)、胞苷(C)、鸟苷(G)或尿苷(U)。当表示序列中的核苷酸时，符号A、T、C、G和U分别表示包含核苷的核苷酸。

下文详细描述本申请。

本申请涉及具有经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的转基因动物，所述肌肉生长抑制素基因中第二外显子的12个碱基对缺失。

本申请的转基因动物的特征在于其含有经人工修饰的肌肉生长抑制素基因。

肌肉生长抑制素的结构和功能将在下文中详细描述。

迄今为止已知的高等生物中的肌肉生长抑制素基因的特征是具有三个外显子和两个内含子。已知肌肉生长抑制素基因主要存在于肌肉中。

肌肉生长抑制素mRNA产生肌肉生长抑制素蛋白，该蛋白由约375个氨基酸组成，并分为三部分：信号肽区、前肽(前体结构域(prodomain))区(28kDa，N端)和成熟区(12kDa、C端)。

原肌肉生长抑制素(前体蛋白)的结构是两个相同的亚基，并且成熟区相互形成二硫键，从而保持同源二聚体蛋白的形式。

关于肌肉生长抑制素蛋白的信号传导通路，在前体蛋白原肌肉生长抑制素被弗林蛋白酶(furin)首次切割后，它被分为前肽区和成熟区。切割后，在潜伏复合体(latentcomplex)中，前肽区通过非共价键结合至成熟区。然后，当它在通过BMP/Tolloid进行第二次切割后从细胞中分泌出时，肌肉生长抑制素成熟区通过结合激活素II型受体而被磷酸化。信号再次传递到激活素I型受体，并且信号传递到受体调节蛋白Smad 2和Smad 3，并且Smad 2和Smad 3与co-Smad 4组合以调节靶基因的转录。作为这个信号传导通路的结果，成熟的肌肉生长抑制素蛋白表达。

在与肌肉生长抑制素基因相关的常规研究中，已经进行了其中成熟的肌肉生长抑制素蛋白不表达的研究。通过阻抑成熟的肌肉生长抑制素蛋白的表达，进行了研究以制备在其中产生大量肌肉并脂肪减少的动物。此外，通过在其中不表达成熟肌肉生长抑制素蛋白的研究，正在进行对肌肉生长抑制素的信号传导通路的研究，以期将其用于肌肉质量迅速减少的疾病(如晚期癌症患者)以及肌肉纤维再生。

在肌肉生长抑制素转基因动物的许多情况下，肌肉生长抑制素基因被修饰，从而使抑制肌肉生长的肌肉生长抑制素蛋白在体细胞中表达的不多。换言之，它是通过修饰上文所述的成熟的肌肉生长抑制素蛋白信号传导通路中的切割区来阻抑成熟的肌肉生长抑制素蛋白表达的形式。与野生型动物相比，关于增加的肌肉质量，通过体细胞核转移克隆的动物具有双倍的肌肉质量。

然而，通过上述常规方法获得的具有肌肉生长抑制素基因修饰的转基因动物的寿命短。因此，存在出现繁殖问题和健康方面的致命的副作用的缺点，尤其是在大型动物中。

本申请涉及转基因动物，该转基因动物使由常规肌肉生长抑制素基因修饰引起的副作用最小化，并突出了肌肉生长抑制素基因修饰的优点。

具体而言，通过靶向外显子2的特定区域以删除12个碱基对(该处不是成熟肌肉生长抑制素蛋白的信号传导通路的切割区)，本发明提供了与野生型相比具有受阻抑的成熟肌肉生长抑制素蛋白表达而非无表达的动物。

本申请的一个方面是具有经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的肌肉生长抑制素转基因动物。在一个实施方式中，其可以是有蹄类动物，例如牛科动物。

在下文中，以具有本申请的人工修饰的肌肉生长抑制素基因的牛科动物(牛)为例，将详细描述本公开。

本申请的转基因动物可以具有在肌肉生长抑制素基因组成方面与野生型动物不同的肌肉生长抑制素基因组成。

本申请的遗传修饰是指缺失编码肌肉生长抑制素蛋白的氨基酸序列中特定保守区的四个氨基酸的序列(顺序为亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸和酪氨酸的氨基酸)的核酸序列。

本申请的转基因动物具有其中第二外显子的12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因，该12个碱基对是编码保守区的氨基酸序列的核酸序列。

当转基因动物是牛科动物、猪或人时，12个碱基对的缺失可以是编码野生型肌肉生长抑制素基因第二外显子的序列的第93至104位碱基对的缺失(以5'至3'排序)。

当转基因动物是小鼠时，12个碱基对的缺失可以是编码野生型肌肉生长抑制素基因第二外显子的序列的第94至105位碱基对的缺失。

本申请的转基因动物可以具有与野生型动物不同的肌肉生长抑制素mRNA形态。本申请的转基因动物具有12个碱基缺失的肌肉生长抑制素mRNA。

在本申请的一个实施方式中，可以测量转基因动物中肌肉生长抑制素mRNA的表达量。

在一个具体实施方式中，本申请的转基因动物中肌肉生长抑制素mRNA的表达量比野生型动物的肌肉生长抑制素mRNA的表达量低至少60％。优选地，本申请的转基因动物中肌肉生长抑制素mRNA的表达量低于野生型动物的表达量，但这并不意味着该表达不存在。

本申请的转基因动物的缺失的12个碱基对是编码在肌肉生长抑制素基因进化过程中每个物种的氨基酸序列没有改变的保守氨基酸序列的核酸。保守氨基酸序列是顺序为亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸和酪氨酸的氨基酸序列。

因此，本申请的转基因动物表达肌肉生长抑制素蛋白，其中与野生型原肌肉生长抑制素蛋白相比，顺序为亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸和酪氨酸的四个氨基酸缺失。

其中所述四个氨基酸缺失的原肌肉生长抑制素蛋白可以是SEQ ID NO：30至SEQID NO：33中的一个。

转基因动物的原肌肉生长抑制素蛋白可在一些序列中具有修饰，但可以与SEQ IDNO：30至SEQ ID NO：33中的一个具有90％以上的同源性。

例如，当转基因动物是牛科动物(牛)时，可以表达其中4个氨基酸缺失的SEQ IDNO：30的原肌肉生长抑制素蛋白。

例如，当转基因动物是猪时，可以表达其中4个氨基酸缺失的SEQ ID NO：31的原肌肉生长抑制素蛋白。

例如，当转基因动物是小鼠时，可以表达其中4个氨基酸缺失的SEQ ID NO：32的原肌肉生长抑制素蛋白。

例如，当转基因动物是人时，可以表达其中4个氨基酸缺失的SEQ ID NO：33的原肌肉生长抑制素蛋白。

[表1]

待删除的四个氨基酸与在形成成熟的肌肉生长抑制素蛋白的过程中被切割的原肌肉生长抑制素蛋白的区域不重叠。

由于在发生切割的区域中不包含氨基酸缺失的位点，因此原肌肉生长抑制素蛋白通过正常的信号传导过程成为成熟的肌肉生长抑制素蛋白。也就是说，本申请中特定氨基酸的缺失不影响正常的成熟肌肉生长抑制素蛋白的形成过程。

因此，由本申请的肌肉生长抑制素转基因动物表达的成熟的肌肉生长抑制素蛋白与野生型的成熟肌肉生长抑制素蛋白相同。也就是说，其特征在于与野生型成熟肌肉生长抑制素蛋白的氨基酸序列相同。

在一个实施方式中，转基因动物的成熟的肌肉生长抑制素蛋白可以是SEQ ID NO：34至SEQ ID NO：37中的一个。

转基因动物的成熟的肌肉生长抑制素蛋白可以在一些序列中具有修饰，但可与SEQ ID NO：34至SEQ ID NO：37中的一个具有90％以上的同源性。

例如，当转基因动物是牛科动物(牛)时，可以表达与野生型牛科动物的成熟肌肉生长抑制素蛋白相同的SEQ ID NO：34的成熟的肌肉生长抑制素蛋白。

例如，当转基因动物是猪时，可以表达与野生型猪的成熟肌肉生长抑制素蛋白相同的SEQ ID NO：35的成熟的肌肉生长抑制素蛋白。

例如，当转基因动物是小鼠时，可以表达与野生型小鼠的成熟肌肉生长抑制素蛋白相同的SEQ ID NO：36的成熟的肌肉生长抑制素蛋白。

例如，当转基因动物是人时，可以表达与野生型人的成熟肌肉生长抑制素蛋白相同的SEQ ID NO：37的成熟的肌肉生长抑制素蛋白。

[表2]

成熟的肌肉生长抑制素蛋白可在血液中具有单体或二聚体形式。本申请的转基因动物可以表达与野生型相同的成熟肌肉生长抑制素蛋白。也就是说，本申请的转基因动物的成熟的肌肉生长抑制素蛋白具有与野生型动物的成熟肌肉生长抑制素蛋白相同的氨基酸序列。

在本申请的一个实施方式中，转基因动物的成熟肌肉生长抑制素蛋白可以通过质谱法与野生型成熟肌肉生长抑制素蛋白进行比较和鉴别。

在本申请的一个实施方式中，本申请的转基因动物中成熟肌肉生长抑制素蛋白的表达水平可低于野生型动物的表达水平。该结果还可以从如下的事实中看出：本申请的转基因动物中的肌肉生长抑制素mRNA表达量与野生型中的肌肉生长抑制素mRNA表达量相比减少(见图14)。

与野生型动物相比，由于肌肉生长抑制素mRNA和成熟肌肉生长抑制素蛋白的表达减少，本公开的转基因动物表现出肌化表型。肌化表型是指例如肌肉质量增加、肌细胞数量增加、肌细胞大小增加和肌细胞分化率增加等表型。

在具体实施方式中，与野生型动物相比，本公开的转基因动物可具有肌肉质量的至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％的增加。

已知常规肌肉生长抑制素转基因动物与寿命缩短和健康异常有关。

与常规肌肉生长抑制素转基因动物不同，本申请的转基因动物并不是不表达肌肉生长抑制素mRNA和成熟肌肉生长抑制素蛋白。换句话说，与不是不表达肌肉生长抑制素mRNA和成熟肌肉生长抑制素蛋白的野生型动物相比，肌肉生长抑制素mRNA和成熟肌肉生长抑制素蛋白的表达减少。

因此，与不表达肌肉生长抑制素mRNA和成熟肌肉生长抑制素蛋白可导致的寿命缩短和健康异常不同，健康可能没有异常。

在具体实施方式中，发现具有本申请的12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因的牛科动物(牛)是健康的并且没有健康异常。

在一个实施方式中，具有本申请的12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因的牛可以通过生殖繁殖后代。

本申请的另一个方面是具有经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的经工程化的细胞。

经工程化的细胞可以是胚胎细胞、体细胞或干细胞。

在某些实施方式中，细胞包括但不限于，例如，卵母细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、巨噬细胞、单核细胞、肌肉细胞和B淋巴细胞、T淋巴细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胎儿来源细胞、胎盘细胞和胚胎细胞。此外，可以使用来源于各种组织来源的成体干细胞，例如来自脂肪、子宫、骨髓、肌肉、胎盘、脐带血或皮肤(上皮)的组织来源的干细胞。非人宿主胚胎通常可以是含有2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期、32细胞期、64细胞期、流产胚胎或囊胚的胚胎。

本申请的经工程化的细胞的特征与上述转基因动物的特征1至3相同。

总之，经工程化的细胞具有其中第二外显子的12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因。

经工程化的细胞的遗传修饰是指编码肌肉生长抑制素蛋白的氨基酸序列中特定保守区的四个氨基酸序列(顺序为亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸和酪氨酸的氨基酸)的核酸序列的缺失。因此，经工程化的细胞具有其中第二外显子的12个碱基对(其是编码保守区的氨基酸序列的核酸序列)缺失的肌肉生长抑制素基因。

经工程化的细胞可具有与野生型细胞不同的肌肉生长抑制素mRNA的形态。本申请的经工程化的细胞具有12个碱基缺失的肌肉生长抑制素mRNA。

经工程化的细胞中肌肉生长抑制素mRNA的表达量低于野生型动物细胞的肌肉生长抑制素mRNA表达量。

前原肌肉生长抑制素(prepro-myostatin)蛋白必须经过切割步骤以成为活性状态的成熟肌肉生长抑制素蛋白。

由于在发生切割的区域中不包括转基因细胞中缺失的4个氨基酸的位置，因此原肌肉生长抑制素蛋白通过正常的信号传导过程成为成熟肌肉生长抑制素蛋白。也就是说，本申请中特定氨基酸的缺失不影响正常成熟肌肉生长抑制素蛋白的形成过程。

也就是说，由本申请的肌肉生长抑制素基因的12个碱基对缺失的经工程化的细胞表达的成熟的肌肉生长抑制素蛋白具有与野生型细胞的成熟的肌肉生长抑制素蛋白相同的氨基酸序列。

根据本申请中提供的公开内容的另一个方面，提供了修饰肌肉生长抑制素基因的用于遗传操纵的组合物。

为了修饰肌肉生长抑制素基因，用于基因操纵的组合物可以包含：

向导RNA或编码所述向导RNA的DNA，所述向导RNA包含与肌肉生长抑制素基因的靶序列形成互补键的向导序列；以及

Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸序列。

靶序列是与原间隔序列互补的序列，其被组合物靶向并被包含在靶区域内。

靶序列位于肌肉生长抑制素基因的第二外显子(外显子2)中。

本申请的组合物靶向肌肉生长抑制素基因以修饰肌肉生长抑制素基因。

可以被组合物靶向的部分被称为靶区域。

靶区域位于肌肉生长抑制素基因的第二外显子(外显子2)中。

靶区域包括靶序列和原间隔序列，组合物的向导序列与之互补结合的序列被称为靶序列。

在本申请中，由于物种之间存在遗传序列差异，因此靶向编码肌肉生长抑制素蛋白的氨基酸序列的保守区的核酸作为用于遗传操纵的组合物的靶区域可能是容易的。

因此，靶序列被配置为包含编码按照物种的肌肉生长抑制素蛋白的保守氨基酸序列的序列的部分或全部，如下所述。

在下文中，详细描述了按照物种的原肌肉生长抑制素蛋白的保守氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于牛科动物与人、猪或小鼠相比描述保守氨基酸序列。具有保守氨基酸序列的动物不限于此。

以下部分提供了牛科动物、人、猪和小鼠的原肌肉生长抑制素蛋白序列的比较[表3]。每种原肌肉生长抑制素蛋白的第156至159位的氨基酸序列是保守的，并且下面的保守氨基酸序列处于亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸和酪氨酸的顺序(见下表中粗体栏)。

[表3]

本申请的原肌肉生长抑制素蛋白的特定氨基酸的缺失位置是这样的保守氨基酸序列，即肌肉生长抑制素蛋白的第156至159位氨基酸序列。

这些氨基酸序列位于小鼠中肌肉生长抑制素蛋白的第157至160位，但小鼠中的氨基酸序列与亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸和酪氨酸相同。

被本申请中的组合物靶向的区域可以包括编码保守氨基酸序列的区域的部分或全部。可以围绕包含保守区的DNA双链的一条链设计靶序列。

靶序列可包含以下序列的部分或全部：编码氨基酸序列中亮氨酸的5′-CTT-3′、5′-CTC-3′、5′-CTA-3′或5′-CTG-3′；编码氨基酸序列的色氨酸的5′-TGG-3′；编码氨基酸序列的异亮氨酸的5′-ATT-3′、5′-ATC-3′或5′-ATA-3′；编码氨基酸序列的酪氨酸的5′-TAT-3′或5′-TAC-3′；或者此类序列的互补序列的部分或全部。在本申请的一个实施方式中，靶序列可以包含SEQ ID NO：28-5′-ATATATCCACAG-3′。在本申请的另一个实施方式中，靶序列可以包含SEQ ID NO：29-5′-CTGTGGATATAT-3′。

为了设计靶序列，应考虑靶区域中的PAM序列。PAM序列可因Cas蛋白的来源而异。

PAM序列和与其相邻的序列被称为原间隔序列。除去PAM序列，原间隔序列由20个以下的碱基序列组成。原间隔序列和靶序列是互补序列。

在一个实例中，肌肉生长抑制素基因的靶序列可选自[表4]中的SEQ ID NO：38至SEQ ID NO：60。

例如，SEQ ID NO：38至SEQ ID NO：43可以是牛科动物的肌肉生长抑制素基因的靶序列。

例如，SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：45至SEQ ID NO：48可以是猪的肌肉生长抑制素基因的靶序列。

例如，SEQ ID NO：49至SEQ ID NO：55可以是人的肌肉生长抑制素基因的靶序列。

例如，SEQ ID NO：56至SEQ ID NO：60可以是小鼠的肌肉生长抑制素基因的靶序列。

[表4]

在一个实施方式中，本申请的组合物包含向导RNA或编码向导RNA的DNA，该向导RNA包含与靶序列互补的向导序列；以及CAS蛋白或编码CAS蛋白的核酸序列。

本申请的向导RNA包含与上文所述靶序列互补的向导序列。

向导RNA可包含第一序列和第二序列，所述第一序列是可以互补结合至靶序列的向导序列，所述第二序列参与通过与Cas蛋白相互作用形成复合体。

本申请的向导RNA的第一序列是与原间隔序列相同的序列，其与经设计的靶序列互补，并且是原间隔序列中由U(尿嘧啶)而不是T(胸腺嘧啶)构成的RNA序列。

在另一个方面，本申请的第一序列可以是crRNA的一部分，并且第二序列可以包含crRNA的另一部分和/或tracrRNA。例如，向导RNA可以是仅由crRNA组成的第一序列和第二序列，并且又例如，向导RNA可以是包含crRNA和tracrRNA的第一序列和第二序列。

在这种情况下，第一序列可以根据靶序列确定，并且第二序列的一部分可以根据Cas蛋白来源的微生物的类型确定。

例如，在结合至来源于酿脓链球菌的Cas蛋白的向导RNA的情况下，第一序列可以是crRNA序列的一部分，并且第二序列可以包含tracrRNA。

在一个实施方式中，在结合酿脓链球菌蛋白的向导RNA的情况下，第二序列可以包含

5′-GUUUUAGUCCCUGAAAAGGGACUAAAAUAAAGAGUUUGCGGGACUCUGCGGGGUUACA A

UCCCCUAAAACCGCUUUU-3′(SEQ ID NO：61)。

同时，本申请的向导RNA可以处于单个序列的形式，其中第一序列和第二序列连接。或者，向导RNA可以由两个单独的序列构成，所述两个单独的序列由包含第一序列的序列和包含第二序列的一部分的序列组成，它们可以分别由crRNA和tracrRNA构成。

在下文中，在表中示出了可以在本申请的一个实施方式中使用的向导序列的实例。在[表5]中列出的向导序列是可以与肌肉生长抑制素基因的靶序列互补结合的RNA序列。

表5中列出的向导序列是能够分别靶向表2中的序列的向导序列。

本申请的向导序列可以是选自SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：84的序列。

例如，SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：68是能够与牛科动物的肌肉生长抑制素基因的靶序列互补结合的向导序列。

例如，SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：72是能够与猪的肌肉生长抑制素基因的靶序列互补结合的向导序列。

例如，SEQ ID NO：73至SEQ ID NO：79是能够与人的肌肉生长抑制素基因的靶序列互补结合的向导序列。例如，SEQ ID NO：80至SEQ ID NO：84是能够与小鼠的肌肉生长抑制素基因的靶序列互补结合的向导序列。

在本公开的一个实施方式中，可以将包含上述向导序列的向导RNA和Cas蛋白的复合体(核糖核蛋白颗粒：RNP)形式注射到细胞或胚胎中。

[表5]

同时，在另一个方面，本申请可以提供编码向导RNA的DNA。在这种情况下，编码向导RNA的DNA序列是编码第一序列(向导序列)的序列，并且包括与分别由SEQ ID NO：38至SEQ ID NO：60表示的靶序列相同的DNA序列；以及编码第二序列的DNA序列。

本申请的Cas蛋白可选自于由以下所组成的组：来源于酿脓链球菌的Cas9蛋白、来源于空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的Cas9蛋白、来源于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的Cas9蛋白、来源于金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白、来源于脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的Cas9蛋白以及Cas12a(Cpf1)蛋白。在本申请中，Cas蛋白可以是野生型或其突变形式。

在本申请中，Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸可以进一步包含通常用于递送到真核细胞细胞核中的元件，例如核定位序列(NLS)。

在一个实施方式中，Cas蛋白可以是来源于酿脓链球菌的Cas9蛋白、来源于金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白或Cas12a(Cpf1)蛋白。

PAM序列可能因Cas蛋白而异。在一个实施方式中，SpCas9具有NGG的PAM序列。在一个实施方式中，SaCas9具有NNGRR或NNGRRT的PAM序列。在一个实施方式中，Cas12a(Cpf1)具有TTTN的PAM序列。N是A、T、G或C中的任何一个。R是A或G。

本申请的用于肌肉生长抑制素的基因操纵的组合物可以包含：向导RNA或编码向导RNA的核酸；以及Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸，其各自独立或在一起。

本申请的向导RNA可以以RNA或编码向导RNA的DNA的形式递送到细胞中。向导RNA可以处于独立RNA、被包含在病毒载体中的RNA或在载体中编码的形式。

本申请的Cas蛋白可以以RNA或编码RNA的DNA的形式递送到细胞中。Cas蛋白可以处于独立的RNA、被包含在病毒载体中的RNA或在载体中编码的形式。

此时，所述病毒载体可选自于由以下所组成的组：逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、痘苗病毒载体、痘病毒载体和单纯疱疹病毒载体。

在一个实施方式中，向导RNA和Cas蛋白可以被配置为包含编码各RNA的序列和启动子的质粒DNA，以及所包含编码蛋白的序列和启动子的质粒DNA的形式。

在另一个实施方式中，向导RNA和Cas蛋白可以被配置为在一个质粒DNA中包含编码RNA或蛋白的序列以及启动子的形式。

作为另一种形式，向导RNA和Cas蛋白可以被配置为处于病毒载体而不是质粒DNA的形式。

在另一个实施方式中，向导RNA和Cas蛋白可以被配置为mRNA的形式。此时，可以使用本领域已知的任何体外转录系统通过体外转录制备向导RNA。

本申请的向导RNA和Cas蛋白可以优选地被配置为核糖核蛋白(RNP)复合体的形式，其中向导RNA和Cas蛋白结合。

在另一个实施方式中，向导RNA和Cas蛋白可以被配置为不同的形式。例如，向导RNA可以被配置为独立RNA的形式，并且Cas蛋白可以被配置为包含编码该蛋白的序列和启动子的载体的形式。

此外，所述组合物可以被配置为各种形式。因此，由于本领域技术人员可以适当地使用本领域已知的方法，因而不存在限制。

本申请中提供的公开内容的另一个方面涉及生产具有肌肉生长抑制素基因的经工程化的细胞的方法，所述肌肉生长抑制素基因中，使用上述组合物使第二外显子的12个碱基对缺失。

细胞可以是胚胎细胞、体细胞或干细胞。

在某些实施方式中，细胞包括但不限于，例如，卵母细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、巨噬细胞、单核细胞、肌肉细胞和B淋巴细胞、T淋巴细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胎儿来源细胞、胎盘细胞和胚胎细胞。此外，可以使用来源于各种组织来源的成体干细胞，例如来自脂肪、子宫、骨髓、肌肉、胎盘、脐带血或皮肤(上皮)的组织来源的干细胞。非人宿主胚胎通常可以是含有2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期、32细胞期、64细胞期、流产胚胎或囊胚的胚胎。

优选地，所述细胞可以是胚胎细胞。

细胞可以来源于动物。

动物包括哺乳动物。

哺乳动物包括有蹄类动物。

有蹄类动物可包括牛科动物和猪，但不限于此。

哺乳动物包括啮齿动物。

啮齿动物可以包括小鼠，但不限于此。

本申请的生产包含经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的经工程化的细胞的方法，

可以包括使细胞与所述组合物接触。接触步骤可以在体内或体外进行。

例如但不限于，接触步骤可以通过以下来引入细胞中：瞬时转染、显微注射、转导、细胞融合、磷酸钙沉淀、脂质体介导转染、DEAE葡聚糖介导转染、聚凝胺介导转染、电穿孔、基因枪和将核酸引入细胞中的其它已知方法。

通过引入的组合物，插入缺失(indel：插入和缺失)发生在细胞的基因组中。

“插入缺失”是在DNA核苷酸序列中间插入或删除一些核苷酸的突变的通用术语。在通过组合物的向导RNA-CRISPR复合体切割和修复核酸(DNA、RNA)的过程中，可以将插入缺失引入靶序列中。

作为插入缺失的结果，本申请的经工程化的细胞具有肌肉生长抑制素基因，其中第二外显子中的12个碱基对被组合物删除。

此外，根据上文所述的生产包含经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的经工程化的细胞的方法，本申请的经工程化的细胞具有引起框内缺失的遗传修饰。

下文描述了框内缺失的影响。

框内缺失的影响

具有本申请的第二外显子的12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因的经工程化的细胞具有引起框内缺失的基因修饰。

“框内缺失”需要至少三个(通常是三个的倍数)DNA碱基的缺失以引起整个相应密码子的缺失，这可以引起所产生的蛋白中相应氨基酸的缺失。

由于本申请的特征在于肌肉生长抑制素基因的12个碱基的缺失，因此缺失的形式是框内缺失，并且不发生移码修饰。

作为框内缺失的结果，蛋白处于其中四个氨基酸缺失的蛋白的形式，并且不会发生翻译为其它氨基酸或终止密码子的改变(这可以发生在一般的移码修饰中)。也就是说，除了所述四个氨基酸外，其余的氨基酸可以通过肌肉生长抑制素基因中的转录正常地翻译为蛋白。

本申请中提供的公开内容的另一个方面涉及使用经工程化的细胞生产动物的方法。具体地，本申请涉及生产具有第二外显子的12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因的动物的方法。

在任意实施方式中，通过将具有第二外显子的12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因的胚胎细胞转移到代孕母亲中来施行生产方法，以生产具有第二外显子的12个碱基对缺失的经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的转基因动物。

在另一个实施方式中，生产方法涉及通过将组合物注射到动物组织或器官中来生产具有转基因组织或器官的动物的方法。

动物包括哺乳动物。

哺乳动物包括有蹄类动物。

有蹄类动物可包括牛科动物和猪，但不限于此。

哺乳动物包括啮齿动物。

啮齿动物可包括小鼠，但不限于此。

本申请的生产包含经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的转基因动物的方法，

在一个实施方式中，该方法可以包括将在上述步骤中产生的经工程化的细胞转移到代孕母亲，该经工程化的细胞具有经人工修饰的肌肉生长抑制素基因，其中第二外显子的12个碱基对缺失。

每个步骤的常规描述可以通过参考本领域已知的生产转基因动物的方法来理解。

在本申请中，胚胎细胞可以通过上述“生产包含经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的经工程化的细胞的方法”方法中描述的方法生产，以使细胞与组合物接触的步骤为完成。

胚胎细胞可以在体外培养过程中发育成囊胚。

通过将囊胚转移给代孕母亲，可以产生具有第二外显子12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因的动物。

在本公开的一个实施方式中，移植具有其中第二外显子的12个碱基对缺失的经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的胚胎以产生具有其中第二外显子12个碱基对缺失的经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的动物，优选具有其中第二外显子的12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因的牛科动物(牛)。

转基因动物可以是嵌合或同源转基因动物。

本申请的生产包含经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的转基因动物的方法，

对于另一个具体实例，可以包括

获得包含上文所述的经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的经工程化的体细胞；通过从动物的卵子中去除核来制备去核的卵母细胞；将经工程化的体细胞的核显微注射到去核的卵母细胞中并融合；激活融合的卵子；以及将激活的卵子转移到代孕母亲中。

每个步骤的常规描述可以通过参考使用本领域已知的常规体细胞核转移技术制备转基因动物的方法来理解。

可以通过使用SCNT(体细胞核转移)方法将具有根据上述方法的经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的体细胞或其核移植到去核的卵母细胞中来制备转基因动物。转基因动物可以是同源转基因动物。

在另一个实施方式中，作为生产同源转基因动物的方法，可以将具有其中第二外显子的12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因的第一转基因动物彼此杂交以生产同源转基因动物。

通过杂交获得的转基因动物可以包含与第一转基因动物的动物基因组中包含的肌肉生长抑制素基因的12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因相同的肌肉生长抑制素基因。

本申请的转基因动物可以是在动物的部分组织中具有其中第二外显子的12个碱基对缺失的经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的动物。

组织可以是上皮组织、结缔组织或肌肉组织，但优选地可以是包含肌肉生长抑制素基因的肌肉组织。

该方法可包括将上文所述的组合物引入动物组织的步骤。

当将组合物引入动物组织中时，可以对动物进行组织特异性工程化，以在组织内具有经修饰的肌肉生长抑制素基因。

引入可以通过注射、植入或移植进行。

引入可通过选定的给予途径进行：视网膜下、皮下、皮内、眼内、玻璃体内、瘤内、结内、髓内、肌肉内或

腹膜内。

具有其中第二外显子的12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因的动物可以用作改良品种动物。改良品种动物可以是其中肌肉生长抑制素基因的12个碱基对缺失的牛科动物、猪、小鼠或大鼠，但不限于此。改良品种动物可以是与野生型动物相比具有发达肌肉的改良品种动物。改良品种动物可以是与野生型动物相比脂肪减少的改良品种动物。

具有其中第二外显子的12个碱基对缺失的经人工修饰的肌肉生长抑制素基因的动物可以被用作疾病模型研究动物。疾病模型研究动物可以是其中肌肉生长抑制素基因的12个碱基对缺失的牛科动物、猪、小鼠或大鼠，但不限于此。疾病模型可以是包括肌肉萎缩、肌减少症和肌原纤维减少的研究，但不限于此。

具有其中第二外显子的12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因的动物可被用作抗病动物。抗病动物可以是其中肌肉生长抑制素基因的12个碱基对缺失的牛科动物、猪、小鼠或大鼠，但不限于此。该疾病可以是包括肌肉萎缩、肌减少症和肌原纤维减少的研究，但不限于此。

可以使用具有其中第二外显子的12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因的转基因动物的肉、器官、皮、毛和体液，但不限于此。转基因动物可以是其中肌肉生长抑制素基因的12个碱基对缺失的牛科动物、猪、小鼠或大鼠，但不限于此。与野生型动物相比，转基因动物可具有低脂肪含量和高肌肉含量。因此，作为动物的副产品，可以获得具有低脂肪含量和高肌肉含量的优质肉类。

本申请中提供的公开内容的另一个方面涉及本申请的用于遗传操纵的组合物的用途。

上文所述的组合物可用于增加肌肉质量的目的，但不限于此。

此时，可以向其给予该组合物的受试者可以是哺乳动物，包括灵长类动物(例如人和猴)、啮齿动物(例如小鼠和大鼠)、以及有蹄类动物(例如牛科动物、猪和马)。

本申请中提供的公开内容的另一个方面可以提供能够增加受给予的组织的肌肉的方法，所述方法包括给予本申请的用于遗传操纵的组合物的步骤。

可以向被给予所述组合物的受试者的特定身体部位给予组合物。

特定的身体部位可以在需要肌肉生长的组织周围。

特定的身体部位可以是其中肌肉在婴儿状态下未发育的组织周围。

给予可以通过注射、输注、植入或移植进行。

给予可通过选定的给予途径进行：皮下、皮内、肌肉内或腹膜内。

肌肉生长抑制素基因操纵组合物的单剂量(为达到预定期望效果的有效量)可以选自以下数值范围内的任何整数值，例如，但不限于，每千克受试者体重10

当通过本申请文件中公开的一些实施方式的方法或组合物对肌肉生长抑制素基因进行人工操纵时，可以由此获得诸如肌肉增加的效果。

在下文中，将通过实施例更详细地描述本申请。

这些实施方式仅意图更详细地解释本申请，并对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说将显而易见的是，本申请的范围不受这些实施方式的限制。

通过CHOPCHOP软件(https://chopchop.cbu.uib.no/)设计了含有与肌肉生长抑制素的12个碱基对的每条单链互补的序列的sgRNA。sgRNA包括上述互补结合序列，并且用于对于肌肉生长抑制素基因的CRISPR/SpCas9、CRISPR/SaCas9或CRISPR/Cpf1的PAM序列中。实验中使用的sgRNA被设计为包含表2中的向导序列中的至少一个。

图1示出了肌肉生长抑制素基因的原间隔序列之一。

通过图1的序列将向导RNA结合至序列的互补序列(靶序列)，可以在序列中预测向导RNA的结合序列。

[实施例2]卵母细胞的体外成熟

从当地屠宰场采集卵巢，并在两小时内运送到实验室。用18号(18-gauge)针头注射器抽吸从屠宰场转移的卵巢，以从直径为2至8mm的卵泡中获得卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complex，COC)。COC被分类为被超过三层的卵丘细胞和均匀分布的胞浆包围。在体外成熟过程中，在38.5℃下5％ CO

[实施例3]精子纯化、体外受精和胚胎体外培养

通过Percoll梯度法纯化运动的精子。通过在Percoll不连续梯度(45％至90％)下以1500rpm离心15min来过滤来自在35℃下解冻的精液中的精子。为了制作45％的Percoll溶液，向1mL的90％ Percoll中加入1mL体积的TALP。将精子团粒(pellet)以1500rpm离心5分钟，并通过加入3mL TALP洗涤两次。通过Percoll梯度法纯化的运动的精子被用于受精。在5％ CO

[实施例4]显微注射

当进行显微注射法时，将Cas9 mRNA和sgRNA分为4组，以寻找最合适的浓度。(CB；TE仅显微注射，RNA1X；Cas9 mRNA：100ng/μL，sgRNA：50ng/μL，RNA2X；Cas9 mRNA：200ng/μL，sgRNA：100ng/μL，RNA 4X；Cas9 mRNA：400ng/μL，sgRNA：200ng/μL)。体外受精18小时后，通过GeneArt Precision gRNA合成试剂盒(Thermofisher，Cat.No.A29377)合成sgRNA和Cas9mRNA(sigma-Aldrich，Cat.No.CAS9MRNA)，并用显微注射机(Eppendorf，

显微注射法在图2中示出。

在图5中，示意性地示出了通过将Cas9 mRNA和sgRNA分为四组的实验结果。

由上述结果，在RNA1X和RNA2X两者中，囊胚的比例与野生型的比例相似。当观察修饰率时，RNA2X组显示出与其它RNA1X和RNA4X组相比显著更高的修饰率。因此，确定了RNA2X的浓度是最合适的，然后用RNA2X组中使用的Cas9 mRNA:200ng/μL和sgRNA:100ng/μL的浓度进行实验。

在图3和图4中，观察到显微注射后胚胎的肌肉生长抑制素修饰。

图3显示，当通过进行T7E1测定来修饰胚胎的肌肉生长抑制素时，观察到低于530bp的另一条带，与野生型不同，与阳性对照中相同。作为以上的结果，可以确认肌肉生长抑制素基因在胚胎中被修饰。

图4是显示通过进行Sanger测序获得的胚胎的肌肉生长抑制素修饰形式的结果的视图。

从上述结果可以看出，在胚胎中，肌肉生长抑制素基因第二外显子的1个、2个、3个、10个和12个碱基对缺失，以及插入了肌肉生长抑制素基因第二外显子的一个碱基对。

通过这种方式，证实了与动物不同，胚胎可以具有各种修饰形式，以及由于插入缺失而仅缺失肌肉生长抑制素基因第二外显子的12个碱基对的形式。然而，本申请的经工程化的细胞仅指具有其中第二外显子的12个碱基对缺失的肌肉生长抑制素基因的经工程化的细胞。

[实施例5]胚胎转移和妊娠诊断

将囊胚储存在补充有20％ FBS的PBS中。在第7天(发情＝第0天＝融合日)左右，通过非手术方法将囊胚通过宫颈法转移到每个代孕母亲的子宫中。在发情后50天，通过直肠触诊和超声检查代孕母亲以观察胚胎存活和妊娠情况。此后，通过直肠触诊和超声定期检查怀孕的牛。

出生后，为了确认图6中的17号牛在生长过程中的外观变化，从出生后一个月到四月龄以一个月的间隔拍摄外观变化。

从上述照片中可以看出，17号牛是肌肉生长抑制素基因第二外显子的12个碱基对缺失的牛，并且肌肉发育是可见的，3个月后有肌肉发育的更明显外观。

[实施例6]T7E1测定

使用DNA提取试剂盒(DNeasy Blood&Tissue kit，Qiagen，Cat.No.69504)提取从转基因原代细胞获得的基因组DNA。MSTN引物是由PRIMER3软件设计的。PCR条件为94℃5分钟、94℃20秒、57℃30秒、72℃35秒和72℃5分钟进行35个至40个循环。

在图7中，通过T7E1测定证实了实施例5中出生的牛中的17号牛的肌肉生长抑制素基因的12个碱基对的结果。

通过上述结果，作为T7E1测定的结果，证实了与野生型不同，17号牛具有切割条带的不同位置，并且因此，17号牛具有经修饰的肌肉生长抑制素基因。

使用

[表6]

[实施例8]MSTN脱靶效应分析

使用Cas-OFFinder软件对三头MSTN突变小牛中归因于CRISPR/Cas9的潜在脱靶效应进行扫描，该软件是搜索来源于Cas9 RNA的核酸内切酶的潜在脱靶位点的快速而多用途的算法。在本实验中使用的MSTN靶位点中，错配的数量被设置为3，并且针对牛的整个基因发现了5个碱基序列。靶向5个碱基序列中的每一个的引物被命名为SEQ ID NO：89至SEQ IDNO：100，并且通过T7E1分析证实了根据引物的位置的脱靶效应。

在图8中，作为以下潜在脱靶效应位置的引物序列，进行T7E1测定。

从结果中可以看出，与阳性对照不同，在所有5个位置都没有鉴别出截短条带以证实脱靶效应。因此，结果证实了在潜在的脱靶位置上，CRISPR/Cas9没有脱靶效应，并且在本申请的一个实施方式中使用的向导RNA和Cas9 mRNA靶标特异性地发挥作用。

[表7]

[实施例9]靶向深度测序

根据制造商的方案，首先使用KAPA HiFi HotStart DNA聚合酶(Roche，Cat.No.#KK2502)从所提取的基因组DNA中将靶位点扩增至约500bp的大小。然后将扩增子重新扩增至高达230bp的大小，然后使用TruSeq HT双索引引物对扩增子进行扩增，以将Illumina测序平台的接头和索引序列添加到每个样品中。本研究中使用的引物列于SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：102中。使用PCR纯化试剂盒(MGmed)纯化合并的PCR扩增子，并在MiniSeq(Illumina)中使用配对末端测序系统(2x150bp)进行测序。使用Cas-Analyzer量化深度测序数据中的插入缺失率。

靶向深度测序结果可以在图9至图13中得到证实。

图9示出了通过将包含本申请的经修饰的肌肉生长抑制素基因的经工程化的胚胎移植到代孕母亲中而出生的17头牛和野生型牛的靶向深度测序的结果。从这些结果可以看出，与野生型牛不同，可见6号、14号和17号牛的插入缺失率为10.45％、45.4％和99.98％。

更详细地列出图9的结果的结果可以在图10至图13中得到证实。

参考图10，证实了在野生型牛中肌肉生长抑制素基因的第二外显子的碱基对没有被修饰。灰色方框指示PAM序列。带下划线的序列是原间隔序列。在图10至图13中相同地使用灰色方框和下划线。

在图11中，证实了6号牛肌肉生长抑制素基因的第二外显子的碱基对中的12个碱基对缺失。在证实插入缺失率时，12个碱基对以10.45％缺失，并且读段(read)结果可以被证实。

在图12中，在14号牛中可以看出，确认了与图11中相同形式的肌肉生长抑制素基因的第二外显子的碱基对中的12个碱基对。14号牛的插入缺失率为45.4％。

在图13中，证实了17号牛的肌肉生长抑制素基因的第二外显子的碱基对中12个碱基对缺失。证实了17号牛的插入缺失率为99.98％。

通过上述结果，在本申请中，对诱导肌肉生长抑制素第二外显子修饰后出生的牛的靶向深度测序证实了肌肉生长抑制素第二显子的碱基没有被修饰的牛。然而，已经证实的是，在其修饰被证实的所有三头牛中，只发现第二外显子的12个碱基对缺失。

[表8]

[实施例10]原代细胞培养

用活检穿孔器获得源自牛耳皮肤的原代细胞。用无菌手术刀将从牛获得的耳壳切成小块，洗涤数次，并在38℃下，在补充有胶原酶(I型胶原酶，Gibco，Cat.No.17-017)的HANK的平衡盐溶液(Gibco，Cat.No.14175095)中培养4至18小时。过夜后，将分散的细胞在DMEM(Gibco，Cat.No.21068028)培养基中洗涤数次，并补充以10％胎牛血清(Gibco，Cat.No.GIB-11150-059)、1％青霉素/链霉素(Gibco，Cat.No.15140148)、1％非必需氨基酸(Gibco，Cat.No.11140050)和100mMβ-巯基乙醇(Sigma-aldrich，Cat.No.M3418)。

在图7中，T7E1测定是在上述实施例的过程中进行的，它是在原代细胞培养后进行的。

在图14中，在培养本申请中出生的14号和17号牛的原代细胞后，比较并图示了野生型牛与14号和17号牛中肌肉生长抑制素mRNA的表达量。

从上述结果可以看出，在14号牛和17号牛的原代细胞中的肌肉生长抑制素mRNA的表达量降低超过60％(在14号牛的情况下)和80％(在17号牛的情况下)。

因此，证实了与野生型牛相比，在本申请的肌肉生长抑制素基因的第二外显子的12个碱基对缺失的牛中的肌肉生长抑制素mRNA表达减少。

[实施例11]MSTN敲除牛的生殖系传递

1)供体管理和卵子采集(取卵(Ovum Pick Up，OPU))

将2.0mg苯甲酸雌二醇肌肉内注射到具有随机发情周期、植入有阴道内黄体酮装置(Repro360，Cue-mate)的MSTN突变供体牛中。在第4天和第5天给予供体分为每12小时四剂(57mg、57mg、43mg和43mg)的200mg FSH(Kawasaki Pharm，Antonin R-10)。在OPU之前的第7天，立即移除P4装置。

为了OPU，供体牛受牛挤压笼(cattle crush)的限制。用5mL2％利多卡因(Daihan，DAIHAN Lidocaine，韩国)进行硬膜外麻醉。卵巢通过经直肠操作固定并停留在超声装置的探头上。一名经过培训的OPU技术人员使用耦连了具有卵泡抽吸引导器(follicularaspiration guide，WTA，货号10283)的7.5MHz经直肠换能器探头的超声装置(Esaote，MyLab One)进行OPU过程。使用18G OPU螺纹针(18G OPU threaded needle，WTA，货号17927)进行卵泡穿刺，并将卵泡液收集在50mL管中。在立体显微镜下收集卵泡液中的卵母细胞并用于体外受精。将剩余的卵泡

2)精液采集

使用电刺激采精(electroejaculation)从MSTN突变公牛采集精液(每头公牛3次)。精液采集前，切割包皮，用清水清洗孔口，然后用干净的纸巾干燥，以尽量使污染最小化。使用手动控制的电刺激采精器ElectroJac6(

3)精液冷冻保存和解冻

当精液样品显示出60％以上的一般运动性时，将其用于冷冻保存。在37℃下用

4)精子运动性测定

为了分析和量化精子运动性，根据制造商的说明使用IVOS-II CASA(计算机辅助精子分析程序)系统。简言之，使用与用于IVF的相同的方案将冷冻精液解冻、孵育和纯化。然后，将3μL精子装载入精子分析室(Leja玻片)，并通过CASA进行分析。使用了来自三头不同公牛的冷冻吸管。为了排除技术误差，对每份精液进行三次分析，并使用CASA结果的平均值进行统计评价。

5)体外受精和培养

如先前所述，使用Percoll梯度法选择运动精子。简言之，通过在Percoll不连续梯度(45％至90％)下以1680rpm离心15分钟来过滤35℃下的来自F0公牛的冻融精液。为了产生45％ Percoll溶液，向1mL的90％ Percoll中加入1mL的精子获能-Tyrode白蛋白乳酸盐丙酮酸盐(Tyrode's albumin lactate pyruvate，TALP)培养基。将精子团粒用3mL容量化(volumetric)-TALP培养基洗涤两次，并以1680rpm离心5分钟。将清洗过的运动的精子用于IVF。将精子(1×10

1)MSTN突变母牛的生殖系传递

在进行OPU后，采集了共45个卵母细胞(n＝3)。用野生型冻融精液进行体外受精后，培养了45个卵母细胞，形成5个囊胚(12.5±10.9％)(图15A)。将选定的囊胚转移到5个受体。通过直肠触诊和超声在一个受体中确认了妊娠(图15B)。此外，通过培养在OPU期间获得的卵泡液证实了MSTN突变(图16)。T7E1测定和Sanger测序证实了在剩余胚胎和卵泡液来源的细胞两者中与在F0雌性中相同的突变(图17和图18)。这些结果证明使用OPU程序，MSTN突变牛中成功生殖系传递。

图15示出了MSTN突变雌性的生殖系传递结果，显示了来源于MSTN突变牛卵母细胞的MSTN突变囊胚的产生(A)，以及在第30天使用超声机进行妊娠诊断的代表性照片(B)。

图16是源自通过OPU过程获得的卵泡液的体细胞图像((a)：MSTN突变雌性，(b)：野生型)。

图17示出了MSTN突变雌性囊胚的T7E1测定结果(a)和测序数据(b)(M：标记物；WT：野生型；1：MSTN突变雌性；N：阴性对照组；P：T7E1阳性对照组)。

图18示出了T7E1测定的结果(a)以及来自卵泡液的体细胞的测序数据(b)(1：MSTN突变雌性(无野生型)；2：MSTN突变雌性(无野生型))。

2)MSTN突变雄性的生殖系传递

通过电刺激采精从具有10.5％突变的雄性公牛(F0)中采集精液。将样品冷冻用于体外受精，并解冻用于精子运动性。在F0和野生型样品之间，CASA显示出前向细胞(％)、VCL、ALH和BCF方面的显著差异。然而，在F0和野生型样品之间，LIN和STR没有显示出显著差异(图19)。此外，当精液样品用于体外受精时，没有显示出对胚胎发育和能力的有害影响。将从屠宰场采集的卵母细胞用冻融的精液受精，并培养以形成囊胚。使用了总共335个卵母细胞(重复次数＝3)。其中，切割了261个卵母细胞(78.9±10.8％)，并形成了166个囊胚(50.5±6.8％)(图20)。总细胞数为81.3±20.6(n＝20)。在117个囊胚中分析突变，并且15个囊胚显示MSTN突变(12.7±3.1％)(图21)。

图19示出了通过计算机辅助精液分析对来自MSTN雄性首建者的精液的总结。

图20示出了代表性囊胚(用MSTN突变公牛精液受精的体外产生的囊胚)的照片，作为从MSTN突变公牛的生殖系传递的验证结果。

图21示出了源于体外受精的MSTN突变公牛精液的囊胚中MSTN基因的突变率(1至6：随机选择的囊胚)。上子图(a)示出了T7E1结果，并且下子图(b)示出了MSTN靶位点的测序结果。

<110>    LART生物有限公司（LART BIO）

<120>    具有经修饰的肌肉生长抑制素基因的转基因动物

<130>    CP20-156

<160>    104

<170>    KoPatentIn 3.0

<210>    1

<211>    60

<212>    DNA

<213>    人工序列

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<223>    人工序列（原间隔序列）

<400>    1

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<223>    人工序列（原间隔序列）

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<212>    DNA

<213>    人工序列

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<223>    人工序列（原间隔序列）

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<212>    DNA

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<223>    人工序列（原间隔序列）

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<212>    DNA

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<223>    人工序列（原间隔序列）

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aaactagtaa aggcccaact gaggcctgtc aagac                                 35

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<212>    DNA

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<223>    人工序列（原间隔序列）

<400>    8

aaactagtaa aggcccaact gtggatatat tctgaggcct gtcaagac                   48

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<212>    DNA

<213>    人工序列

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<223>    人工序列

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cccaactgtg gatatatctg agg                                              23

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<213>    人工序列

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<223>    人工序列

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<223>    人工序列

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<212>    DNA

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<223>    人工序列

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<223>    人工序列

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<223>    人工序列

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<210>    26

<211>    108

<212>    DNA

<213>    人工序列

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<223>    人工序列

<400>    26

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<212>    DNA

<213>    人工序列

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<223>    人工序列

<400>    27

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<211>    12

<212>    DNA

<213>    人工序列

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<223>    靶序列

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atatatccac ag                                                          12

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<211>    12

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    29

ctgtggatat at                                                          12

<210>    30

<211>    371

<212>    PRT

<213>    人工序列

<220>

<223>    原肌肉生长抑制素蛋白

<400>    30

Met Gln Lys Leu Gln Ile Ser Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile

1               5                   10                  15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn

            20                  25                  30

Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Leu Trp Arg Glu Asn Thr

        35                  40                  45

Thr Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu

    50                  55                  60

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu

65                  70                  75                  80

Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Leu Glu Leu Ile Asp Gln Phe Asp Val

                85                  90                  95

Gln Arg Asp Ala Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His

            100                 105                 110

Ala Arg Thr Glu Thr Val Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu

        115                 120                 125

Thr Gln Val Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser

    130                 135                 140

Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Leu Val Lys Ala Gln Leu Arg Pro Val Lys

145                 150                 155                 160

Thr Pro Ala Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu Ile Lys Pro Met

                165                 170                 175

Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu Lys Leu Asp Met

            180                 185                 190

Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys Thr Val Leu

        195                 200                 205

Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly Ile Glu Ile Lys

    210                 215                 220

Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Glu Pro

225                 230                 235                 240

Gly Glu Asp Gly Leu Thr Pro Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp Thr

                245                 250                 255

Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser

            260                 265                 270

Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala

        275                 280                 285

Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr

    290                 295                 300

Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr

305                 310                 315                 320

His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys

                325                 330                 335

Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Glu

            340                 345                 350

Gly Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys

        355                 360                 365

Gly Cys Ser

    370

<210>    31

<211>    371

<212>    PRT

<213>    人工序列

<220>

<223>    原肌肉生长抑制素蛋白

<400>    31

Met Gln Lys Leu Gln Ile Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile

1               5                   10                  15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn

            20                  25                  30

Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Met Trp Arg Gln Asn Thr

        35                  40                  45

Lys Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu

    50                  55                  60

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu

65                  70                  75                  80

Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val

                85                  90                  95

Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His

            100                 105                 110

Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu

        115                 120                 125

Met Gln Val Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser

    130                 135                 140

Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Arg Pro Val Lys

145                 150                 155                 160

Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu Ile Lys Pro Met

                165                 170                 175

Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu Lys Leu Asp Met

            180                 185                 190

Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys Thr Val Leu

        195                 200                 205

Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly Ile Glu Ile Lys

    210                 215                 220

Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro

225                 230                 235                 240

Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp Thr

                245                 250                 255

Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser

            260                 265                 270

Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala

        275                 280                 285

Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr

    290                 295                 300

Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr

305                 310                 315                 320

His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys

                325                 330                 335

Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys

            340                 345                 350

Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys

        355                 360                 365

Gly Cys Ser

    370

<210>    32

<211>    372

<212>    PRT

<213>    人工序列

<220>

<223>    原肌肉生长抑制素蛋白

<400>    32

Met Met Gln Lys Leu Gln Met Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu

1               5                   10                  15

Ile Ala Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Gly Ser Glu Arg Glu Glu

            20                  25                  30

Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn

        35                  40                  45

Thr Arg Tyr Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys

    50                  55                  60

Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln

65                  70                  75                  80

Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp

                85                  90                  95

Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr

            100                 105                 110

His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe

        115                 120                 125

Leu Met Gln Ala Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser

    130                 135                 140

Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Arg Pro Val

145                 150                 155                 160

Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu Ile Lys Pro

                165                 170                 175

Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu Lys Leu Asp

            180                 185                 190

Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys Thr Val

        195                 200                 205

Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly Ile Glu Ile

    210                 215                 220

Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly

225                 230                 235                 240

Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp

                245                 250                 255

Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His

            260                 265                 270

Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu

        275                 280                 285

Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Gly Tyr Lys Ala Asn

    290                 295                 300

Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His

305                 310                 315                 320

Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys

                325                 330                 335

Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly

            340                 345                 350

Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg

        355                 360                 365

Cys Gly Cys Ser

    370

<210>    33

<211>    371

<212>    PRT

<213>    人工序列

<220>

<223>    原肌肉生长抑制素蛋白

<400>    33

Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile

1               5                   10                  15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn

            20                  25                  30

Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr

        35                  40                  45

Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu

    50                  55                  60

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu

65                  70                  75                  80

Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val

                85                  90                  95

Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His

            100                 105                 110

Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu

        115                 120                 125

Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser

    130                 135                 140

Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Arg Pro Val Glu

145                 150                 155                 160

Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu Ile Lys Pro Met

                165                 170                 175

Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu Lys Leu Asp Met

            180                 185                 190

Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys Thr Val Leu

        195                 200                 205

Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly Ile Glu Ile Lys

    210                 215                 220

Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly Pro

225                 230                 235                 240

Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp Thr

                245                 250                 255

Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser

            260                 265                 270

Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala

        275                 280                 285

Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr

    290                 295                 300

Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr

305                 310                 315                 320

His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys

                325                 330                 335

Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys

            340                 345                 350

Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys

        355                 360                 365

Gly Cys Ser

    370

<210>    34

<211>    108

<212>    PRT

<213>    人工序列

<220>

<223>    成熟肌肉生长抑制素蛋白

<400>    34

Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg

1               5                   10                  15

Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile

            20                  25                  30

Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe

        35                  40                  45

Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn

    50                  55                  60

Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro

65                  70                  75                  80

Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Glu Gly Gln Ile Ile Tyr Gly Lys

                85                  90                  95

Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

            100                 105

<210>    35

<211>    95

<212>    PRT

<213>    人工序列

<220>

<223>    成熟肌肉生长抑制素蛋白

<400>    35

Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp

1               5                   10                  15

Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu

            20                  25                  30

Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His

        35                  40                  45

Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys

    50                  55                  60

Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile

65                  70                  75                  80

Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

                85                  90                  95

<210>    36

<211>    95

<212>    PRT

<213>    人工序列

<220>

<223>    成熟肌肉生长抑制素蛋白

<400>    36

Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp

1               5                   10                  15

Trp Ile Ile Ala Pro Lys Gly Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu

            20                  25                  30

Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His

        35                  40                  45

Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys

    50                  55                  60

Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile

65                  70                  75                  80

Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

                85                  90                  95

<210>    37

<211>    95

<212>    PRT

<213>    人工序列

<220>

<223>    成熟肌肉生长抑制素蛋白

<400>    37

Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp

1               5                   10                  15

Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu

            20                  25                  30

Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His

        35                  40                  45

Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys

    50                  55                  60

Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile

65                  70                  75                  80

Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

                85                  90                  95

<210>    38

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    38

cggagtctat ataggtgtca                                                  20

<210>    39

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    39

ggagtctata taggtgtcaa                                                  20

<210>    40

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    40

gggttgacac ctatatagac                                                  20

<210>    41

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    41

ccggagtcta tataggtgtc                                                  20

<210>    42

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    42

tccgggttga cacctatata                                                  20

<210>    43

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    43

ctatataggt gtcaacccgg                                                  20

<210>    44

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    44

gtgtcaaccc ggaaatgatc                                                  20

<210>    45

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    45

cagagtctat ataggtgtca                                                  20

<210>    46

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    46

agagtctata taggtgtcaa                                                  20

<210>    47

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    47

ccagagtcta tataggtgtc                                                  20

<210>    48

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    48

gtgtcaaccc ggaaatgatg                                                  20

<210>    49

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    49

cagagtttat ataggtatca                                                  20

<210>    50

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    50

agagtttata taggtatcaa                                                  20

<210>    51

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    51

tacctatata aactctgggc                                                  20

<210>    52

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    52

tccgggttga tacctatata                                                  20

<210>    53

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    53

ccagagttta tataggtatc                                                  20

<210>    54

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    54

ttatataggt atcaacccgg                                                  20

<210>    55

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    55

gtatcaaccc ggaaatgatg                                                  20

<210>    56

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    56

cagactctat ataggtgtca                                                  20

<210>    57

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    57

agactctata taggtgtcaa                                                  20

<210>    58

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    58

ccagactcta tataggtgtc                                                  20

<210>    59

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    59

tctatatagg tgtcaacccg                                                  20

<210>    60

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    靶序列

<400>    60

gtgacaaccc gaaaatgatg                                                  20

<210>    61

<211>    77

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    酿脓链球菌向导RNA

<400>    61

guuuuagucc cugaaaaggg acuaaaauaa agaguuugcg ggacucugcg ggguuacaau      60

ccccuaaaac cgcuuuu                                                     77

<210>    62

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    62

gccucagaua uauccacagu                                                  20

<210>    63

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    63

ccucagauau auccacaguu                                                  20

<210>    64

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    64

cccaacugug gauauaucug                                                  20

<210>    65

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    65

ggccucagau auauccacag                                                  20

<210>    66

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    66

aggcccaacu guggauauau                                                  20

<210>    67

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    67

gauauaucca caguugggcc                                                  20

<210>    68

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    68

cacaguuggg ccuuuacuag                                                  20

<210>    69

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    69

gucucagaua uauccacagu                                                  20

<210>    70

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    70

ucucagauau auccacaguu                                                  20

<210>    71

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    71

ggucucagau auauccacag                                                  20

<210>    72

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    72

cacaguuggg ccuuuacuac                                                  20

<210>    73

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    73

gucucaaaua uauccauagu                                                  20

<210>    74

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    74

ucucaaauau auccauaguu                                                  20

<210>    75

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    75

auggauauau uugagacccg                                                  20

<210>    76

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    76

aggcccaacu auggauauau                                                  20

<210>    77

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    77

ggucucaaau auauccauag                                                  20

<210>    78

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    78

aauauaucca uaguugggcc                                                  20

<210>    79

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    79

cauaguuggg ccuuuacuac                                                  20

<210>    80

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    80

gucugagaua uauccacagu                                                  20

<210>    81

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    81

ucugagauau auccacaguu                                                  20

<210>    82

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    82

ggucugagau auauccacag                                                  20

<210>    83

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    83

agauauaucc acaguugggc                                                  20

<210>    84

<211>    20

<212>    RNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    向导序列

<400>    84

cacaguuggg cuuuuacuac                                                  20

<210>    85

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    MSTN F引物

<400>    85

aacagcgagc agaaggaaaa                                                  20

<210>    86

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    MSTN R引物

<400>    86

ccaggcgaag tttactgagg                                                  20

<210>    87

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    GAPDH F引物

<400>    87

ggcgtgaacc acgagaagta                                                  20

<210>    88

<211>    54

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    GAPDH R引物

<400>    88

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgctct gccaaatacc agtg            54

<210>    89

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    MSTN F引物

<400>    89

gaggtgttcg ttcgtttttc                                                  20

<210>    90

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    MSTN R引物

<400>    90

ctaccagttt cctgtgctta                                                  20

<210>    91

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    脱靶F引物

<400>    91

tcagcacaga aaaggtgagg                                                  20

<210>    92

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    脱靶R引物

<400>    92

gagacggaca caactgagca                                                  20

<210>    93

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    脱靶F引物

<400>    93

tgagccccta ctttgtggac                                                  20

<210>    94

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    脱靶R引物

<400>    94

gttttctggt aaggggtgca                                                  20

<210>    95

<211>    22

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    脱靶F引物

<400>    95

ttgaaaacct agtggggaaa aa                                               22

<210>    96

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    脱靶R引物

<400>    96

gcactctcaa acactgtggc                                                  20

<210>    97

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    脱靶F引物

<400>    97

tccttgcacc ttccaaaatc                                                  20

<210>    98

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    脱靶R引物

<400>    98

atctgcgtgt aactccagcc                                                  20

<210>    99

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    脱靶F引物

<400>    99

tcacccattc cagtccattt                                                  20

<210>    100

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    脱靶R引物

<400>    100

cctctaatgc cctcttgcag                                                  20

<210>    101

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    MSTN-1 F引物

<400>    101

gaggtgttcg ttcgtttttc                                                  20

<210>    102

<211>    20

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    MSTN-1 R引物

<400>    102

taagcacagg aaactggtag                                                  20

<210>    103

<211>    53

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    MSTN-2 F引物

<400>    103

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaacgcaa gtggaaggaa aac             53

<210>    104

<211>    54

<212>    DNA

<213>    人工序列

<220>

<223>    MSTN-2 R引物

<400>    104

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttgctct gccaaatacc agtg            54