一种编码基因、含有该编码基因的表达载体、该编码基因编码的蛋白及用途

摘要

本发明公开了一种编码基因、含有该编码基因的表达载体、该编码基因编码的蛋白及用途。本发明在灰毡毛忍冬中发现了一种编码基因，含有该编码基因的表达载体、该编码基因编码的蛋白可以催化Hederagenin合成CaulosideA。因此，该编码基因、含有该编码基因的表达载体及该编码基因编码的蛋白可以用于CaulosideA的合成制备，有助于提高CaulosideA的产量，经济价值较高。

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种编码基因、含有该编码基因的表达载体、该编码基因编码的蛋白及用途。

背景技术

齐墩果烷型五环三萜皂苷是灰毡毛忍冬中特有的一类化合物，其浓度在灰毡毛忍冬中高达50-200mg/g。已有的研究表明齐墩果烷型皂苷具有抗病毒、抗菌等作用。CaulosideA是其中非常重要的一种五环三萜皂苷，为常春藤皂苷元-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷结构。研究表明，CaulosideA具有抗真菌等药理活性。

CaulosideA市售价格较高，1mg CaulosideA价格高达2000-3000元不等。研究植物在合成CaulosideA过程中相关酶及其编码基因有助于提高CaulosideA的产量，经济价值较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种编码基因、含有该编码基因的表达载体、该编码基因编码的蛋白及用途。

本发明上述目的通过如下技术方案实现：

一种编码基因，其核苷酸序列如Sequence NO.1所示。

一种含有上述编码基因的表达载体。

上述表达载体用于催化Hederagenin合成CaulosideA的用途。

一种上述编码基因编码的蛋白，其氨基酸序列如Sequence NO.2所示。

上述蛋白用于催化Hederagenin和合成CaulosideA的用途。

有益效果：

本发明在灰毡毛忍冬中发现了一种编码基因，含有该编码基因的表达载体、该编码基因编码的蛋白可以催化Hederagenin合成Cauloside A。因此，该编码基因、含有该编码基因的表达载体及该编码基因编码的蛋白可以用于CaulosideA的合成制备，有助于提高CaulosideA的产量，经济价值较高。

附图说明

图1为LmAra-UGT扩增琼脂糖凝胶电泳图；其中：M为Marker(2000bp)；1为目的基因LmAra-UGT；

图2为PHB-LmAra-UGT烟草瞬时表达产物的LC/MS检测图。

具体实施方式

下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

LmAra-UGT的编码基因的核苷酸序列如Sequence NO.1，Sequence NO.1所示序列为ATGGAAGCAACTTCAAAGCCCCATGCGGTTTTTGTACCATTCCCACTATCAACCCACATAAACCCATCTCTAAAACTAGCAAAGCTCATCCACCAAAAGGGCTTCCACATAACCTTCATCACCACCGAGTCCCACCGCGACACCATACTCTCCTCTCGTGGGCCCCACGCCCTTGATGGATTACCCGACTTCCGTTTTCAAACACTCCCCATTGACGTCCCTCCGTCCAACACTCACCCGACCGAGTACTTTGGCTCCCTCCTCAAGACCCTTAGAAAGGTCTTCTTGCCCCTCTTCACTGAGCTCCTTCGTAAGCTAAACGTCGACACTTCGTCCCCAAAAGTGAGTTGTATTGTCTCGGACGGGGTGATGACGCAGTCTGTTTTGGTGGCCGAAGAGCTCGGGATCCCTGTCGTGCTCCTCTGGATATTGGGTGCGAGCGGATTTTCGAGCATTGCTCAGTATAGGGATCTTGTGCGACGATGTGTAGCTGCAGTTCAAGATGTCAATTACCAGTTGAAAGAGGATTTGGACAATACGACAGTTGATTTTTTACCAGGAAAAAAAGGCATGAGCATGAGGGAATTTCTCAATTTCTTAAGAACCGCGCATACAAGTGAATTCATAACAGAAAGTTGTGTGGGTGAAGTGGAGAGAACTTCAAAAGCATCGGCACTAATCCTCTTAACTTGCGAACACTTGGAAAGGCAAGCGATTGGTGAACTCAAAGCCAGGTTTTCCCACGTATATAGCATTGCTCCTCTACCCTTCCTCCTAAAAAATCAAGTAAAAAACGAGCAGGTTCTCACGTTAGTTGGTGATGATATATGGAAGGAAGACACCGAGTGCTCCAAATGGCTCGATTCAAAGCCACCAAAATCCGTTCTTTACATCAGTTTTGGCAGTTTTGCGGTCACAAGCCAAAAGCATTTGGTCGAATTTGCATGGGGACTTGCTAAGAGTAAGCACAACTTCATATGGATCATTAGGCCCGATATGGTTGTAGGCGAGTCGGCCATGGCTTTACCACAAGAATTTATAGAAGAAAGTAAAGAACGTGGGCTAATATTGAGTTGGTGCCAACAAGAACAAGTATTGAATCACCCTGCAGTAGGAGGGTTTCTTAGCCACTGTGGGTGGAACTCAGTACTGGAAAGCATTTCTGCAGGAGTTCCAATGATTTGTTGGCCGTTCTTCGGAGAACATGTGACAACTTGTAAAATGGTATGTAAAGAGTGGGGATTCGGTATAGAGATTGATGAGGACGTTGAGAGAGGTCAAGTGGAGAAAGTTGTTAAAGAACTACTTGAAGGAGAAACCAGTATCAAGCTACGAGAAAGGGCAAAAGAGTGGATGAAAATCGCCAAAGAAGCAGCTGATCCCAGTGGGGTATCAACGCAGAATCTGGACAAGTTAGTTAGTGAAGTGTTACTGTCGCAAAAATGTAAGAGCTAA(Sequence NO.1)。

糖基转移酶LmAra-UGT的氨基酸序列如Sequence NO.2，Sequence NO.2所示序列为：MEATSKPHAVFVPFPLSTHINPSLKLAKLIHQKGFHITFITTESHRDTILSSRGPHALDGLPDFRFQTLPIDVPPSNTHPTEYFGSLLKTLRKVFLPLFTELLRKLNVDTSSPKVSCIVSDGVMTQSVLVAEELGIPVVLLWILGASGFSSIAQYRDLVRRCVAAVQDVNYQLKEDLDNTTVDFLPGKKGMSMREFLNFLRTAHTSEFITESCVGEVERTSKASALILLTCEHLERQAIGELKARFSHVYSIAPLPFLLKNQVKNEQVLTLVGDDIWKEDTECSKWLDSKPPKSVLYISFGSFAVTSQKHLVEFAWGLAKSKHNFIWIIRPDMVVGESAMALPQEFIEESKERGLILSWCQQEQVLNHPAVGGFLSHCGWNSVLESISAGVPMICWPFFGEHVTTCKMVCKEWGFGIEIDEDVERGQVEKVVKELLEGETSIKLRERAKEWMKIAKEAADPSGVSTQNLDKLVSEVLLSQKCKS(Sequence NO.2)。

一、实验材料

1、本实验中，所用实验材料为灰毡毛忍冬，栽植于中国药科大学药用植物园内。灰毡毛忍冬幼嫩的茎叶用于DNA和RNA的提取。烟草瞬时表达所用的烟草材料，为中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室组培室培育种植。

2、实验所用的载体与菌株

(1)载体：

瞬时表达载体：pHB-eGFP

(2)菌株：

载体克隆的大肠杆菌菌株：DH5α

农杆菌菌株：GV3101

3、实验所用的标准品和主要试剂

(1)标准品

(2)生化试剂

二、实验方法

1.LmAra-UGT的克隆

1.1灰毡毛忍冬总RNA的提取及逆转录合成cDNA

根据诺唯赞生物科技股份有限公司的植物组织总RNA提取试剂盒中的说明书提取总RNA，使用Nano测定浓度及纯度，放置-80℃保存，备用。取出上述提取好的RNA溶液，按照下面的体系加入试剂。

表1-1逆转录体系

取出并放置在42℃水浴锅中，孵育2min。加入5μL的4*HifairⅡI SuperMixplus。并且按照以下温度体系，将反应产物放在PCR仪中进行逆转录反应。

表1-2逆转录体系

逆转录的产物cDNA放在-20℃冰箱中保存备用。

1.2LmAra-UGT的全长扩增

根据灰毡毛忍冬基因组中LmAra-UGT的全长CDS序列(Sequence NO.1)，设计特异性引物，引物如下表。以灰毡毛忍冬cDNA为模板扩增EVM18997的全长。

PCR扩增体系(总体系为50μL)如下：

表1-3PCR扩增体系

扩增程序为：95℃下预变性，变性时间为3min；95℃下解链15s；60℃下，退火15s；72℃下，延伸44s，35个循环；72℃下，延伸5min，4℃放置备用。往PCR扩增产物中加入10×DNALoading Buffer，使用琼脂糖凝胶电泳系统，检测扩增产物，切胶后，按照Axygen公司的DNA凝胶回收试剂盒方法进行胶回收，测回收产物的浓度及纯度，-20℃保存备用。

2.LmAra-UGT表达载体构建

按照设计引物添加的两个酶切位点，将选择的表达载体质粒进行双酶切反应。

反应体系如下：

表2-1PHB质粒酶切体系(40μL)

双酶切反应条件为37℃水浴40min。酶切后的质粒，先进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，按照Axygen公司的DNA凝胶回收试剂盒方法进行胶回收，测回收产物的浓度及纯度，放置-20℃，保存备用。

将目的基因与酶切好的质粒进行重组，重组体系(20μL)如下：

表2-2载体连接程序

重组反应条件为金属浴37℃，30min。产物4℃暂时保存，及时转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态，转化方式参考唯地生物提供的说明书步骤。转化产物涂布至含有卡那抗生素的LB固体培养基中，放置37℃培养箱中培养约16h。待长出单菌落，用枪头挑单菌落至800μL含有卡那抗生素的LB液体培养基中，放置于37℃摇床中，震荡培养约6h。待菌液浑浊后，以浑浊的菌液作为模板，进行PCR验证，反应体系(10μL)如下：

表2-3菌液PCR体系

PCR扩增的程序与上述基因克隆的程序一样。程序结束后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳跑胶检测，选择一个阳性菌液，送至金唯智公司进行测序。将测序成功的菌液，先取出600μL菌液，加入400μL 50％甘油，保菌至-80℃；另外再取出约60μL菌液至6mL含有卡那抗生素的LB液体培养基中，放置于37℃摇床中，震荡培养过夜。

按照Axygen公司的质粒提取试剂盒的说明书，将培养过夜的菌液进行质粒提取，获得的质粒PHB-LmAra-UGT，使用Nano测定其浓度与纯度，放置-20℃，保存备用。

3.烟草表达验证实验

3.1转化GV3101农杆菌

将得到的重组质粒PHB-LmRha-UGT转化农杆菌GV3101，转化方法如下：

(1)-80℃取出GV3101感受态，室温融化3-5min后，迅速放至冰上。

(2)取1-2μL质粒加入感受态细胞菌体中，轻柔混匀，冰上放置30min。

(3)液氮冷冻8min后，立即取出，放至37℃水浴中热激5min。

(4)加入800μL不含抗生素的LB培养基，28℃，200rpm，震荡活化2h。

(5)4000rpm，离心5min，去上清，留约200μL的菌液，重悬，涂布至含有卡那抗生素和利福平抗生素的平板上，28℃，培养2-3天，直到长出单菌落。挑取单菌落，小摇至浑浊，进行菌液PCR。取出少量菌液，提前99℃煮2min，以破除细胞壁，煮好的菌液为PCR模板。

经过PCR验证阳性的菌液，保存于-80℃，或者蘸取菌液，划线，培养于含有卡那和利福平抗生素的平板上。

3.2瞬时转化烟草

(1)挑取农杆菌PHB-LmAra-UGT平板上的单克隆，加入800μL含有卡那和利福平抗生素的LB液体培养基，28℃，200rpm，震荡培养2-3天，直到菌液变浑浊，接下来吸取200μL浑浊的菌液，至20mL含有卡那和利福平抗生素的LB液体培养基，28℃，200rpm，震荡培养约6h，直到OD600值达到1.0左右。将农杆菌集中至50mL离心管，4000rpm，离心10min，弃去上清，加入MES缓冲液重悬，并且调整OD600值为1.0左右(若OD600值超过1.0，则稀释至OD600值为1.0)。黑暗条件下，静置3h。

(2)选择8株生长状况健壮良好的烟草叶子，分为两组，每组4株。使用不带针头的1mL注射器，将PHB-LmRha-UGT和空白PHB农杆菌菌液注射至烟草叶背面。

(3)将注射好的烟草，室温放置于黑暗中，约3天后，取出，将Hederagenin标准品溶于1％DMSO(100μM)，使用不带针头的1mL注射器，注射至烟草叶背面。

(4)将注射好的烟草，室温放置于黑暗中，约2天后，取出，剪出注射过的烟草叶片，放置37℃烘箱中烘干，至重量不再变化。

(5)将烘干好的烟草叶片放置研钵中，使用液氮研磨成粉末，加入甲醇溶解，超声提取30min，12000rpm离心15min，吸取上清，过滤膜，LC/MS检测分析。

4.产物测定

液相色谱分析：烟草瞬时表达产物成分测定使用LC/MS联用方法，采用安捷伦1290超高效液相色谱系统，色谱柱为ZORBAX SB-C18(1.8μm，3.0×150mm)；柱温箱温度为40℃；流动相：0.1％甲酸水(A)-0.1％甲酸乙腈(B)。

流速为0.4mL/min；进样体积为3μL；后运行时间为5min。

质谱分析条件：采用安捷伦四级杆-飞行时间质谱联用仪(Agilent Q/TOF 6545A质谱仪)，设置运行参数，采用负离子模式检测样品。

设置梯度洗脱条件为：

三、实验结果

1.LmAra-UGT的克隆

将候选糖基转移酶LmAra-UGT进行克隆，该基因的序列长度大小约为1500bp。图1为扩增LmAra-UGT全长的琼脂糖凝胶电泳图。

2.烟草瞬时表达实验结果

PHB空载农杆菌液组为阴性对照，与PHB-LmAra-UGT组平行培育，收取烟草叶片，使用甲醇提取后，提取液进入LC/MS检测分析。结果如图2所示，与阴性对照相比，发现在保留时间为15.6min处，有一个明显的峰，该峰与CaulosideA的标准品峰一致。因此，我们猜测LmAra-UGT可能催化底物Hederagenin加上阿拉伯糖，生成CaulosideA。所以，我们进一步对该产物进行Q-TOF分析，发现产物产生的主要碎片离子峰为603和649(m/z)，这与标准品Cauloside A保持一致。也就是说，阴性对照组和PHB-LmAra-UGT组均给与Hederagenin，但只有PHB-LmAra-UGT组转化产生了CaulosideA，由此我们确认LmAra-UGT的确有明显的催化活性，可以催化Hederagenin生成CaulosideA，这为后续的皂苷合成途径挖掘产生重要影响，对CaulosideA的合成具有重要经济价值。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。